از بازدید شما از nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از آخرین نسخه مرورگر استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، این سایت شامل استایل‌ها یا جاوا اسکریپت نخواهد بود.
ملامین یک آلاینده غذایی شناخته شده است که ممکن است در برخی از دسته‌های غذایی، چه به صورت تصادفی و چه عمدی، وجود داشته باشد. هدف از این مطالعه، بررسی تشخیص و تعیین مقدار ملامین در شیر خشک و پودر شیر خشک نوزاد بود. در مجموع 40 نمونه غذایی موجود در بازار، شامل شیر خشک و پودر شیر خشک، از مناطق مختلف ایران مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقدار تقریبی ملامین نمونه‌ها با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-فرابنفش (HPLC-UV) تعیین شد. یک منحنی کالیبراسیون (R2 = 0.9925) برای تشخیص ملامین در محدوده 0.1 تا 1.2 میکروگرم در میلی‌لیتر رسم شد. محدودیت‌های تعیین مقدار و تشخیص به ترتیب 1 میکروگرم در میلی‌لیتر و 3 میکروگرم در میلی‌لیتر بود. ملامین در شیر خشک و پودر شیر مورد آزمایش قرار گرفت و نتایج نشان داد که میزان ملامین در نمونه‌های شیر خشک و پودر شیر به ترتیب 0.001-0.095 میلی‌گرم در کیلوگرم و 0.001-0.004 میلی‌گرم در کیلوگرم بود. این مقادیر مطابق با قوانین اتحادیه اروپا و Codex Alimentarius است. لازم به ذکر است که مصرف این فرآورده‌های شیری با محتوای ملامین کاهش یافته، خطر قابل توجهی برای سلامت مصرف‌کننده ندارد. این موضوع همچنین توسط نتایج ارزیابی ریسک پشتیبانی می‌شود.
ملامین یک ترکیب آلی با فرمول مولکولی C3H6N6 است که از سیانامید مشتق شده است. این ماده حلالیت بسیار کمی در آب دارد و تقریباً 66٪ نیتروژن دارد. ملامین یک ترکیب صنعتی پرکاربرد با طیف وسیعی از کاربردهای مشروع در تولید پلاستیک، کود و تجهیزات فرآوری مواد غذایی (از جمله بسته‌بندی مواد غذایی و ظروف آشپزخانه) است1،2. ملامین همچنین به عنوان حامل دارو برای درمان بیماری‌ها استفاده می‌شود. نسبت بالای نیتروژن در ملامین می‌تواند منجر به سوء استفاده از این ترکیب و انتقال خواص مولکول‌های پروتئین به مواد غذایی شود3،4. بنابراین، افزودن ملامین به محصولات غذایی، از جمله محصولات لبنی، محتوای نیتروژن را افزایش می‌دهد. بنابراین، به اشتباه نتیجه گرفته شد که محتوای پروتئین شیر بیشتر از مقدار واقعی آن است.
به ازای هر گرم ملامین اضافه شده، میزان پروتئین غذا 0.4٪ افزایش می‌یابد. با این حال، ملامین در آب بسیار محلول است و می‌تواند آسیب‌های جدی‌تری ایجاد کند. افزودن 1.3 گرم ملامین به محصولات مایع مانند شیر می‌تواند میزان پروتئین شیر را 30٪ افزایش دهد5،6. اگرچه ملامین برای افزایش میزان پروتئین به غذاهای حیوانی و حتی انسانی اضافه می‌شود7، کمیسیون Codex Alimentarius (CAC) و مقامات ملی، ملامین را به عنوان یک افزودنی غذایی تأیید نکرده‌اند و آن را در صورت بلع، استنشاق یا جذب از طریق پوست، خطرناک فهرست کرده‌اند. در سال 2012، آژانس بین‌المللی تحقیقات سرطان سازمان بهداشت جهانی (WHO) ملامین را به عنوان یک ماده سرطان‌زای کلاس 2B فهرست کرد زیرا ممکن است برای سلامت انسان مضر باشد8. قرار گرفتن طولانی مدت در معرض ملامین ممکن است باعث سرطان یا آسیب کلیوی شود2. ملامین موجود در غذا می‌تواند با اسید سیانوریک ترکیب شود و کریستال‌های زرد نامحلول در آب تشکیل دهد که می‌توانند باعث آسیب به بافت کلیه و مثانه و همچنین سرطان مجاری ادراری و کاهش وزن شوند9،10. این ماده می‌تواند باعث مسمومیت حاد غذایی و در غلظت‌های بالا، مرگ، به ویژه در نوزادان و کودکان خردسال شود.11 سازمان بهداشت جهانی (WHO) همچنین میزان مصرف روزانه قابل تحمل (TDI) ملامین را برای انسان بر اساس دستورالعمل‌های CAC، 0.2 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در روز تعیین کرده است.12 سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) حداکثر میزان باقی مانده ملامین را 1 میلی‌گرم بر کیلوگرم در شیر خشک نوزاد و 2.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سایر غذاها تعیین کرده است.2،7 در سپتامبر 2008، گزارش شد که چندین تولیدکننده داخلی شیر خشک نوزاد، ملامین را به شیر خشک اضافه کرده‌اند تا میزان پروتئین محصولات خود را افزایش دهند که منجر به مسمومیت با شیر خشک و ایجاد یک حادثه مسمومیت با ملامین در سراسر کشور شد که بیش از 294000 کودک را بیمار و بیش از 50000 نفر را در بیمارستان بستری کرد.13
تغذیه با شیر مادر به دلیل عوامل مختلفی مانند دشواری‌های زندگی شهری، بیماری مادر یا کودک که منجر به استفاده از شیر خشک برای تغذیه نوزادان می‌شود، همیشه امکان‌پذیر نیست. در نتیجه، کارخانه‌هایی برای تولید شیر خشک نوزادی که تا حد امکان از نظر ترکیب به شیر مادر نزدیک باشد، تأسیس شده‌اند14. شیر خشک نوزادی که در بازار فروخته می‌شود، معمولاً از شیر گاو تهیه می‌شود و معمولاً با مخلوط خاصی از چربی‌ها، پروتئین‌ها، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، مواد معدنی و سایر ترکیبات ساخته می‌شود. برای نزدیک بودن به شیر مادر، میزان پروتئین و چربی شیر خشک متفاوت است و بسته به نوع شیر، با ترکیباتی مانند ویتامین‌ها و مواد معدنی مانند آهن غنی می‌شوند15. از آنجایی که نوزادان گروه حساسی هستند و خطر مسمومیت وجود دارد، ایمنی مصرف شیر خشک برای سلامتی از اهمیت حیاتی برخوردار است. پس از مورد مسمومیت با ملامین در بین نوزادان چینی، کشورهای جهان توجه زیادی به این موضوع نشان داده‌اند و حساسیت این حوزه نیز افزایش یافته است. بنابراین، تقویت کنترل تولید شیر خشک نوزاد به منظور محافظت از سلامت نوزادان از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. روش‌های مختلفی برای تشخیص ملامین در مواد غذایی وجود دارد، از جمله کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، الکتروفورز، روش حسی، اسپکتروفتومتری و سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم آنتی‌ژن-آنتی‌بادی16. در سال 2007، سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) یک روش HPLC برای تعیین ملامین و اسید سیانوریک در مواد غذایی توسعه داده و منتشر کرد که موثرترین روش برای تعیین محتوای ملامین است17.
غلظت ملامین در شیر خشک نوزاد که با استفاده از تکنیک جدید طیف‌سنجی مادون قرمز اندازه‌گیری شد، از 0.33 تا 0.96 میلی‌گرم در کیلوگرم (میلی‌گرم در کیلوگرم) متغیر بود.18 مطالعه‌ای در سریلانکا نشان داد که سطح ملامین در پودر شیر کامل از 0.39 تا 0.84 میلی‌گرم در کیلوگرم متغیر است. علاوه بر این، نمونه‌های شیر خشک نوزاد وارداتی حاوی بالاترین سطح ملامین، به ترتیب 0.96 و 0.94 میلی‌گرم در کیلوگرم بودند. این سطوح پایین‌تر از حد مجاز (1 میلی‌گرم در کیلوگرم) هستند، اما برای ایمنی مصرف‌کننده، یک برنامه نظارتی مورد نیاز است.19
مطالعات متعددی میزان ملامین را در شیر خشک‌های ایرانی بررسی کرده‌اند. حدود ۶۵٪ از نمونه‌ها حاوی ملامین بودند که میانگین آن ۰.۷۳ میلی‌گرم بر کیلوگرم و حداکثر آن ۳.۶۳ میلی‌گرم بر کیلوگرم بود. مطالعه دیگری گزارش داد که میزان ملامین در شیر خشک‌های ایرانی از ۰.۳۵ تا ۳.۴۰ میکروگرم بر کیلوگرم متغیر بود که میانگین آن ۱.۳۸ میکروگرم بر کیلوگرم بود. به طور کلی، وجود و میزان ملامین در شیر خشک‌های ایرانی در مطالعات مختلف ارزیابی شده است و برخی از نمونه‌های حاوی ملامین از حداکثر حد تعیین شده توسط مقامات نظارتی (۲.۵ میلی‌گرم بر کیلوگرم در هر وعده غذایی) فراتر رفته‌اند.
با توجه به مصرف مستقیم و غیرمستقیم شیر خشک در صنایع غذایی و اهمیت ویژه شیر خشک در تغذیه کودکان، این مطالعه با هدف اعتبارسنجی روش تشخیص ملامین در شیر خشک و شیر خشک انجام شد. در واقع، هدف اول این مطالعه، توسعه یک روش کمی سریع، ساده و دقیق برای تشخیص تقلب ملامین در شیر خشک و شیر خشک با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و تشخیص با اشعه ماوراء بنفش (UV) بود. هدف دوم، تعیین میزان ملامین در شیر خشک و شیر خشک فروخته شده در بازار ایران بود.
ابزارهای مورد استفاده برای آنالیز ملامین بسته به محل تولید مواد غذایی متفاوت است. برای اندازه‌گیری باقیمانده ملامین در شیر و شیر خشک از یک روش آنالیز HPLC-UV حساس و قابل اعتماد استفاده شد. محصولات لبنی حاوی پروتئین‌ها و چربی‌های مختلفی هستند که ممکن است در اندازه‌گیری ملامین اختلال ایجاد کنند. بنابراین، همانطور که توسط Sun و همکارانش اشاره شده است. 22، یک استراتژی پاکسازی مناسب و مؤثر قبل از آنالیز ابزاری ضروری است. در این مطالعه، ما از فیلترهای سرنگی یکبار مصرف استفاده کردیم. در این مطالعه، ما از یک ستون C18 برای جداسازی ملامین در شیر خشک و پودر شیر استفاده کردیم. شکل 1 کروماتوگرام برای تشخیص ملامین را نشان می‌دهد. علاوه بر این، بازیابی نمونه‌های حاوی 0.1 تا 1.2 میلی‌گرم بر کیلوگرم ملامین از 95٪ تا 109٪، معادله رگرسیون y = 1.2487x - 0.005 (r = 0.9925) و مقادیر انحراف معیار نسبی (RSD) از 0.8 تا 2٪ متغیر بود. داده‌های موجود نشان می‌دهد که این روش در محدوده غلظت مورد مطالعه قابل اعتماد است (جدول 1). حد تشخیص دستگاهی (LOD) و حد تعیین مقدار (LOQ) ملامین به ترتیب 1 میکروگرم در میلی‌لیتر و 3 میکروگرم در میلی‌لیتر بود. علاوه بر این، طیف UV ملامین یک باند جذبی در 242 نانومتر نشان داد. این روش تشخیص حساس، قابل اعتماد و دقیق است. این روش می‌تواند برای تعیین معمول سطح ملامین استفاده شود.
نتایج مشابهی توسط چندین نویسنده منتشر شده است. یک روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-آرایه فوتودیود (HPLC) برای تجزیه و تحلیل ملامین در محصولات لبنی توسعه داده شد. حد پایین تعیین مقدار برای شیر خشک 340 میکروگرم در کیلوگرم و برای شیر خشک 280 میکروگرم در کیلوگرم در طول موج 240 نانومتر بود. فیلاززی و همکاران (2012) گزارش دادند که ملامین در شیر خشک با HPLC شناسایی نشد. با این حال، 8٪ از نمونه‌های شیر خشک حاوی ملامین در سطح 0.505-0.86 میلی‌گرم در کیلوگرم بودند. تیتلمیت و همکاران23 مطالعه مشابهی انجام دادند و میزان ملامین شیر خشک (تعداد نمونه: 72) را با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا-طیف‌سنجی جرمی/MS (HPLC-MS/MS) تقریباً 0.0431-0.346 میلی‌گرم در کیلوگرم تعیین کردند. در مطالعه‌ای که توسط ونکاتاسامی و همکاران انجام شد. (2010)، یک رویکرد شیمی سبز (بدون استونیتریل) و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس (RP-HPLC) برای تخمین ملامین در شیر خشک و شیر خشک نوزاد استفاده شد. محدوده غلظت نمونه از 1.0 تا 80 گرم در میلی لیتر بود و پاسخ خطی بود (r > 0.999). این روش بازیابی 97.2-101.2 را در محدوده غلظت 5-40 گرم در میلی لیتر نشان داد و تکرارپذیری کمتر از 1.0٪ انحراف معیار نسبی بود. علاوه بر این، LOD و LOQ مشاهده شده به ترتیب 0.1 گرم در میلی لیتر و 0.2 گرم در میلی لیتر بودند. Lutter و همکاران (2011) آلودگی ملامین را در شیر گاو و شیر خشک نوزاد مبتنی بر شیر با استفاده از HPLC-UV تعیین کردند. غلظت ملامین از <0.2 تا 2.52 میلی گرم در کیلوگرم متغیر بود. محدوده دینامیکی خطی روش HPLC-UV برای شیر گاو 0.05 تا 2.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم، برای شیر خشک با کسر جرمی پروتئین کمتر از 15٪ 0.13 تا 6.25 میلی‌گرم بر کیلوگرم و برای شیر خشک با کسر جرمی پروتئین 15٪ 0.25 تا 12.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم بود. نتایج LOD (و LOQ) برای شیر گاو 0.03 میلی‌گرم بر کیلوگرم (0.09 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و برای شیر خشک با پروتئین کمتر از 15٪ 0.06 میلی‌گرم بر کیلوگرم (0.18 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و برای شیر خشک با پروتئین 15٪ 0.12 میلی‌گرم بر کیلوگرم (0.36 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بود، با نسبت سیگنال به نویز 3 و 1025 به ترتیب برای LOD و LOQ. Diebes و همکاران. (2012) میزان ملامین را در نمونه‌های شیر خشک و پودر شیر با استفاده از HPLC/DMD بررسی کردند. در شیر خشک، کمترین و بیشترین میزان به ترتیب 9.49 میلی‌گرم در کیلوگرم و 258 میلی‌گرم در کیلوگرم بود. حد تشخیص (LOD) 0.05 میلی‌گرم در کیلوگرم بود.
جاوید و همکارانش گزارش دادند که باقیمانده ملامین در شیر خشک نوزاد با استفاده از طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-MIR) در محدوده 0.002 تا 2 میلی‌گرم بر کیلوگرم بود (LOD = 1 میلی‌گرم بر کیلوگرم؛ LOQ = 3.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم). رضایی و همکارانش27 یک روش HPLC-DDA (λ = 220 نانومتر) را برای تخمین ملامین پیشنهاد کردند و به LOQ 0.08 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای پودر شیر دست یافتند که کمتر از سطح به‌دست‌آمده در این مطالعه بود. سان و همکارانش یک RP-HPLC-DAD را برای تشخیص ملامین در شیر مایع با استخراج فاز جامد (SPE) توسعه دادند. آنها به ترتیب LOD و LOQ 18 و 60 میکروگرم بر کیلوگرم به دست آوردند که حساس‌تر از مطالعه فعلی است. مونتسانو و همکارانش. اثربخشی روش HPLC-DMD را برای ارزیابی محتوای ملامین در مکمل‌های پروتئینی با حد تعیین مقدار 0.05 تا 3 میلی‌گرم بر کیلوگرم تأیید کرد، که نسبت به روش مورد استفاده در این مطالعه حساسیت کمتری داشت29.
بدون شک، آزمایشگاه‌های تحلیلی با نظارت بر آلاینده‌ها در نمونه‌های مختلف، نقش مهمی در حفاظت از محیط زیست ایفا می‌کنند. با این حال، استفاده از تعداد زیادی از معرف‌ها و حلال‌ها در طول تجزیه و تحلیل ممکن است منجر به تشکیل بقایای خطرناک شود. بنابراین، شیمی تجزیه سبز (GAC) در سال 2000 برای کاهش یا حذف اثرات نامطلوب روش‌های تحلیلی بر اپراتورها و محیط زیست توسعه داده شد26. روش‌های سنتی تشخیص ملامین شامل کروماتوگرافی، الکتروفورز، الکتروفورز مویرگی و سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) برای شناسایی ملامین استفاده شده‌اند. با این حال، در میان روش‌های تشخیص متعدد، حسگرهای الکتروشیمیایی به دلیل حساسیت عالی، گزینش‌پذیری، زمان تجزیه و تحلیل سریع و ویژگی‌های کاربرپسند خود توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند30،31. فناوری نانو سبز از مسیرهای بیولوژیکی برای سنتز نانومواد استفاده می‌کند که می‌تواند تولید زباله‌های خطرناک و مصرف انرژی را کاهش دهد و در نتیجه اجرای شیوه‌های پایدار را ارتقا بخشد. به عنوان مثال، نانوکامپوزیت‌هایی که از مواد سازگار با محیط زیست ساخته شده‌اند، می‌توانند در حسگرهای زیستی برای تشخیص موادی مانند ملامین استفاده شوند32،33،34.
این مطالعه نشان می‌دهد که میکرواستخراج فاز جامد (SPME) به دلیل راندمان انرژی بالاتر و پایداری آن در مقایسه با روش‌های استخراج سنتی، به طور مؤثر مورد استفاده قرار می‌گیرد. سازگاری با محیط زیست و راندمان انرژی SPME، آن را به جایگزینی عالی برای روش‌های استخراج سنتی در شیمی تجزیه تبدیل کرده و روشی پایدارتر و کارآمدتر برای آماده‌سازی نمونه ارائه می‌دهد35.
در سال ۲۰۱۳، وو و همکارانش یک حسگر زیستی رزونانس پلاسمون سطحی (mini-SPR) بسیار حساس و گزینش‌پذیر توسعه دادند که از اتصال بین ملامین و آنتی‌بادی‌های ضد ملامین برای تشخیص سریع ملامین در شیر خشک نوزاد با استفاده از یک روش ایمونواسی استفاده می‌کند. حسگر زیستی SPR همراه با یک روش ایمونواسی (با استفاده از آلبومین سرم گاوی متصل به ملامین) یک فناوری آسان برای استفاده و کم‌هزینه با حد تشخیص تنها ۰.۰۲ میکروگرم در میلی‌لیتر-۱۳۶ است.
نصیری و عباسیان از یک حسگر قابل حمل با پتانسیل بالا در ترکیب با کامپوزیت‌های اکسید گرافن-کیتوزان (GOCS) برای تشخیص ملامین در نمونه‌های تجاری استفاده کردند37. این روش گزینش‌پذیری، دقت و پاسخ فوق‌العاده بالایی را نشان داد. حسگر GOCS حساسیت قابل توجهی (239.1 میکرومولار-1)، محدوده خطی 0.01 تا 200 میکرومولار، ثابت میل ترکیبی 1.73 × 104 و LOD تا 10 نانومولار را نشان داد. علاوه بر این، مطالعه‌ای که توسط چاندراسخار و همکارانش در سال 2024 انجام شد، یک رویکرد سازگار با محیط زیست و مقرون به صرفه را اتخاذ کرد. آنها از عصاره پوست پاپایا به عنوان یک عامل کاهنده برای سنتز نانوذرات اکسید روی (ZnO-NPs) به روشی سازگار با محیط زیست استفاده کردند. متعاقباً، یک تکنیک طیف‌سنجی میکرو رامان منحصر به فرد برای تعیین ملامین در شیر خشک نوزاد توسعه داده شد. نانوذرات اکسید روی مشتق‌شده از ضایعات کشاورزی، پتانسیل خود را به عنوان یک ابزار تشخیصی ارزشمند و یک فناوری قابل اعتماد و کم‌هزینه برای نظارت و تشخیص ملامین نشان داده‌اند.
علیزاده و همکارانش (2024) از یک پلتفرم فلورسانس چارچوب آلی-فلزی بسیار حساس (MOF) برای تعیین ملامین در پودر شیر استفاده کردند. محدوده خطی و حد تشخیص پایین حسگر، که با استفاده از 3σ/S تعیین شد، به ترتیب 40 تا 396.45 نانومولار (معادل 25 میکروگرم بر کیلوگرم تا 0.25 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و 40 نانومولار (معادل 25 میکروگرم بر کیلوگرم) بود. این محدوده بسیار پایین‌تر از حداکثر سطح باقیمانده (MRL) تعیین شده برای شناسایی ملامین در شیر خشک نوزاد (1 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و سایر نمونه‌های غذا/خوراک دام (2.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم) است. حسگر فلورسنت (terbium (Tb)@NH2-MIL-253(Al)MOF) دقت بالاتر و قابلیت اندازه‌گیری دقیق‌تری نسبت به HPLC39 در تشخیص ملامین در پودر شیر نشان داد. حسگرهای زیستی و نانوکامپوزیت‌ها در شیمی سبز نه تنها قابلیت‌های تشخیص را افزایش می‌دهند، بلکه خطرات زیست‌محیطی را نیز مطابق با اصول توسعه پایدار به حداقل می‌رسانند.
اصول شیمی سبز در روش‌های مختلفی برای تعیین ملامین به کار گرفته شده‌اند. یکی از رویکردها، توسعه یک روش میکرواستخراج فاز جامد پراکنده سبز با استفاده از پلیمر قطبی طبیعی بتا-سیکلودکسترین متصل به اسید سیتریک برای استخراج کارآمد ملامین40 از نمونه‌هایی مانند شیر خشک و آب گرم است. روش دیگر از واکنش مانیخ برای تعیین ملامین در نمونه‌های شیر استفاده می‌کند. این روش ارزان، سازگار با محیط زیست و بسیار دقیق با محدوده خطی 0.1 تا 2.5 ppm و حد تشخیص پایین41 است. علاوه بر این، یک روش مقرون به صرفه و سازگار با محیط زیست برای تعیین کمی ملامین در شیر مایع و شیر خشک با استفاده از طیف‌سنجی انتقال مادون قرمز تبدیل فوریه با دقت بالا و حد تشخیص به ترتیب 1 ppm و 3.5 ppm توسعه داده شد42. این روش‌ها کاربرد اصول شیمی سبز را در توسعه روش‌های کارآمد و پایدار برای تعیین ملامین نشان می‌دهند.
مطالعات متعددی روش‌های نوآورانه‌ای را برای تشخیص ملامین پیشنهاد کرده‌اند، مانند استفاده از استخراج فاز جامد و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)43، و همچنین کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) سریع که نیازی به پیش‌تیمار پیچیده یا معرف‌های جفت یونی ندارد و در نتیجه میزان ضایعات شیمیایی را کاهش می‌دهد44. این روش‌ها نه تنها نتایج دقیقی را برای تعیین ملامین در محصولات لبنی ارائه می‌دهند، بلکه با اصول شیمی سبز نیز مطابقت دارند و استفاده از مواد شیمیایی خطرناک را به حداقل می‌رسانند و تأثیر کلی زیست‌محیطی فرآیند تحلیلی را کاهش می‌دهند.
چهل نمونه از برندهای مختلف در سه تکرار آزمایش شدند و نتایج در جدول 2 ارائه شده است. میزان ملامین در نمونه‌های شیر خشک و پودر شیر به ترتیب از 0.001 تا 0.004 میلی‌گرم بر کیلوگرم و از 0.001 تا 0.095 میلی‌گرم بر کیلوگرم متغیر بود. هیچ تغییر معنی‌داری بین سه گروه سنی شیر خشک مشاهده نشد. علاوه بر این، ملامین در 80٪ شیر خشک‌ها شناسایی شد، اما 65٪ شیر خشک‌ها به ملامین آلوده بودند.
میزان ملامین در شیر خشک صنعتی بیشتر از شیر خشک نوزاد بود و این تفاوت معنی‌دار بود (p<0.05) (شکل 2).
نتایج به دست آمده زیر حد مجاز تعیین شده توسط FDA (زیر ۱ و ۲.۵ میلی گرم بر کیلوگرم) بود. علاوه بر این، نتایج با حد مجاز تعیین شده توسط CAC (2010) و EU45,46 مطابقت دارد، یعنی حداکثر حد مجاز برای شیر خشک نوزاد ۱ میلی گرم بر کیلوگرم و برای محصولات لبنی ۲.۵ میلی گرم بر کیلوگرم است.
طبق مطالعه‌ای که در سال ۲۰۲۳ توسط Ghanati و همکاران انجام شد، میزان ملامین در انواع مختلف شیر بسته‌بندی شده در ایران از ۵۰.۷ تا ۷۹۰ میکروگرم در کیلوگرم متغیر بود. نتایج آنها کمتر از حد مجاز FDA بود. نتایج ما کمتر از نتایج Shoder و همکاران است. ۴۸ و Rima و همکاران. ۴۹. Shoder و همکاران (۲۰۱۰) دریافتند که میزان ملامین در پودر شیر (۴۹ نفر) که توسط ELISA تعیین شده بود، از ۰.۵ تا ۵.۵ میلی‌گرم در کیلوگرم متغیر بود. Rima و همکاران باقیمانده ملامین در پودر شیر را با استفاده از اسپکتروفتومتری فلورسانس تجزیه و تحلیل کردند و دریافتند که میزان ملامین در پودر شیر ۰.۷۲ تا ۵.۷۶ میلی‌گرم در کیلوگرم است. در سال ۲۰۱۱ مطالعه‌ای در کانادا برای نظارت بر میزان ملامین در شیر خشک نوزاد (۹۴ نفر) با استفاده از کروماتوگرافی مایع (LC/MS) انجام شد. غلظت ملامین کمتر از حد قابل قبول (استاندارد اولیه: 0.5 میلی‌گرم در کیلوگرم) بود. بعید است که سطوح تقلبی ملامین شناسایی شده، تاکتیکی برای افزایش محتوای پروتئین بوده باشد. با این حال، نمی‌توان آن را با استفاده از کودها، جابجایی محتویات ظرف یا عوامل مشابه توضیح داد. علاوه بر این، منبع ملامین در پودر شیر وارداتی به کانادا فاش نشده است50.
حسنی و همکارانش در سال ۲۰۱۳ میزان ملامین موجود در شیر خشک و شیر مایع موجود در بازار ایران را اندازه‌گیری کردند و به نتایج مشابهی دست یافتند. نتایج نشان داد که به جز یک برند شیر خشک و شیر مایع، تمام نمونه‌های دیگر به ملامین آلوده بودند و میزان آن در شیر خشک از ۱.۵۰ تا ۳۰.۳۲ میکروگرم در گرم و در شیر از ۰.۱۱ تا ۱.۴۸ میکروگرم در میلی‌لیتر متغیر بود. نکته قابل توجه این است که اسید سیانوریک در هیچ یک از نمونه‌ها مشاهده نشد و این امر احتمال مسمومیت با ملامین را برای مصرف‌کنندگان کاهش می‌دهد.۵۱ مطالعات قبلی غلظت ملامین را در محصولات شکلاتی حاوی شیر خشک ارزیابی کرده‌اند. حدود ۹۴٪ از نمونه‌های وارداتی و ۷۷٪ از نمونه‌های ایرانی حاوی ملامین بودند. میزان ملامین در نمونه‌های وارداتی از ۰.۰۳۲ تا ۲.۶۹۲ میلی‌گرم در کیلوگرم متغیر بود، در حالی که این میزان در نمونه‌های ایرانی از ۰.۰۱۳ تا ۲.۶۰۰ میلی‌گرم در کیلوگرم متغیر بود. در مجموع، ملامین در 85٪ نمونه‌ها شناسایی شد، اما فقط یک برند خاص سطوحی بالاتر از حد مجاز داشت.44 تیتلمیر و همکارانش سطوح ملامین را در پودر شیر از 0.00528 تا 0.0122 میلی‌گرم بر کیلوگرم گزارش کردند.
جدول 3 نتایج ارزیابی ریسک را برای سه گروه سنی خلاصه می‌کند. ریسک در تمام گروه‌های سنی کمتر از 1 بود. بنابراین، هیچ ریسک غیرسرطان‌زایی برای سلامتی از ملامین در شیر خشک نوزاد وجود ندارد.
سطوح پایین‌تر آلودگی در محصولات لبنی ممکن است به دلیل آلودگی غیرعمدی در طول آماده‌سازی باشد، در حالی که سطوح بالاتر ممکن است به دلیل افزودن عمدی باشد. علاوه بر این، خطر کلی برای سلامت انسان از مصرف محصولات لبنی با سطوح پایین ملامین کم در نظر گرفته می‌شود. می‌توان نتیجه گرفت که مصرف محصولات حاوی چنین سطوح پایینی از ملامین هیچ خطری برای سلامت مصرف‌کننده ندارد52.
با توجه به اهمیت مدیریت ایمنی مواد غذایی در صنعت لبنیات، به ویژه از نظر حفاظت از سلامت عمومی، توسعه و اعتبارسنجی روشی برای ارزیابی و مقایسه میزان و باقیمانده ملامین در شیر خشک و شیر خشک از اهمیت بالایی برخوردار است. یک روش اسپکتروفتومتری HPLC-UV ساده و دقیق برای تعیین ملامین در شیر خشک و شیر خشک توسعه داده شد. این روش برای اطمینان از قابلیت اطمینان و دقت آن اعتبارسنجی شد. محدودیت‌های تشخیص و تعیین مقدار این روش به اندازه کافی حساس بود تا بتواند میزان ملامین را در شیر خشک و شیر خشک اندازه‌گیری کند. طبق داده‌های ما، ملامین در بیشتر نمونه‌های ایرانی شناسایی شد. تمام سطوح ملامین شناسایی شده کمتر از حداکثر حد مجاز تعیین شده توسط CAC بود، که نشان می‌دهد مصرف این نوع محصولات لبنی خطری برای سلامت انسان ندارد.
تمام واکنشگرهای شیمیایی مورد استفاده دارای درجه خلوص تحلیلی بودند: ملامین (۲،۴،۶-تری آمینو-۱،۳،۵-تریازین) با خلوص ۹۹٪ (سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، میسوری)؛ استونیتریل با درجه HPLC (مرک، دارمشتات، آلمان)؛ آب فوق خالص (میلی‌پور، مورفهایم، فرانسه). فیلترهای سرنگی یکبار مصرف (Chromafil Xtra PVDF-45/25، اندازه منافذ ۰.۴۵ میکرومتر، قطر غشاء ۲۵ میلی‌متر) (ماشری-ناگل، دورن، آلمان).
برای آماده‌سازی نمونه‌ها از حمام اولتراسونیک (Elma، آلمان)، سانتریفیوژ (Beckman Coulter، Krefeld، آلمان) و HPLC (KNAUER، آلمان) استفاده شد.
یک دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (KNAUER، آلمان) مجهز به آشکارساز UV استفاده شد. شرایط آنالیز HPLC به شرح زیر بود: از یک سیستم UHPLC Ultimate مجهز به ستون تحلیلی ODS-3 C18 (4.6 mm × 250 mm، اندازه ذرات 5 میکرومتر) (MZ، آلمان) استفاده شد. شوینده HPLC (فاز متحرک) مخلوط TFA/متانول (450:50 میلی‌لیتر) با سرعت جریان 1 میلی‌لیتر در دقیقه بود. طول موج تشخیص 242 نانومتر بود. حجم تزریق 100 میکرولیتر و دمای ستون 20 درجه سانتیگراد بود. از آنجایی که زمان ماندگاری دارو طولانی است (15 دقیقه)، تزریق بعدی باید پس از 25 دقیقه انجام شود. ملامین با مقایسه زمان ماندگاری و پیک طیف UV استانداردهای ملامین شناسایی شد.
یک محلول استاندارد ملامین (10 میکروگرم بر میلی‌لیتر) با استفاده از آب تهیه و در یخچال (4 درجه سانتیگراد) و دور از نور نگهداری شد. محلول ذخیره را با فاز متحرک رقیق کرده و محلول‌های استاندارد کاری را تهیه کنید. هر محلول استاندارد 7 بار به HPLC تزریق شد. معادله کالیبراسیون 10 با تجزیه و تحلیل رگرسیون مساحت پیک تعیین شده و غلظت تعیین شده محاسبه شد.
پودر شیر گاو موجود در بازار (20 نمونه) و نمونه‌هایی از برندهای مختلف شیر خشک بر پایه شیر گاو (20 نمونه) از سوپرمارکت‌ها و داروخانه‌های محلی در ایران برای تغذیه نوزادان گروه‌های سنی مختلف (0 تا 6 ماه، 6 تا 12 ماه و >12 ماه) خریداری و تا زمان تجزیه و تحلیل در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شدند. سپس، 1 ± 0.01 گرم پودر شیر همگن وزن شده و با استونیتریل:آب (50:50، حجمی/حجمی؛ 5 میلی‌لیتر) مخلوط شد. مخلوط به مدت 1 دقیقه هم زده شد، سپس به مدت 30 دقیقه در حمام اولتراسونیک سونیکاسیون شد و در نهایت به مدت 1 دقیقه تکان داده شد. سپس مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با سرعت 9000 × g سانتریفیوژ شد و محلول رویی با استفاده از فیلتر سرنگی 0.45 میکرومتر به یک ویال نمونه‌بردار خودکار 2 میلی‌لیتری فیلتر شد. سپس محلول صاف شده (250 میکرولیتر) با آب (750 میکرولیتر) مخلوط و به سیستم HPLC تزریق شد.
برای اعتبارسنجی روش، بازیابی، دقت، حد تشخیص (LOD)، حد تعیین مقدار (LOQ) و دقت تحت شرایط بهینه را تعیین کردیم. LOD به عنوان محتوای نمونه با ارتفاع پیک سه برابر سطح نویز پایه تعریف شد. از سوی دیگر، محتوای نمونه با ارتفاع پیک 10 برابر نسبت سیگنال به نویز به عنوان LOQ تعریف شد.
پاسخ دستگاه با استفاده از یک منحنی کالیبراسیون متشکل از هفت نقطه داده تعیین شد. از مقادیر مختلف ملامین (0، 0.2، 0.3، 0.5، 0.8، 1 و 1.2) استفاده شد. خطی بودن روش محاسبه ملامین تعیین شد. علاوه بر این، چندین سطح مختلف ملامین به نمونه‌های شاهد اضافه شد. منحنی کالیبراسیون با تزریق مداوم 0.1 تا 1.2 میکروگرم در میلی‌لیتر از محلول استاندارد ملامین به نمونه‌های شیر خشک و شیر خشک ساخته شد و R2 آن = 0.9925 بود. دقت با تکرارپذیری و تکرارپذیری روش ارزیابی شد و با تزریق نمونه‌ها در روز اول و سه روز بعدی (در سه تکرار) به دست آمد. تکرارپذیری روش با محاسبه RSD٪ برای سه غلظت مختلف ملامین اضافه شده ارزیابی شد. مطالعات بازیابی برای تعیین دقت انجام شد. میزان بازیابی با روش استخراج در سه سطح غلظت ملامین (0.1، 1.2، 2) در نمونه‌های شیر خشک و شیر خشک محاسبه شد9،11،15.
میزان مصرف روزانه تخمینی (EDI) با استفاده از فرمول زیر تعیین شد: EDI = Ci × Cc/BW.
که در آن Ci میانگین محتوای ملامین، Cc میزان مصرف شیر و BW میانگین وزن کودکان است.
تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه ۲۴ انجام شد. نرمال بودن داده‌ها با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف بررسی شد؛ همه داده‌ها از آزمون‌های ناپارامتری بودند (p = 0). بنابراین، از آزمون کروسکال-والیس و آزمون من-ویتنی برای تعیین تفاوت‌های معنادار بین گروه‌ها استفاده شد.
اینگلفینگر جونیور. ملامین و تأثیر آن بر آلودگی جهانی مواد غذایی. مجله پزشکی نیوانگلند 359(26)، 2745–2748 (2008).
لینچ، آر.ای، و همکاران. تأثیر pH بر مهاجرت ملامین در کاسه‌های کودکان. مجله بین‌المللی آلودگی مواد غذایی، 2، 1-8 (2015).
بارت، MP و گیلبرت، IH هدف قرار دادن ترکیبات سمی به داخل تریپانوزوم‌ها. پیشرفت در انگل‌شناسی 63، 125–183 (2006).
نیرمن، ام. اف، و همکاران. ارزیابی درون‌تنی و درون‌تنی دندریمرهای ملامین به عنوان حامل‌های دارورسانی. مجله بین‌المللی داروسازی، 281(1–2)، 129–132(2004).
سازمان بهداشت جهانی. جلسات تخصصی ۱ تا ۴ برای بررسی جنبه‌های سم‌شناسی ملامین و اسید سیانوریک (۲۰۰۸).
هاو، ای. کی.-سی.، کوان، تی. اچ. و لی، پی. کی. تی. سمیت ملامین و کلیه. مجله انجمن نفرولوژی آمریکا 20(2)، 245–250 (2009).
اوزتورک، س. و دمیر، ن. توسعه یک جاذب جدید IMAC برای شناسایی ملامین در محصولات لبنی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC). مجله سنتز و تجزیه و تحلیل مواد غذایی 100، 103931 (2021).
چانسووارن، وی.، پانیک، اس. و ایمیم، ای. تعیین ساده اسپکتروفتومتری ملامین در شیر مایع بر اساس واکنش سبز مانیخ. اسپکتروشیمی. آکتا بخش A مول. بیومول. اسپکتروسک. 113، 154–158 (2013).
دیبس، م. و الحبیب، ر. تعیین ملامین در شیر خشک نوزاد، پودر شیر و نمونه‌های پنگوسی با استفاده از کروماتوگرافی HPLC/آرایه دیودی. مجله سم‌شناسی تحلیلی محیطی، 2(137)، 2161–0525.1000137 (2012).
اسکینر، کی جی، توماس، جی دی، و اوسترلو، جی دی، سمیت ملامین. مجله سم شناسی پزشکی، 6، 50-55 (2010).
سازمان بهداشت جهانی (WHO)، جنبه‌های سم‌شناسی و سلامت ملامین و اسید سیانوریک: گزارش جلسه مشترک کارشناسان WHO/FAO با حمایت بهداشت کانادا، اتاوا، کانادا، ۱-۴ دسامبر ۲۰۰۸ (۲۰۰۹).
کورما، اس. ای. و همکاران. مطالعه تطبیقی ​​ترکیب لیپید و کیفیت پودر شیر خشک نوزاد حاوی لیپیدهای ساختاری کاربردی جدید و شیر خشک نوزاد تجاری. European Food Research and Technology 246, 2569–2586 (2020).
ال-واصیف، م. و هاشم، ح. افزایش ارزش غذایی، ویژگی‌های کیفی و ماندگاری شیر خشک نوزاد با استفاده از روغن پالم. مجله تحقیقات کشاورزی خاورمیانه 6، 274-281 (2017).
یین، دبلیو. و همکاران. تولید آنتی‌بادی‌های مونوکلونال علیه ملامین و توسعه یک روش ELISA رقابتی غیرمستقیم برای تشخیص ملامین در شیر خام، شیر خشک و خوراک دام. مجله شیمی کشاورزی و مواد غذایی 58(14)، 8152–8157 (2010).