آدرس فعلی: OX11 0DE، انگلستان، ساختمان دایموند، پارک علم و نوآوری هارول، دیتکوت، آکسفوردشایر، انگلستان، شرکت دایموند لایت سورس، مرکز تصویربرداری بیولوژیکی الکترونیکی.
کمپلکس برداشت نور مرکز واکنش ۱ (RC-LH1) جزء اصلی فتوسنتزی باکتری‌های فتوتروفیک بنفش است. ما دو ساختار میکروسکوپی کرایو-الکترون از کمپلکس RC-LH1 از Rhodopseudomonas palustris را معرفی کردیم. ساختار با وضوح ۲.۶۵ آنگستروم کمپلکس RC-LH114-W شامل ۱۴ حلقه زیر واحد LH1 است که RC را احاطه کرده‌اند، که توسط پروتئین W قطع شده است، در حالی که کمپلکس بدون پروتئین W کاملاً از ترکیب RC احاطه شده است. حلقه LH1 با ۱۶ زیر واحد بسته. مقایسه این ساختارها، بینش‌هایی در مورد دینامیک کینون در کمپلکس RC-LH1، از جمله تغییرات ساختاری قبلاً نامشخص هنگام اتصال کینون در محل QB RC، و همچنین محل جایگاه‌های اتصال کینون کمکی، که به انتقال آنها به RC کمک می‌کنند، ارائه می‌دهد. ساختار منحصر به فرد پروتئین W از بسته شدن حلقه LH1 جلوگیری می‌کند و در نتیجه کانالی برای تسریع تبادل کینون/کینولون ایجاد می‌کند.
انرژی حاصل از فتوسنتز می‌تواند تقریباً تمام حیات روی زمین را حفظ کند و پتانسیل بالایی برای بیوتکنولوژی خورشیدی دارد. باکتری‌های فتوتروفیک بنفش ضمن ترویج فتوسنتز جهانی، حالت‌های مختلف انرژی و قابلیت‌های متابولیکی را نیز نشان می‌دهند. آن‌ها می‌توانند از فتوسنتز اجتناب کنند و به عنوان باکتری‌های هتروتروف در تاریکی رشد کنند، می‌توانند نیتروژن و دی اکسید کربن را تثبیت کنند، هیدروژن تولید کنند و ترکیبات آروماتیک را تجزیه کنند (1-3). برای تأمین انرژی برای این فرآیندها، نور باید به سرعت و به طور مؤثر به انرژی شیمیایی تبدیل شود. این فرآیند زمانی شروع می‌شود که کمپلکس آنتن به دام اندازنده نور، نور را جذب کرده و انرژی به دام افتاده را به مرکز واکنش (RC) منتقل می‌کند و در نتیجه جداسازی بار آغاز می‌شود (4-7). واحد اساسی فتوسنتز در باکتری‌های فتوتروفیک بنفش از RC نوع 2 تشکیل شده است که توسط کمپلکس برداشت نور 1 (LH1) احاطه شده و کمپلکس هسته RC-LH1 را تشکیل می‌دهد. LH1 توسط آرایه‌ای از هترودایمرهای αβ منحنی شکل تشکیل می‌شود که هر کدام به دو مولکول کلروفیل باکتریایی (BChl) a و یک یا دو کاروتنوئید متصل می‌شوند (8-12). ساده‌ترین آنتن LH1 شامل 16 یا 17 هترودایمر αβ است که RC (9-13) را در یک حلقه بسته احاطه کرده‌اند، اما در سایر کمپلکس‌های هسته، پپتیدهای غشایی، پیوستگی LH1 اطراف را قطع می‌کنند و در نتیجه انتشار کینول/کینون بین RC و کمپلکس سیتوکروم bc1 را افزایش می‌دهند (11، 13-15). گیاه بنفش فتوتروفیک رودوپسودوموناس (Rps.) یک ارگانیسم مدل است که می‌تواند انتقال انرژی و الکترون را که از فتوسنتز پشتیبانی می‌کند، درک کند. اولین ساختار کریستالی Rps. مدل کمپلکس RC-LH1 پالوستریس، RC است که توسط 15 حلقه هترودایمر LH1 احاطه شده است که توسط یک پروتئین ناشناخته به نام "پروتئین W" قطع می‌شوند (14). پروتئین-W متعاقباً به عنوان RPA4402 شناسایی شد که یک پروتئین 10.5 کیلو دالتونی ناشناخته با سه مارپیچ غشایی پیش‌بینی شده (TMH) است (16). ما پیشنهاد می‌کنیم که ژن rpa4402 که پروتئین W را کد می‌کند، به pufW تغییر نام داده شود تا با نامگذاری مورد استفاده برای ژن‌های کدکننده زیرواحدهای RC-L، M (pufL، pufM) و LH1α، β (pufA، pufB) سازگار باشد. جالب توجه است که پروتئین W فقط در حدود 10٪ از RC-LH1 وجود دارد، که نشان می‌دهد Rps. palustris دو کمپلکس RC-LH1 مختلف تولید می‌کند. در اینجا، ما ساختارهای cryo-EM با وضوح بالا (cryo-EM) دو کمپلکس اصلی، یکی با پروتئین W و 14 هترودایمر αβ، دیگری بدون پروتئین W و یک حلقه بسته 16 هترودایمر LH1 را گزارش می‌کنیم. ساختار ما نشان‌دهنده یک تغییر اساسی در درک کمپلکس RC-LH1 از Rps. palustris است، زیرا ما جمعیت همگن هر نوع را تجزیه و تحلیل کرده‌ایم و وضوح کافی برای تعیین واضح هر پپتید و رنگدانه‌های متصل و لیپیدها و کینون‌های مرتبط را داریم. مقایسه این ساختارها نشان می‌دهد که سه پروتئین TMH-W که تاکنون در هیچ کمپلکس RC-LH1 دیگری یافت نشده‌اند، یک کانال کینون برای تسریع تبادل کینون/کینولون ایجاد می‌کنند. تعدادی از جایگاه‌های اتصال لیپید و کینون حفاظت‌شده شناسایی شده‌اند و ما یک تغییر ساختاری جدید را پس از ترکیب کینون و RC آشکار کرده‌ایم که ممکن است برای RC فتوسیستم II (PSII) موجودات فتوتروفیک اکسیژن‌دار مناسب باشد. یافته‌های ما بینش‌های جدیدی در مورد سینتیک اتصال و تبادل کینون/کینولون در کمپلکس هسته RC-LH1 باکتری‌های فتوتروفیک بنفش ارائه می‌دهد.
به منظور تسهیل مطالعه دقیق دو کمپلکس یافت شده در Rps. palustris، ما هر RC-LH1 را با روش‌های بیوشیمیایی جداسازی می‌کنیم. کمپلکس فاقد پروتئین W (که از این پس ΔpufW نامیده می‌شود) از سویه فاقد ژن pufW خالص‌سازی شد (16) و تنها یک کمپلکس RC-LH1 می‌تواند تولید شود. کمپلکس حاوی پروتئین W توسط یک سویه تولید می‌شود. پروتئین W این سویه با یک برچسب His 10x در انتهای C آن اصلاح می‌شود، به طوری که کمپلکس حاوی پروتئین W می‌تواند به طور مؤثر با اکثر پروتئین‌های W فاقد آن با بی‌حرکت کردن فلز ترکیب شود. این کمپلکس به طور مؤثر جداسازی می‌شود (16) کروماتوگرافی میل ترکیبی (IMAC).
همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، هر دو کمپلکس حاوی یک زیر واحد RC (RC-L، RC-M و ​​RC-H) هستند که توسط یک آنتن LH1 احاطه شده است. ساختار 2.80-A کمپلکس فاقد پروتئین-W، 16 هترودایمر αβ را نشان می‌دهد که یک حلقه بسته LH1 را کاملاً در اطراف RC تشکیل می‌دهند که از این پس به عنوان کمپلکس RC-LH116 نامیده می‌شود. ساختار 2.65Å کمپلکس حاوی پروتئین-W دارای یک هترودایمر 14-LH1 است که توسط پروتئین-W قطع شده است و از این پس به عنوان RC-LH114-W نامیده می‌شود.
(A و B) نمایش سطحی ترکیب. (C و D) رنگدانه‌های پیوندی که به صورت میله‌ای بیان شده‌اند. (E و F) کمپلکس‌های مشاهده شده از سطح سیتوپلاسمی دارای پپتیدها و زیرواحدهای LH1 هستند که به صورت کارتونی نمایش داده شده‌اند و از شکاف پروتئین-W در جهت عقربه‌های ساعت شماره‌گذاری شده‌اند [مطابق با شماره‌گذاری Rba]. کمپلکس sphaeroides (13)]. برای LH1-α، رنگ زیرواحد پروتئین زرد است؛ برای LH1-β، رنگ زیرواحد پروتئین آبی است؛ برای پروتئین-W، پروتئین قرمز است؛ برای RC-H، فیروزه‌ای است؛ برای RC-L، نارنجی است؛ برای RC-M، سرخابی است. کوفاکتورها با میله‌ها نشان داده شده‌اند، سبز نشان دهنده مولکول‌های BChl و BPh a، بنفش نشان دهنده کاروتنوئیدها و زرد نشان دهنده مولکول‌های UQ10 است. (G و H) نمای بزرگنمایی شده از شکاف پروتئین-W در ناحیه معادل کمپلکس RC-LH114-W (G) و کمپلکس RC-LH116 (H). کوفاکتورها به شکل پر کننده فضا نمایش داده می‌شوند، کینون کلات شده به رنگ آبی نمایش داده می‌شود. شکاف پروتئین-W با خط چین آبی در (G) برجسته شده است، و سوراخ‌های کوچکی که کینون/کینولول روی حلقه LH116 پخش می‌شوند با خط چین سیاه در (H) برجسته شده‌اند.
شکل 1 (A و B) RC را نشان می‌دهد که توسط آرایه‌های باز یا بسته‌ای از هترودایمرهای LH1αβ احاطه شده است، که هر کدام به دو BChl و یک کاروتنوئید متصل می‌شوند (شکل‌های 1، C و D). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که Rps کمپلکس LH1 است. در مسیر بیوسنتز زانتین اسپیرولینا، این گونه‌ها حاوی جمعیت‌های مختلطی از کاروتنوئیدها هستند (17). با این حال، اسپیروپیروکزانتین کاروتنوئید غالب است و چگالی آن رضایت‌بخش است. بنابراین، ما تصمیم گرفتیم اسپیروکسانتین را در تمام جایگاه‌های اتصال LH1 مدل‌سازی کنیم. پلی‌پپتیدهای آلفا و بتا، TMHهای منفرد با نواحی بیرونی غشایی کوتاه هستند (شکل‌های 1، A، B، E و F). اگرچه چگالی 17 باقیمانده در انتهای C مشاهده نشد، اما پلی‌پپتید آلفا در هر دو کمپلکس از Met1 به Ala46 شکسته شد. پلی‌پپتید β در RC-LH116 از Gly4 به Tyr52 و در RC-LH114-W از Ser5 به Tyr52 کاهش یافت. هیچ تراکمی از 3 یا 4 باقیمانده N-ترمینال یا 13 باقیمانده C-ترمینال مشاهده نشد (شکل S1). تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی کمپلکس مخلوط RC-LH1 تهیه شده از سویه وحشی نشان داد که ناحیه از دست رفته نتیجه برش هترولوگ این پپتیدها بوده است (شکل‌های S1 و S2). فرمیلاسیون N-ترمینال α-Met1 نیز مشاهده شد (f). تجزیه و تحلیل نشان داد که α-پپتید از باقیمانده‌های fMet1 تا Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 و β-پپتید از باقیمانده‌های Ser2 تا Ala53 تشکیل شده است که با نقشه تراکم EM در دمای پایین مطابقت خوبی دارد.
هماهنگی α-His29 و β-His36، BChlها را رو در روی هم قرار می‌دهد؛ هر هترودایمر αβ با همسایگان خود مونتاژ می‌شود تا یک حلقه باز (RC-LH114-W) یا یک حلقه بسته (RC-LH116) در اطراف RC تشکیل دهد. آرایه رنگدانه جفت شده با اکسیتون (شکل 1، C و D). در مقایسه با باند 877 نانومتر RC-LH114-W، جابجایی قرمز جذبی 880 نانومتری RC-LH116، 3 نانومتر است (شکل 2A). با این حال، طیف دورنگ‌نمایی دایره‌ای تقریباً یکسان است (شکل 2B)، که نشان می‌دهد اگرچه تفاوت آشکاری بین حلقه‌های باز و بسته وجود دارد، محیط محلی BChlها بسیار مشابه است. جابجایی قرمز جذبی ممکن است نتیجه کاهش حرکت حرارتی و افزایش پایداری در حلقه بسته (18، 19)، تغییر در جفت شدن رنگدانه ناشی از حلقه بسته (20، 21) یا ترکیبی از این دو اثر (11) باشد.
(الف) طیف جذبی فرابنفش/مرئی/مادون قرمز نزدیک، که پیک‌های آن با رنگدانه‌های مربوطه مشخص شده و نسبت به پیک BPh در 775 نانومتر نرمال‌سازی شده‌اند. (ب) طیف دورنگ‌نمایی دایره‌ای نرمال‌سازی شده نسبت به جذب BChl در 805 نانومتر. (ج و د) طیف‌های ΔA انتخاب شده از طیف‌های جذبی تفکیک زمانی کمپلکس RC-LH114-W (ج) و کمپلکس RC-LH116 (د). برای مقایسه بهتر، همه طیف‌ها در 0.2 پیکوثانیه نسبت به ΔA از −A نرمال‌سازی شده‌اند. (ه) سرعت اکسیداسیون سیتوکروم c2 پس از تابش در حضور غلظت‌های مختلف UQ2 (برای داده‌های خام به شکل S8 مراجعه کنید). (و) در سلول‌هایی که تحت نور با شدت کم، متوسط ​​یا زیاد (به ترتیب 10، 30 یا 300 میکرومولار بر متر مربع بر ثانیه) رشد کرده‌اند، زیر واحدهای پروتئین W و RC-L در کمپلکس خالص‌سازی شده و نسبت غشای جدا شده. سطح پروتئین را با الکتروفورز ژل SDS-پلی‌اکریل‌آمید و ایمونواسی تعیین کنید (برای داده‌های خام به شکل S9 مراجعه کنید). نسبت را نسبت به کمپلکس خالص‌سازی شده RC-LH114-W تعیین کنید. نسبت استوکیومتری RC-L به پروتئین-W کمپلکس 1:1 است.
BChl های موجود در موقعیت 1 در حلقه αβ14 تغییر شکل یافته RC-LH114-W (شکل 1، A، C و E) نسبت به BChl های معادل در RC-LH116 (شکل 1، B، D و F و شکل S3) به دهنده اولیه RC (P) 6.8 آنگستروم نزدیک‌تر هستند. با این حال، سینتیک جذب گذرای دو کمپلکس نشان می‌دهد که برای RC-LH114-W و RC-LH116، ثابت‌های زمانی انتقال انرژی تحریک از LH1 به RC به ترتیب 40 ± 4 و 44 ± 3 پیکوثانیه هستند (شکل 2)، C و D، شکل S4 و جدول S2). همچنین تفاوت قابل توجهی در انتقال الکترونی در RC وجود ندارد (شکل S5 و متن تکمیلی مرتبط). ما گمان می‌کنیم که تطابق نزدیک زمان انتقال انرژی بین LH1 و RC-P به دلیل فاصله، زاویه و انرژی پتانسیل مشابه اکثر BChl ها در دو حلقه LH1 است. به نظر می‌رسد که بررسی الگوی انرژی LH1 برای رسیدن به حداقل فاصله، سریع‌تر از انتقال مستقیم انرژی از مکان‌های غیربهینه به RC نیست. حلقه باز LH1 در RC-LH114-W نیز ممکن است تحت شرایط دمای پایین برای تجزیه و تحلیل ساختاری، حرکت حرارتی ناچیزی را متحمل شود و در دمای اتاق، ترکیب حلقه αβ14 طولانی‌تری از فاصله رنگدانه‌ای βBChls در موقعیت RC 1 وجود دارد.
کمپلکس RC-LH116 حاوی 32 BChl و 16 کاروتنوئید است و آرایش کلی آن مشابه آرایش به‌دست‌آمده از Thermochromatium (Tch.) pidpidum [بانک داده‌های پروتئین (PDB) ID 5Y5S] (9)، سویه Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) و جلبک سبز (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) است. پس از هم‌ترازی، تنها انحرافات کوچکی در موقعیت‌های هترودایمرهای αβ، به‌ویژه 1-5، 15 و 16 مشاهده شد (شکل S6). وجود پروتئین-W تأثیر قابل‌توجهی بر ساختار LH1 دارد. سه TMH آن توسط حلقه‌های کوتاهی به هم متصل شده‌اند، به طوری که N-ترمینال در سمت لومن کمپلکس و C-ترمینال در سمت سیتوپلاسمی قرار دارد (شکل‌های 1A و 3، A تا D). پروتئین-W تا حد زیادی آبگریز است (شکل 3B) و TMH2 و TMH3 با LH1αβ-14 برهمکنش می‌کنند تا یک سطح غشایی تشکیل دهند (شکل 3، B و E تا G). سطح مشترک عمدتاً از باقیمانده‌های Phe، Leu و Val در ناحیه غشایی تشکیل شده است. این باقیمانده‌ها با اسیدهای آمینه آبگریز و رنگدانه‌های αβ-14 انباشته شده‌اند. برخی باقیمانده‌های قطبی نیز در برهمکنش نقش دارند، از جمله پیوند هیدروژنی بین W-Thr68 و β-Trp42 روی سطح حفره پیچیده (شکل 3، F و G). در سطح سیتوپلاسم، Gln34 در مجاورت گروه کتو از کاروتنوئیدهای αβ-14 قرار دارد. علاوه بر این، مولکول n-دودسیل β-d-مالتوزید (β-DDM) تفکیک شد و دم آبگریز آن تا سطح مشترک بین پروتئین-W و αβ-14 امتداد یافت و دم لیپیدی ممکن است در بدن قرار داشته باشد. ما همچنین متوجه شدیم که نواحی تفکیک C-ترمینال پروتئین W و RCH بسیار نزدیک هستند، اما در محدوده تشکیل برهمکنش‌های خاص نیستند (شکل 1، A و E). با این حال، ممکن است برهمکنش‌هایی در اسیدهای آمینه C-ترمینال تفکیک نشده این دو پروتئین وجود داشته باشد که می‌تواند مکانیسمی برای جذب پروتئین-W در طول مونتاژ کمپلکس RC-LH114-W فراهم کند.
(الف) پروتئین-W که به شکل کارتونی در سطح مشترک با LH1αβ14 قرار دارد، دارای یک زنجیره جانبی میله‌ای شکل (قرمز) است که در بخشی از نمودار پتانسیل الکترواستاتیک (سطح خاکستری شفاف با سطح کانتور 0.13) نمایش داده شده است. (ب) پروتئین-W که توسط یک سطح رنگی آبگریز نشان داده شده است. نواحی قطبی و باردار با رنگ فیروزه‌ای، نواحی آبگریز با رنگ سفید و نواحی به شدت آبگریز با رنگ نارنجی نمایش داده شده‌اند. (ج و د) پروتئین-W که در کارتون نشان داده شده است، جهت آن مانند (الف) (ج) است و 180 درجه چرخیده است (د). با توجه به موقعیت در توالی، باقیمانده‌های قابل تشخیص، یک طرح رنگی رنگین‌کمانی را اتخاذ می‌کنند، که در آن ترمینال N آبی و ترمینال C قرمز است. (ه) پروتئین-W در همان نمای (الف) و باقیمانده‌های موجود در سطح مشترک پروتئین-W:LH1 توسط میله‌هایی با علامت‌های متصل نشان داده شده‌اند. (F) پروتئین-W در نمایش کارتونی نسبت به (E) و LH1αβ14 و در نمایش میله‌ای نسبت به باقیمانده‌های رابط ۹۰ درجه چرخیده است. باقیمانده‌های آویزان از پلی‌پپتید بتا برچسب‌گذاری شده‌اند. کوفاکتور به صورت میله‌ای مطابق با رنگ شکل ۱ نشان داده شده است، β-DDM تجزیه شده به رنگ خاکستری نشان داده شده است و اکسیژن به رنگ قرمز نشان داده شده است. (G) نمای (F) ۱۸۰ درجه چرخیده است، با باقیمانده‌های برجسته پلی‌پپتید آلفای برچسب‌گذاری شده.
پروتئین-W جایگزین یک هترودایمر αβ (پانزدهمین در شکل 1F) می‌شود و در نتیجه از بسته شدن حلقه جلوگیری کرده و سه هترودایمر اول αβ را کج می‌کند. مشاهده شد که حداکثر زاویه شیب اولین هترودایمر αβ-1 نسبت به لایه نرمال فیلم 25 تا 29 درجه بود (شکل 1، A و E)، که توسط شیب 2 تا 8 درجه‌ای αβ-1 در RC A با کنتراست شدید - LH116 (شکل 1، B و F) تشکیل شده است. هترودایمر دوم و سوم به ترتیب در زاویه 12 تا 22 درجه و 5 تا 10 درجه کج شده‌اند. به دلیل ممانعت فضایی RC، شیب αβ-1 شامل جفت دوم αβ (که مربوط به شانزدهمین αβ در شکل 1F است) نمی‌شود، بنابراین یک شکاف واضح در حلقه LH1 ایجاد می‌شود (شکل 1، A و E). به دلیل فقدان دو هترودایمر αβ، همراه با از دست دادن چهار BChl و دو کاروتنوئید، هیچ یک از کاروتنوئیدها به زیر واحد αβ-1 پیچ خورده متصل نمی‌شوند و در نتیجه یک حلقه LH114-W حاوی ۱۳ کاروتنوئید Vegetarian و ۲۸ BChl ایجاد می‌شود. تخمین‌های تفکیک‌پذیری محلی دو کمپلکس در نواحی αβ1 تا ۷ کمتر از بقیه حلقه LH1 است که ممکن است نشان‌دهنده انعطاف‌پذیری ذاتی زیر واحد LH1 مجاور محل RC QB باشد (شکل ۴).
تصاویر RC-LH114-W (A و B) و RC-LH116 (C و D) از همان نمای بالا/نمای کناری (A و B) (A و C) و سطح حفره شکل 1 (B و D) نشان داده شده‌اند. کلیدهای رنگی در سمت راست نشان داده شده‌اند.
تنها کمپلکس هسته‌ای مشخص دیگر با نسبت استوکیومتری 1:14، دایمر RC-LH1-PufX رودوکوکوس اسفارویدز (Rba.) است (13). با این حال، پروتئین W و PufX هیچ همولوژی آشکاری ندارند و تأثیر قابل توجهی بر ساختارهای LH1 مربوطه خود دارند. PufX یک TMH واحد با یک دامنه سیتوپلاسمی N-ترمینال است که با سمت سیتوپلاسمی زیر واحد RC-H (13) در موقعیتی مطابق با Rps. palustris LH116αβ-16 تعامل دارد. PufX کانالی برای تبادل کینون/کینولون بین RC-LH1 و کمپلکس سیتوکروم bcl ایجاد می‌کند و در تمام کمپلکس هسته‌ای Rba. اسفارویدز وجود دارد (13). اگرچه رابط مونومر-مونومر در Rba است. دایمر اسفاروید RC-LH1-PufX در موقعیت اتصال پروتئین W در RC-LH114-W قرار دارد و شکاف ایجاد شده توسط PufX و پروتئین-W در موقعیت معادل آن است (شکل S7A). شکاف در RC-LH114-W همچنین با کانال کینون فرضی (8) سودوموناس رزا LH1 همسو است که توسط پپتیدهایی غیرمرتبط با پروتئین W یا PufX تشکیل شده است (شکل S7B). علاوه بر این، کانال کینون در Blc. LH1 سبز زمردی که با حذف یک زیر واحد γ (7) تشکیل شده است، در موقعیت مشابهی قرار دارد (شکل S7C). اگرچه توسط پروتئین‌های مختلف واسطه‌گری می‌شود، اما به نظر می‌رسد ظهور این کانال‌های کینون/کینولول در یک موقعیت مشترک در کمپلکس RC-LH1 نمونه‌ای از تکامل همگرا باشد، که نشان می‌دهد شکاف ایجاد شده توسط پروتئین W ممکن است به عنوان یک کانال کینون عمل کند.
شکاف موجود در حلقه LH114-W امکان تشکیل یک ناحیه غشایی پیوسته بین فضای داخلی کمپلکس RC-LH114-W و غشای توده‌ای را فراهم می‌کند (شکل 1G)، نه اینکه مانند پروتئین‌ها، دو دامنه از طریق یک منفذ پروتئینی به هم متصل شوند. کمپلکس RC-LH116 شبیه یک کمپلکس بسته Tch. سوزنی شکل (22) است (شکل 1H). از آنجایی که انتشار کینون از طریق غشاء سریع‌تر از انتشار از طریق کانال پروتئینی باریک است، حلقه باز LH114-W می‌تواند گردش سریع‌تر RC را نسبت به حلقه بسته LH116 امکان‌پذیر کند و انتشار کینون به داخل RC ممکن است محدودتر باشد. به منظور آزمایش اینکه آیا پروتئین W بر تبدیل کینون‌ها از طریق RC تأثیر می‌گذارد، ما یک سنجش اکسیداسیون سیتوکروم را روی غلظت مشخصی از یوبیکینون 2 (UQ2) (آنالوگ UQ10 طبیعی با دم ایزوپرن کوتاه‌تر) انجام دادیم (شکل 2E). اگرچه وجود کینون کیلیت‌شده مانع از تعیین دقیق ثابت ظاهری میکائیلیس می‌شود (RC-LH114-W و RC-LH116 به ترتیب برای 0.2±0.1μM و 0.5±0.2μM مناسب هستند)، حداکثر سرعت RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5% بزرگتر از RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) است.
ما در ابتدا تخمین زدیم که پروتئین-W در حدود 10٪ از کمپلکس هسته وجود دارد (16)؛ در اینجا، میزان اشغال سلول‌های رشد با نور کم، نور متوسط ​​و نور زیاد به ترتیب 15±0.6٪، 11±1٪ و 0.9±0.5٪ است (شکل 2F). مقایسه کمی طیف‌سنجی جرمی نشان داد که افزودن برچسب هیستیدین، فراوانی نسبی پروتئین-W را در مقایسه با سویه‌های وحشی کاهش نمی‌دهد (P = 0.59)، بنابراین این سطوح، مصنوعی از پروتئین-W اصلاح‌شده نیستند (شکل S10). با این حال، این اشغال کم پروتئین-W در کمپلکس RC-LH1 ممکن است به برخی از RCها اجازه دهد تا با سرعت بیشتری تغییر مکان دهند و در نتیجه تبادل کندتر کینون/کینولون را در کمپلکس RC-LH116 کاهش دهند. ما متوجه شدیم که نرخ بالای اشغال نور با داده‌های اخیر ترانسکریپتومیکس که نشان می‌دهد بیان ژن pufW تحت نور قوی افزایش می‌یابد، مغایرت دارد (شکل S11) (23). تفاوت بین رونویسی pufW و ترکیب پروتئین-W در کمپلکس RC-LH1 گیج‌کننده است و ممکن است نشان‌دهنده تنظیم پیچیده پروتئین باشد.
در RC-LH114-W، 6 کاردیولیپین (CDL)، 7 فسفاتیدیل کولین (POPC)، 1 فسفاتیدیل گلیسرول (POPG) و 29 مولکول β-DDM اختصاص داده شده و در آن مدل‌سازی شده‌اند: 6 CDL، 24 POPC، 2 POPG و 12 βDDM. RC-LH116 (شکل 5، A و B). در این دو ساختار، CDL تقریباً در سمت سیتوپلاسمی کمپلکس قرار دارد، در حالی که POPC، POPG و β-DDM بیشتر در سمت لومینال قرار دارند. دو مولکول لیپید و شوینده در ناحیه αβ-1 تا αβ-6 کمپلکس RC-LH114-W (شکل 5A) و پنج مولکول در ناحیه معادل RC-LH116 (شکل 5B) جدا شدند. لیپیدهای بیشتری در طرف دیگر کمپلکس، عمدتاً CDL، یافت شدند که بین RC و αβ-7 تا αβ-13 انباشته شده بودند (شکل 5، A و B). سایر لیپیدها و مواد شوینده از نظر ساختاری در خارج از حلقه LH1 قرار دارند و زنجیره‌های آسیل با تفکیک خوب بین زیر واحدهای LH1 امتداد دارند که به طور آزمایشی در RC-LH114-W به عنوان β-DDM تعیین می‌شوند و در RC A مخلوطی از β-DDM و POPC-LH116 به عنوان β-DDM تعریف می‌شوند. موقعیت‌های مشابه لیپیدهای کیلیت‌ساز و مواد شوینده در ساختار ما نشان می‌دهد که آنها از نظر فیزیولوژیکی جایگاه‌های اتصال مرتبطی هستند (شکل S12A). موقعیت‌های مولکول‌های معادل در Tch نیز از ثبات خوبی برخوردارند. Gentle و Trv. سویه 970 RC-LH1s (شکل S12، B تا E) (9، 12) و باقیمانده‌های پیوند هیدروژنی گروه سر لیپید، حفاظت نسبتاً خوبی را در هم‌ترازی توالی نشان دادند (شکل S13)، که نشان می‌دهد CDL حفاظت‌شده‌ای که به RC متصل می‌شود (24)، این مکان‌ها ممکن است در کمپلکس RC-LH1 حفاظت‌شده باشند.
(الف و ب) پپتیدهای RC-LH114-W (الف) و RC-LH116 (ب) با کارتون‌ها نمایش داده شده‌اند و رنگدانه‌ها با میله‌ها، با استفاده از طرح رنگی در شکل 1، نشان داده شده‌اند. لیپیدها با رنگ قرمز و شوینده‌ها با رنگ خاکستری نشان داده شده‌اند. UQ متصل به جایگاه‌های RC QA و QB به رنگ زرد است، در حالی که UQ جدا شده به رنگ آبی است. (ج و د) همان نماهای (الف) و (ب)، با حذف لیپیدها. (ه تا گ) نمای بزرگ‌شده Q1(E)، Q2(F) و Q3(G) از RC-LH116، با زنجیره‌های جانبی که بر یکدیگر تأثیر می‌گذارند. پیوندهای هیدروژنی به صورت خطوط چین‌دار سیاه نشان داده شده‌اند.
در RC-LH116، هر دو RC QA و QB UQ که در انتقال الکترون در فرآیند جداسازی بار شرکت می‌کنند، در جایگاه‌های اتصال خود تجزیه می‌شوند. با این حال، در RC-LH114-W، کینون QB حل نشده است و در ادامه به تفصیل مورد بحث قرار خواهد گرفت. علاوه بر کینون‌های QA و QB، دو مولکول UQ کلات شده (واقع در بین حلقه‌های RC و LH1) در ساختار RC-LH114-W بر اساس گروه‌های سر کاملاً حل شده‌شان (که به ترتیب در Q1 و Q2 قرار دارند) قرار گرفته‌اند. شکل 5C). دو واحد ایزوپرن به Q1 اختصاص داده شده است و نقشه چگالی، 10 دنباله ایزوپرن کامل Q2 را حل می‌کند. در ساختار RC-LH116، سه مولکول UQ10 کلات شده (Q1 تا Q3، شکل 5D) حل شدند و همه مولکول‌ها چگالی واضحی در سراسر دنباله دارند (شکل 5، D تا G). در دو ساختار، موقعیت گروه‌های سر کینون Q1 و Q2 از ثبات عالی برخوردار است (شکل S12F) و آنها فقط با RC برهمکنش دارند. Q1 در ورودی شکاف W مربوط به RC-LH114-W قرار دارد (شکل‌های 1G و 5، C، D و E) و Q2 در نزدیکی محل اتصال QB قرار دارد (شکل‌های 5، C، D) و F). باقیمانده‌های L-Trp143 و L-Trp269 حفظ‌شده بسیار نزدیک به Q1 و Q2 هستند و برهمکنش‌های π-Stacking بالقوه‌ای را فراهم می‌کنند (شکل‌های 5، E و F و شکل S12). L-Gln88، که 3.0 آنگستروم از اکسیژن انتهایی Q1 فاصله دارد، یک پیوند هیدروژنی قوی ایجاد می‌کند (شکل 5E)؛ این باقیمانده در همه RCها به جز دورترین رابطه (شکل S13) حفظ‌شده است. L-Ser91 در اکثر RC های دیگر به طور محافظه کارانه جایگزین Thr می‌شود (شکل S13)، 3.8 آنگستروم از متیل اکسیژن Q1 فاصله دارد و ممکن است پیوندهای هیدروژنی ضعیفی ایجاد کند (شکل 5E). به نظر نمی‌رسد Q3 برهمکنش خاصی داشته باشد، اما در ناحیه آبگریز بین زیر واحد RC-M و ​​زیر واحد LH1-α 5 تا 6 قرار دارد (شکل 5، D و G). Q1، Q2 و Q3 یا کینون‌های کلات شده مجاور نیز در Tch. Gentle، Trv. Strain 970 و Blc تفکیک شده‌اند. ساختار عنبیه (9، 10، 12) به یک محل اتصال کینون کمکی حفاظت شده در کمپلکس RC-LH1 اشاره دارد (شکل S12G). پنج UQ تجزیه‌شده در RC-LH116 با 5.8±0.7 هر کمپلکس که توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تعیین شده است، مطابقت خوبی دارند، در حالی که سه UQ تجزیه‌شده در RC-LH114-W کمتر از مقدار اندازه‌گیری‌شده 6.2±0.3 (شکل S14) هستند که نشان می‌دهد مولکول‌های UQ حل‌نشده در ساختار وجود دارند.
پلی‌پپتیدهای L و M شبه‌متقارن هر کدام حاوی پنج TMH هستند و یک هترودایمر تشکیل می‌دهند که ترکیبی از یک دیمر BChl، دو مونومر BChl، دو مونومر باکتریوفاژ (BPh) و یک آهن غیر هِم و یک یا دو مولکول UQ10 است. کاروتنوئیدها به دلیل وجود پیوندهای هیدروژنی روی گروه کتون انتهایی و تجمع شناخته شده آن در Rps، در زیر واحد M که سیس-3،4-دهیدروورودوپین نام دارد، گنجانده می‌شوند. گونه‌ها (25). دامنه غشای خارجی RC-H توسط یک TMH واحد به غشا متصل می‌شود. ساختار کلی RC مشابه سه زیر واحد RC گونه‌های مرتبط (مانند Rba) است. اسفارویدها (شناسه PDB: 3I4D). ماکروسیکل‌های BChl و BPh، اسکلت کاروتنوئیدی و آهن غیر هِم در محدوده وضوح این ساختارها همپوشانی دارند، همانطور که گروه سر UQ10 در جایگاه QA و کینون QB در RC-LH116 (شکل S15) نیز همپوشانی دارند.
وجود دو ساختار RC با نرخ اشغال جایگاه QB متفاوت، فرصت جدیدی را برای بررسی تغییرات ساختاری سازگار همراه با اتصال کینون QB فراهم می‌کند. در کمپلکس RC-LH116، کینون QB در موقعیت کاملاً متصل "پروگزیمال" قرار دارد (26)، اما جداسازی RC-LH114-W فاقد کینون QB است. هیچ کینون QB در RC-LH114-W وجود ندارد، که جای تعجب دارد زیرا این کمپلکس فعال است، بیشتر از کمپلکس RC-LH116 با کینون QB با تفکیک ساختاری. اگرچه دو حلقه LH1 حدود شش کینون را کلات می‌کنند، پنج کینون در حلقه بسته RC-LH116 از نظر ساختاری تفکیک می‌شوند، در حالی که تنها سه کینون در حلقه باز RC-LH114-W از نظر ساختاری محدود هستند. این افزایش بی‌نظمی ساختاری ممکن است نشان‌دهنده جایگزینی سریع‌تر جایگاه‌های QB RC-LH114-W، سینتیک سریع‌تر کینون در کمپلکس و افزایش احتمال عبور از حلقه LH1 باشد. ما پیشنهاد می‌کنیم که فقدان UQ در جایگاه RC QB RC-LH114-W ممکن است نتیجه یک کمپلکس پیچیده‌تر و فعال‌تر باشد و جایگاه QB RC-LH114-W بلافاصله در گردش UQ منجمد شده است. مرحله خاص (ورودی جایگاه QB بسته شده است) نشان دهنده ترکیب این فعالیت است.
بدون QB، چرخش همراه L-Phe217 به موقعیتی که با اتصال UQ10 ناسازگار است، زیرا باعث برخورد فضایی با اولین واحد ایزوپرن دم می‌شود (شکل 6A). علاوه بر این، تغییرات ساختاری اصلی آشکار هستند، به ویژه مارپیچ de (مارپیچ کوتاه در حلقه بین TMH D و E) که در آن L-Phe217 به جیب اتصال QB منتقل می‌شود و چرخش L-Tyr223 (شکل 6A) برای شکستن پیوند هیدروژنی با چارچوب M-Asp45 و بستن ورودی جایگاه اتصال QB (شکل 6B). مارپیچ de در پایه خود می‌چرخد، Cα مربوط به L-Ser209 به اندازه 0.33 آنگستروم جابجا می‌شود، در حالی که L-Val221Cα به اندازه 3.52 آنگستروم جابجا می‌شود. هیچ تغییر قابل مشاهده‌ای در TMH D و E وجود ندارد، که در هر دو ساختار قابل انطباق هستند (شکل 6A). تا آنجا که می‌دانیم، این اولین ساختار در مرکز واکنش طبیعی است که جایگاه QB را می‌بندد. مقایسه با ساختار کامل (محدود به QB) نشان می‌دهد که قبل از کاهش کینون، یک تغییر ساختاری برای ورود آن به کینون لازم است. L-Phe217 می‌چرخد تا یک برهمکنش π-stacking با گروه سر کینون تشکیل دهد و مارپیچ به سمت بیرون جابجا می‌شود و به اسکلت L-Gly222 و زنجیره جانبی L-Tyr223 اجازه می‌دهد تا یک شبکه پیوند هیدروژنی با ساختار پیوند هیدروژنی پایدار تشکیل دهند (شکل 6، A و C).
(الف) کارتون همپوشانی هولوگرام (زنجیره L، زنجیره نارنجی/M، سرخابی) و ساختار آپو (خاکستری)، که در آن باقیمانده‌های کلیدی به شکل میله‌ای نمایش داده می‌شوند. UQ10 با یک نوار زرد نشان داده شده است. خط نقطه‌چین پیوندهای هیدروژنی تشکیل شده در کل ساختار را نشان می‌دهد. (ب و ج) نمایش سطحی آپولیپوپروتئین و کل ساختار حلقه، که اکسیژن زنجیره جانبی L-Phe217 را به ترتیب با رنگ آبی و L-Tyr223 را با رنگ قرمز برجسته می‌کند. زیر واحد L نارنجی است؛ زیر واحدهای M و H رنگی نیستند. (د و ه) آپولیپوپروتئین (د) و کل (ه) جایگاه‌های RC QB [به ترتیب با (الف) رنگ‌آمیزی شده] و Thermophilus thermophilus PSII (سبز، آبی با کینون پلاستیکی؛ شناسه PDB: 3WU2) هم‌تراز (58).
به طور غیرمنتظره‌ای، اگرچه چندین ساختار از گروه‌های واکنش فاقد QB بدون LH1 در دسترس هستند، تغییرات ساختاری مشاهده شده در این مطالعه قبلاً گزارش نشده‌اند. این تغییرات شامل ساختار تهی‌سازی QB از Blc. viridis (شناسه PDB: 3PRC) (27)، Tch. tepidum (شناسه PDB: 1EYS) (28) و Rba. sphaeroides (شناسه PDB: 1OGV) (29) است که همگی تقریباً مشابه ساختار کلی QB خود هستند. بررسی دقیق 3PRC نشان داد که مولکول‌های شوینده LDAO (لوریل دی متیل آمین اکسید) در ورودی موقعیت QB متصل می‌شوند، که ممکن است از بازآرایی به یک ترکیب بسته جلوگیری کند. اگرچه LDAO در همان موقعیت در 1EYS یا 1OGV تجزیه نمی‌شود، اما این گروه‌های واکنش با استفاده از همان شوینده تهیه می‌شوند و بنابراین ممکن است همان اثر را ایجاد کنند. ساختار کریستالی Rba. به نظر می‌رسد که Sphaeroides RC که با سیتوکروم c2 (شناسه PDB: 1L9B) متبلور شده است، دارای یک جایگاه QB بسته نیز باشد. با این حال، در این مورد، ناحیه N-ترمینال پلی‌پپتید RC-M (که از طریق پیوند H باقیمانده Tyr روی مارپیچ Q با جایگاه اتصال QB در تعامل است) یک ترکیب غیرطبیعی را اتخاذ می‌کند و تغییر ترکیب QB بیشتر بررسی نشده است (30). نکته اطمینان‌بخش این است که ما این نوع تغییر شکل پلی‌پپتید M را در ساختار RC-LH114-W ندیده‌ایم، که تقریباً مشابه ناحیه N-ترمینال RC-LH116 است. همچنین باید توجه داشت که پس از ریشه‌کنی آنتن LH1 مبتنی بر دترجنت، مراکز واکنش آپولیپوپروتئین در PDB حل شدند که باعث حذف ذخایر کینون داخلی و لیپیدها در شکاف بین RC و سطح داخلی حلقه LH1 اطراف شد (31، 32). مرکز واکنش (RC) به دلیل حفظ تمام کوفاکتورها، به جز کینون QB تجزیه‌پذیر که پایداری کمتری دارد و اغلب در طول فرآیند آماده‌سازی از بین می‌رود (33)، عملکردی باقی می‌ماند. علاوه بر این، مشخص شده است که حذف LH1 و لیپیدهای حلقوی طبیعی از مرکز واکنش می‌تواند بر عملکردها تأثیر بگذارد، مانند کوتاه شدن طول عمر حالت P+QB جدا شده از بار (31، 34، 35). بنابراین، ما حدس می‌زنیم که وجود حلقه LH1 محلی در اطراف مرکز واکنش ممکن است محل QB "بسته" را حفظ کند و در نتیجه محیط محلی نزدیک QB را حفظ کند.
اگرچه آپولیپوپروتئین (بدون کینون QB) و ساختار کامل، تنها دو تصویر لحظه‌ای از گردش جایگاه QB را نشان می‌دهند، نه یک سری رویدادها، اما نشانه‌هایی وجود دارد که اتصال می‌تواند برای جلوگیری از اتصال مجدد توسط هیدروکینون، دریچه‌دار شود تا مهار سوبسترا را مهار کند. برهمکنش کینولول و کینون در نزدیکی جایگاه QB آپولیپوپروتئین ممکن است متفاوت باشد، که منجر به رد آن توسط RC می‌شود. مدت‌هاست که پیشنهاد شده است که تغییرات ساختاری در اتصال و احیای کینون‌ها نقش دارند. توانایی RCهای منجمد برای احیای کینون‌ها پس از سازگاری با تاریکی مختل می‌شود (36)؛ کریستالوگرافی اشعه ایکس نشان می‌دهد که این آسیب به دلیل به دام افتادن کینون‌های QB در یک ساختار "دیستال" در حدود 4.5 آنگستروم از موقعیت پروگزیمال فعال است (26)، 37). ما پیشنهاد می‌کنیم که این ساختار اتصال دیستال، تصویری لحظه‌ای از حالت میانی بین آپولیپوپروتئین و ساختار حلقه کامل است که پس از برهمکنش اولیه با کینون و باز شدن جایگاه QB رخ می‌دهد.
مرکز واکنش نوع II که در کمپلکس PSII برخی از باکتری‌های فتوتروفیک و سیانوباکتری‌ها، جلبک‌ها و گیاهان یافت می‌شود، دارای حفاظت ساختاری و عملکردی است (38). تراز ساختاری نشان داده شده در شکل 6 (D و E) بر شباهت بین مراکز واکنش PSII و جایگاه QB کمپلکس مرکز واکنش باکتریایی تأکید دارد. این مقایسه مدت‌هاست که مدلی برای مطالعه سیستم‌های نزدیک به هم اتصال و کاهش کینون بوده است. انتشارات قبلی نشان داده‌اند که تغییرات ساختاری با کاهش کینون‌ها توسط PSII همراه است (39، 40). بنابراین، با توجه به حفاظت تکاملی مرکز واکنش، این مکانیسم اتصال که قبلاً مشاهده نشده بود، ممکن است برای جایگاه QB مرکز واکنش PSII در گیاهان فتوتروفیک اکسیژن‌دار نیز قابل اجرا باشد.
سویه‌های Rps ΔpufW (حذف pufW بدون برچسب) و PufW-His (پروتئین W با برچسب His 10x در انتهای C که از جایگاه طبیعی pufW بیان شده است). palustris CGA009 در کار قبلی ما (16) شرح داده شده است. این سویه‌ها و والد وحشی ایزوژنیک با کشت خطی تعداد کمی از سلول‌ها روی پلیت PYE (هر کدام 5 گرم در لیتر) (نگهداری شده در LB در دمای -80 درجه سانتیگراد، حاوی 50٪ (w/v) گلیسرول) پروتئین، عصاره مخمر و آگار سوکسینات [1.5٪ (w/v)]) از فریزر بازیابی شدند. پلیت به مدت یک شب در تاریکی در دمای اتاق تحت شرایط بی‌هوازی انکوبه شد و سپس با نور سفید (~50 میکرومول در متر مربع بر ثانیه) که توسط لامپ‌های هالوژن OSRAM 116-W (RS Components، انگلستان) ارائه می‌شد، به مدت 3 تا 5 روز روشن شد تا زمانی که یک کلنی واحد ظاهر شد. از یک کلنی منفرد برای تلقیح 10 میلی‌لیتر محیط کشت M22+ (41) حاوی 0.1٪ (وزنی/حجمی) کازامینواسیدها (که از این پس M22 نامیده می‌شود) استفاده شد. این کشت در شرایط کم اکسیژن در تاریکی در دمای 34 درجه سانتیگراد با تکان دادن با سرعت 180 دور در دقیقه به مدت 48 ساعت رشد داده شد و سپس 70 میلی‌لیتر از کشت تحت همان شرایط به مدت 24 ساعت تلقیح شد. از یک کشت نیمه هوازی با حجم 1 میلی‌لیتر برای تلقیح 30 میلی‌لیتر محیط کشت M22 در یک بطری شیشه‌ای شفاف با درب پیچی جهانی 30 میلی‌لیتری استفاده شد و به مدت 48 ساعت توسط میله همزن مغناطیسی استریل با هم زدن (~50μmolm-2 s-1) تحت تابش قرار گرفت. سپس 30 میلی‌لیتر از محیط کشت با حدود 1 لیتر محیط کشت تحت همان شرایط تلقیح شد، که سپس برای تلقیح حدود 9 لیتر محیط کشت که به مدت 72 ساعت در معرض نور ~200 میکرومول بر متر مربع در ثانیه قرار گرفته بود، استفاده شد. سلول‌ها با سانتریفیوژ در 7132 RCF به مدت 30 دقیقه برداشت شدند، در حدود 10 میلی‌لیتر از 20 میلی‌مولار تریس-هیدروکلراید (pH 8.0) دوباره به حالت تعلیق درآمدند و تا زمان نیاز در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
پس از ذوب شدن، مقداری کریستال دئوکسی ریبونوکلئاز I (مرک، انگلستان)، لیزوزیم (مرک، انگلستان) و دو قرص مهارکننده پروتئاز هولوآنزیم Roche (مرک، انگلستان) به سلول‌های دوباره معلق شده اضافه کنید. در یک سلول فشار فرانسوی 20000 psi (آمینکو، ایالات متحده)، سلول‌ها 8 تا 12 بار متلاشی شدند. پس از حذف سلول‌های شکسته نشده و بقایای نامحلول با سانتریفیوژ در 18500 RCF به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، غشاء با سانتریفیوژ در 113000 RCF به مدت 2 ساعت در دمای 43000 درجه سانتیگراد از لیزات رنگدانه‌دار رسوب داده شد. بخش محلول را دور بریزید و غشاء رنگی را در 100 تا 200 میلی‌لیتر تریس-HCl 20 میلی‌مولار (pH 8.0) دوباره معلق کنید و همگن کنید تا هیچ تجمع قابل مشاهده‌ای وجود نداشته باشد. غشای معلق در 20 میلی‌مولار تریس-هیدروکلراید (pH 8.0) (Anatrace، ایالات متحده آمریکا) حاوی 2٪ (w/v) β-DDM به مدت 1 ساعت در تاریکی در دمای 4 درجه سانتیگراد با هم زدن ملایم انکوبه شد. سپس در دمای 70 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا 150000 RCF در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت حل شود تا مواد نامحلول باقیمانده حذف شوند.
غشای حل‌کننده از سویه ΔpufW به یک ستون تبادل یونی DEAE Sepharose با حجم 50 میلی‌لیتر با سه حجم ستون (CV) از بافر اتصال [20 میلی‌مولار tris-HCl (pH 8.0) حاوی 0.03٪ (w/v) β-DDM] اعمال شد. ستون را با دو بافر اتصال CV و سپس ستون را با دو بافر اتصال حاوی 50 میلی‌مولار NaCl بشویید. کمپلکس RC-LH116 با شیب خطی 150 تا 300 میلی‌مولار NaCl (در بافر اتصال) با 1.75 CV شسته شد و کمپلکس اتصال باقی‌مانده با یک بافر اتصال حاوی 300 میلی‌مولار NaCl با 0.5 CV شسته شد. طیف جذبی را بین ۲۵۰ تا ۱۰۰۰ نانومتر جمع‌آوری کنید، بخشی را که نسبت جذب (A880/A280) آن بیشتر از ۱ است در ۸۸۰ تا ۲۸۰ نانومتر نگه دارید، آن را دو بار در بافر اتصال رقیق کنید و دوباره از همین روش روی ستون DEAE در مورد خالص‌سازی استفاده کنید. بخش‌هایی را که نسبت‌های A880/A280 آنها بالاتر از ۱.۷ و نسبت‌های A880/A805 آنها بالاتر از ۳.۰ است رقیق کنید، دور سوم تبادل یونی را انجام دهید و بخش‌هایی را که نسبت‌های A880/A280 آنها بالاتر از ۲.۲ و نسبت‌های A880/A805 آنها بالاتر از ۵.۰ است، نگه دارید. کمپلکس تا حدی خالص‌شده در یک فیلتر سانتریفیوژ Amicon 100000 با وزن مولکولی (MWCO) (Merck، انگلستان) تا حجم تقریبی 2 میلی‌لیتر تغلیظ شد و روی یک ستون حذف با اندازه Superdex 200 16/600 (GE Healthcare، ایالات متحده) حاوی 200 میلی‌مولار بافر NaCl بارگذاری شد و سپس در همان بافر با فشار 1.5 ولت (CV) شستشو داده شد. طیف‌های جذبی بخش حذف با اندازه را جمع‌آوری کنید و طیف‌های جذبی را با نسبت‌های A880/A280 بیش از 2.4 و نسبت‌های A880/A805 بیش از 5.8 تا 100 A880 متمرکز کنید و بلافاصله از آنها برای تهیه یا نگهداری شبکه cryo-TEM استفاده کنید. در دمای -80 درجه سانتیگراد تا زمان نیاز نگهداری شود.
غشای حل‌کننده از سویه PufW-His به یک ستون 20 میلی‌لیتری HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 میلی‌مولار tris-HCl (pH 8.0) حاوی 200 میلی‌مولار NaCl و 0.03٪ (w/w)) در بافر IMAC (GE Healthcare) اعمال شد. v) β-DDM]. ستون با پنج CV بافر IMAC و سپس با پنج CV بافر IMAC حاوی 10 میلی‌مولار هیستیدین شسته شد. کمپلکس اصلی با پنج بافر IMAC حاوی 100 میلی‌مولار هیستیدین از ستون شسته شد. بخش حاوی کمپلکس RC-LH114-W در یک مخزن همزن‌دار مجهز به فیلتر Amicon 100,000 MWCO (Merck، انگلستان) تا حجم تقریبی 10 میلی‌لیتر تغلیظ شده، 20 بار با بافر اتصال رقیق شده و سپس به 25 میلی‌لیتر اضافه می‌شود. در ستون DEAE Sepharose، از قبل از چهار CV متصل به بافر استفاده می‌شود. ستون را با چهار بافر اتصال CV بشویید، سپس کمپلکس را روی هشت CV با شیب خطی 0 تا 100 میلی‌مولار NaCl (در بافر اتصال) و چهار CV باقی‌مانده حاوی 100 میلی‌مولار بافر اتصال، شستشو دهید. کمپلکس‌های باقیمانده که روی کلرید سدیم همراه با نسبت A880/A280 بالاتر از 2.4 و نسبت A880/A805 بالاتر از 4.6 شسته شدند، در یک فیلتر گریز از مرکز Amicon 100,000 MWCO تا حجم تقریبی 2 میلی‌لیتر تغلیظ شدند و از قبل با ستون حذف Superdex 200 با اندازه 16/600 بافر 1.5 CV IMAC پر شدند و سپس در همان بافر با 1.5 CV شستشو داده شدند. طیف‌های جذبی بخش‌های حذف اندازه را جمع‌آوری کرده و طیف‌های جذبی با نسبت‌های A880/A280 بیش از 2.1 و نسبت‌های A880/A805 بیش از 4.6 را تا 100 A880 متمرکز کنید، که بلافاصله برای تهیه شبکه TEM منجمد استفاده می‌شوند یا تا زمان نیاز در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شوند.
برای تهیه شبکه‌های TEM در دمای پایین، از یک فریزر غوطه‌وری Leica EM GP استفاده شد. کمپلکس در بافر IMAC تا غلظت A880 معادل 50 رقیق شد و سپس 5 میکرولیتر از آن روی یک توری مسی با پوشش کربنی QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, UK) که به تازگی تخلیه الکتریکی شده بود، بارگذاری شد. شبکه را به مدت 30 ثانیه در دمای 20 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 60٪ انکوبه کنید، سپس آن را به مدت 3 ثانیه خشک کنید و در نهایت آن را در اتان مایع در دمای -176 درجه سانتیگراد فرونشانید.
داده‌های کمپلکس RC-LH114-W در eBIC (مرکز تصویربرداری زیستی الکترونیکی) (منبع نور الماس بریتانیا) با میکروسکوپ Titan Krios ثبت شد که با ولتاژ شتاب‌دهنده ۳۰۰ کیلوولت، با بزرگنمایی اسمی ۱۳۰۰۰۰ برابر و انرژی - شکاف ۲۰ eV را انتخاب کنید. از Gatan 968 GIF Quantum با آشکارساز پیک K2 برای ثبت تصاویر در حالت شمارش برای جمع‌آوری داده‌ها استفاده شد. اندازه پیکسل کالیبره شده ۱.۰۴۸ آنگستروم و میزان دوز ۳.۸۳ e-Å-۲s-۱ است. فیلم را در ۱۱ ثانیه جمع‌آوری و به ۴۰ قسمت تقسیم کردم. از ناحیه پوشش داده شده با کربن برای فوکوس مجدد میکروسکوپ استفاده کنید و سپس از هر سوراخ سه فیلم جمع‌آوری کنید. در مجموع، ۳۱۳۰ فیلم جمع‌آوری شد که مقادیر فوکوس زدایی بین -۱ و -۳μm داشتند.
داده‌های مربوط به کمپلکس RC-LH116 با استفاده از همان میکروسکوپ در آزمایشگاه زیست‌ساختار آستربری (دانشگاه لیدز، انگلستان) جمع‌آوری شد. داده‌ها در حالت شمارش با بزرگنمایی ۱۳۰ کیلوژول جمع‌آوری شدند و اندازه پیکسل با دوز ۴.۶ e-Å-2s-1 روی ۱.۰۶۵ آنگستروم کالیبره شد. فیلم در ۱۲ ثانیه ضبط و به ۴۸ قسمت تقسیم شد. در مجموع، ۳۳۵۹ فیلم با مقادیر فوکوس‌زدایی بین -۱ تا -۳ میکرومتر جمع‌آوری شد.
تمام پردازش داده‌ها در خط لوله Relion 3.0 (42) انجام می‌شود. از Motioncorr 2 (43) برای اصلاح حرکت پرتو با وزن‌دهی دوز استفاده کنید و سپس از CTFFIND 4.1 (44) برای تعیین پارامتر CTF (تابع انتقال کنتراست) استفاده کنید. تصاویر میکروسکوپی معمولی پس از این مراحل پردازش اولیه در شکل 2 نشان داده شده است. S16. الگوی انتخاب خودکار با انتخاب دستی حدود 250 پیکسل از 1000 ذره در یک قاب 250 پیکسلی و بدون طبقه‌بندی دوبعدی (2D) مرجع ایجاد می‌شود، در نتیجه آن طبقه‌بندی‌هایی که آلودگی نمونه را برآورده می‌کنند یا هیچ ویژگی قابل تشخیصی ندارند، رد می‌شوند. سپس، انتخاب خودکار روی تمام میکروفوتوگراف‌ها انجام شد و RC-LH114-W 849359 ذره و کمپلکس RC-LH116 476547 ذره داشت. تمام ذرات انتخاب‌شده تحت دو مرحله طبقه‌بندی دوبعدی غیرمرجع قرار گرفته‌اند و پس از هر بار اجرا، ذراتی که با ناحیه کربن، آلودگی نمونه، بدون ویژگی‌های واضح یا ذرات با همپوشانی قوی برخورد می‌کنند، رد می‌شوند که در نتیجه به ترتیب 772033 (90.9٪) و 359678 (75.5٪) ذرات برای طبقه‌بندی سه‌بعدی RC-LH114-W و RC-LH116 استفاده می‌شوند. مدل مرجع سه‌بعدی اولیه با استفاده از روش گرادیان نزولی تصادفی تولید شد. با استفاده از مدل اولیه به عنوان مرجع، ذرات انتخاب‌شده در چهار دسته در حالت سه‌بعدی طبقه‌بندی می‌شوند. با استفاده از مدل موجود در این دسته به عنوان مرجع، پالایش سه‌بعدی را روی ذرات در بزرگترین دسته انجام دهید، سپس از فیلتر پایین‌گذر اولیه 15Å برای پوشش ناحیه حلال استفاده کنید، 6 پیکسل لبه نرم اضافه کنید و پیکسل‌ها را برای اصلاح تابع انتقال مدولاسیون پیک Gatan K2 آشکارساز بالایی، پس‌پردازش کنید. برای مجموعه داده RC-LH114-W، این مدل اولیه با حذف چگالی قوی در لبه‌های ماسک (که از چگالی کمپلکس اصلی در UCSF Chimera جدا شده است) اصلاح شد. مدل‌های حاصل (وضوح RC-LH114-W و RC-LH116 به ترتیب 3.91 و 4.16 آنگستروم است) به عنوان مرجع برای دور دوم طبقه‌بندی سه‌بعدی استفاده می‌شوند. ذرات مورد استفاده در کلاس سه‌بعدی اولیه گروه‌بندی می‌شوند و همبستگی قوی با همسایگی ندارند. همپوشانی یا عدم وجود ویژگی‌های ساختاری واضح. پس از دور دوم طبقه‌بندی سه‌بعدی، دسته‌ای با بالاترین وضوح انتخاب شد [برای RC-LH114-W، یک دسته شامل 377703 ذره (44.5٪) است، برای RC-LH116، دو دسته وجود دارد که در مجموع 260752 ذره (54.7٪) هستند، که در آنها فقط زمانی که پس از چرخش اولیه با کمی اختلاف تراز می‌شوند، یکسان هستند]. ذرات انتخاب‌شده در یک جعبه ۴۰۰ پیکسلی دوباره استخراج شده و با پالایش سه‌بعدی پالایش می‌شوند. ماسک حلال با استفاده از فیلتر پایین‌گذر اولیه ۱۵ آنگستروم، بسط نقشه ۳ پیکسلی و ماسک نرم ۳ پیکسلی تولید می‌شود. با استفاده از پالایش CTF برای هر ذره، تصحیح حرکت برای هر ذره و دور دوم پالایش CTF برای هر ذره، پالایش سه‌بعدی، پوشش حلال و پس‌پردازش پس از هر مرحله برای پالایش بیشتر بافت حاصل انجام می‌شود. با استفاده از مقدار حد آستانه FSC (ضریب همبستگی پوسته فوریه) ۰.۱۴۳، وضوح مدل‌های نهایی RC-LH114-W و RC-LH116 به ترتیب ۲.۶۵ و ۲.۸۰ آنگستروم است. منحنی FSC مدل نهایی در شکل ۲ نشان داده شده است. S17.
تمام توالی‌های پروتئینی از UniProtKB دانلود می‌شوند: LH1-β (PufB؛ UniProt ID: Q6N9L5)؛ LH1-α (PufA؛ UniProtID: Q6N9L4)؛ RC-L (PufL؛ UniProt ID: O83005)؛ RC-M (PufM؛ UniProt ID: A0A4Z7)؛ RC-H (PuhA؛ UniProt ID: A0A4Z9)؛ Protein-W (PufW؛ UniProt ID: Q6N1K3). از SWISS-MODEL (45) برای ساخت یک مدل همولوژی RC استفاده شد که شامل توالی‌های پروتئینی RC-L، RC-M و ​​RC-H و ساختار کریستالی Rba است. از sphaeroides RC به عنوان الگو استفاده شد (PDB ID: 5LSE) (46). با استفاده از ابزار «نقشه برازش» در UCSF Chimera، مدل تولید شده را بر روی نقشه (47) برازش دهید، ساختار پروتئین را بهبود بخشید و کوفاکتور [4×BChl a (نام باقیمانده کتابخانه مونومر = BCL)، 2×BPh a (BPH)، یک یا دو نوع UQ10 (U10)، یک آهن غیر هم (Fe) و یک 3،4-دی هیدروهگزا کربونیل کولین (QAK)] را با استفاده از Coot (48) اضافه کنید. از آنجایی که QAK در کتابخانه مونومر موجود نیست، با استفاده از ابزار eLBOW در PHENIX (49) پارامتری شد.
در مرحله بعد، زیر واحد LH1 ساخته شد. در ابتدا، از ابزار ساخت خودکار در PHENIX (49) برای ساخت خودکار بخشی از توالی LH1 با استفاده از نقشه و توالی‌های پروتئینی LH1-α و LH1-β به عنوان ورودی استفاده شد. کامل‌ترین زیر واحد LH1 را انتخاب کنید، آن را استخراج کرده و در Coot بارگذاری کنید، توالی گمشده را به صورت دستی به آن اضافه کنید و قبل از اضافه کردن دو BCl a (BCL) و یک اسپیریلوکسانتین (CRT) [مطابق با Rps مربوطه]، کل ساختار را به صورت دستی اصلاح کنید. چگالی کمپلکس LH1 و محتوای کاروتنوئید شناخته شده. گونه‌ها (17)]. زیر واحد کامل LH1 را کپی کنید و از "ابزار نقشه داکینگ" UCSF Chimera برای اتصال به ناحیه غیر مدل مجاور با چگالی LH1 استفاده کنید و سپس آن را در Coot اصلاح کنید. این فرآیند را تا زمانی که تمام زیر واحد‌های LH1 مدل‌سازی شوند، تکرار کنید. برای ساختار RC-LH114-W، با استخراج چگالی تخصیص نیافته در Coot، پروتئین از اجزای غیرپروتئینی باقی‌مانده در نقشه USCF Chimera جدا می‌شود و از ابزار Autobuild برای ایجاد مدل اولیه و مدل‌سازی زیرواحدهای باقی‌مانده (پروتئین-W) استفاده می‌شود. در PHENIX (49). هر توالی از دست رفته را به مدل حاصل در Coot (48) اضافه کنید و سپس کل زیرواحد را به صورت دستی اصلاح کنید. چگالی تخصیص نیافته باقی‌مانده با ترکیب لیپیدها (شناسه کتابخانه مونومر PDB از CDL = CDL، POPC = 6PL و POPG = PGT)، شوینده β-DDM (LMT) و مولکول‌های UQ10 (U10) مطابقت دارد. از بهینه‌سازی PHENIX (49) و بهینه‌سازی دستی در Coot (48) برای تکمیل مدل اولیه کامل استفاده کنید تا زمانی که آمار مدل و کیفیت بصری برازش بیشتر بهبود نیابد. در نهایت، از LocScale (50) برای دقیق‌تر کردن نقشه محلی استفاده کنید و سپس چندین چرخه دیگر مدل‌سازی چگالی تخصیص نیافته و بهینه‌سازی خودکار و دستی را انجام دهید.
پپتیدها، کوفاکتورها و سایر لیپیدها و کینون‌های مربوطه که در چگالی‌های مربوطه خود قرار گرفته‌اند، در شکل‌های 1 و 2 نشان داده شده‌اند. S18 تا S23. اطلاعات آماری مدل نهایی در جدول S1 نشان داده شده است.
مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد، طیف‌های جذبی UV/Vis/NIR با استفاده از اسپکتروفتومتر Cary60 (Agilent، ایالات متحده آمریکا) در فواصل 1 نانومتر از 250 نانومتر تا 1000 نانومتر و زمان ادغام 0.1 ثانیه جمع‌آوری شدند.
نمونه را در یک کووت کوارتز با مسیر ۲ میلی‌متری تا A880 به مقدار ۱ رقیق کنید و طیف جذبی بین ۴۰۰ تا ۱۰۰۰ نانومتر را جمع‌آوری کنید. طیف‌های دورنگ‌نمای دایره‌ای با استفاده از یک اسپکتروپلاریمتر Jasco 810 (Jasco، ژاپن) در فواصل ۱ نانومتری بین ۴۰۰ نانومتر و ۹۵۰ نانومتر با سرعت اسکن ۲۰ نانومتر در دقیقه جمع‌آوری شدند.
ضریب خاموشی مولی با رقیق کردن کمپلکس هسته تا A880 تقریباً 50 تعیین می‌شود. حجم 10 میکرولیتر را در 990 میکرولیتر بافر اتصال یا متانول رقیق کنید و طیف جذبی را بلافاصله جمع‌آوری کنید تا تخریب BChl به حداقل برسد. محتوای BChl هر نمونه متانول با ضریب خاموشی در 771 نانومتر 54.8 میلی‌مولار-1 سانتی‌متر-1 محاسبه شد و ضریب خاموشی تعیین شد (51). غلظت BChl اندازه‌گیری شده را بر 32 (RC-LH114-W) یا 36 (RC-LH116) تقسیم کنید تا غلظت کمپلکس هسته تعیین شود، که سپس برای تعیین طیف جذبی همان نمونه جمع‌آوری شده در بافر استفاده می‌شود. ضریب خاموشی موازی. سه اندازه‌گیری مکرر برای هر نمونه انجام شد و میانگین جذب BChl Qy max برای محاسبه استفاده شد. ضریب خاموشی RC-LH114-W که در طول موج ۸۷۸ نانومتر اندازه‌گیری شده، ۳۲۸۰±۱۴۰ میلی‌مولار بر سانتی‌متر است، در حالی که ضریب خاموشی RC-LH116 که در طول موج ۸۸۰ نانومتر اندازه‌گیری شده، ۳۸۰۰±۳۰ میلی‌مولار بر سانتی‌متر است.
UQ10 طبق روش ذکر شده در (52) تعیین مقدار شد. به طور خلاصه، HPLC فاز معکوس (RP-HPLC) با استفاده از سیستم HPLC Agilent 1200 انجام شد. حدود 0.02 نانومول از RC-LH116 یا RC-LH114-W را در 50 میکرولیتر از محلول 50:50 متانول:کلروفرم حاوی 0.02٪ (وزنی/حجمی) کلرید فریک حل کنید و محلول Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm از پیش متعادل شده را در 1 میلی لیتر در دقیقه در دمای 40 درجه سانتیگراد در حلال HPLC (80:20 متانول:2-پروپانول) روی ستون ×25 سانتی متر حل کنید. شستشوی ایزوکراتیک را در حلال HPLC انجام دهید تا جذب در 275 نانومتر (UQ10)، 450 نانومتر (کاروتنوئیدها) و 780 نانومتر (BChl) به مدت 1 ساعت بررسی شود. پیک موجود در کروماتوگرام ۲۷۵ نانومتر در زمان ۲۵.۵ دقیقه ادغام شد که حاوی هیچ ترکیب قابل تشخیص دیگری نبود. ناحیه ادغام شده برای محاسبه مقدار مولی UQ10 استخراج شده با ارجاع به منحنی کالیبراسیون محاسبه شده از تزریق استانداردهای خالص از ۰ تا ۵.۸ نانومول (شکل S14) استفاده می‌شود. هر نمونه در سه تکرار تجزیه و تحلیل شد و خطای گزارش شده مربوط به انحراف معیار میانگین است.
محلولی حاوی کمپلکس RC-LH1 با حداکثر جذب Qy 0.1 با 30 میکرومولار سیتوکروم قلب اسب احیا شده c2 (مرک، انگلستان) و 0 تا 50 میکرومولار MUQ2 (مرک، انگلستان) تهیه شد. سه نمونه 1 میلی‌لیتری از هر غلظت UQ2 تهیه و به مدت یک شب در تاریکی در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند تا از سازگاری کامل با تاریکی قبل از اندازه‌گیری اطمینان حاصل شود. محلول در یک اسپکتروفتومتر مدولار OLIS RSM1000 مجهز به توری شعله/خط 300 نانومتر، شکاف‌های ورودی 1.24 میلی‌متر، شکاف‌های میانی 0.12 میلی‌متر و شکاف‌های خروجی 0.6 میلی‌متر بارگذاری شد. یک فیلتر عبور طولانی 600 نانومتری در ورودی لوله نوری نمونه و لوله فتومولتی‌پلایر مرجع قرار داده شده است تا نور تحریک را حذف کند. جذب در طول موج 550 نانومتر با زمان ادغام 0.15 ثانیه بررسی شد. نور تحریک از LED 880 نانومتری M880F2 (دیود ساطع کننده نور) (Thorlabs Ltd.، انگلستان) از طریق یک کابل فیبر نوری با شدت 90٪ و از طریق یک کنترل کننده DC2200 (Thorlabs Ltd.، انگلستان) ساطع می‌شود و با زاویه 90 درجه به منبع نور تابیده می‌شود. پرتو اندازه‌گیری در خلاف جهت آینه قرار می‌گیرد تا هر نوری را که در ابتدا توسط نمونه جذب نشده است، برگرداند. 10 ثانیه قبل از روشن شدن 50 ثانیه، میزان جذب را کنترل کنید. سپس جذب به مدت 60 ثانیه در تاریکی بیشتر کنترل شد تا میزان کاهش خود به خودی سیتوکروم c23+ توسط کینولول ارزیابی شود (برای داده‌های خام به شکل S8 مراجعه کنید).
داده‌ها با برازش یک نرخ اولیه خطی در بازه زمانی 0.5 تا 10 ثانیه (بسته به غلظت UQ2) و میانگین‌گیری از نرخ‌های هر سه نمونه در هر غلظت UQ2 پردازش شدند. غلظت RC-LH1 که توسط ضریب خاموشی مربوطه محاسبه شده بود، برای تبدیل نرخ به بازده کاتالیزوری استفاده شد، که در Origin Pro 2019 (OriginLab، ایالات متحده آمریکا) رسم شد و برای تعیین مقادیر ظاهری Km و Kcat با مدل Michaelis-Menten برازش داده شد.
برای اندازه‌گیری‌های جذب گذرا، نمونه RC-LH1 در بافر IMAC حاوی 50 میلی‌مولار آسکوربات سدیم (Merck، ایالات متحده) و 0.4 میلی‌مولار تربوتین (Merck، ایالات متحده) تا غلظت تقریبی 2 میکرومولار رقیق شد. اسید آسکوربیک به عنوان دهنده الکترون قربانی و ترت-بوتاکلوفن به عنوان مهارکننده QB استفاده می‌شوند تا اطمینان حاصل شود که دهنده اصلی RC در طول فرآیند اندازه‌گیری احیا شده (یعنی فتواکسید نشده) باقی می‌ماند. تقریباً 3 میلی‌لیتر نمونه به یک سلول چرخان سفارشی (با قطر حدود 0.1 متر، 350 دور در دقیقه) با طول مسیر نوری 2 میلی‌متر اضافه می‌شود تا اطمینان حاصل شود که نمونه در مسیر لیزر، زمان کافی برای سازگاری با تاریکی بین پالس‌های تحریک را دارد. از پالس‌های لیزر تقریباً ۱۰۰ فمتوثانیه‌ای برای تقویت سیستم لیزر Ti: Sapphire (Spectra Physics، ایالات متحده) استفاده کنید تا نمونه را در طول موج ۸۸۰ نانومتر با نرخ تکرار ۱ کیلوهرتز (۲۰ نانوژول برای NIR یا ۱۰۰ نانوژول برای Vis) تحریک کنید. قبل از جمع‌آوری داده‌ها، نمونه را حدود ۳۰ دقیقه در معرض نور تحریک قرار دهید. قرار گرفتن در معرض نور باعث غیرفعال شدن QA می‌شود (احتمالاً یک یا دو بار QA را کاهش می‌دهد). اما لطفاً توجه داشته باشید که این فرآیند برگشت‌پذیر است زیرا پس از یک دوره طولانی سازگاری با تاریکی، RC به آرامی به فعالیت QA باز می‌گردد. از یک طیف‌سنج Helios (Ultrafast Systems، ایالات متحده) برای اندازه‌گیری طیف‌های گذرا با زمان تأخیر ۱۰- تا ۷۰۰۰ پیکوثانیه استفاده شد. از نرم‌افزار Surface Xplorer (Ultrafast Systems، ایالات متحده) برای جدا کردن مجموعه داده‌ها، سپس ادغام و استانداردسازی استفاده کنید. از بسته نرم‌افزاری CarpetView (Light Conversion Ltd.، لیتوانی) برای استفاده از مجموعه داده‌های ترکیبی جهت به دست آوردن طیف‌های تفاضلی مربوط به واپاشی استفاده کنید، یا از تابعی استفاده کنید که چندین توان را با پاسخ دستگاه کانولوشن می‌کند تا تکامل طیفی تک طول موج را در Origin (OriginLab، ایالات متحده آمریکا) برازش دهد.
همانطور که در بالا ذکر شد (53)، یک فیلم فتوسنتزی حاوی کمپلکس LH1 که فاقد آنتن RC و LH2 محیطی بود، تهیه شد. غشاء در 20 میلی‌مولار تریس (pH 8.0) رقیق شد و سپس در یک کووت کوارتز با مسیر نوری 2 میلی‌متری بارگذاری شد. از یک پالس لیزر 30 نانوژول برای تحریک نمونه در طول موج 540 نانومتر با زمان تأخیر -10 تا 7000 پیکوثانیه استفاده شد. مجموعه داده‌ها را همانطور که برای نمونه Rps.pal توضیح داده شد، پردازش کنید.
غشاء با سانتریفیوژ در 150000 RCF به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد رسوب داده شد و سپس جذب آن در 880 نانومتر در 20 میلی‌مولار تریس-HCl (pH 8.0) و 200 میلی‌مولار NaCl دوباره به حالت تعلیق درآمد. غشاء را با هم زدن آهسته در 2٪ (w/v) β-DDM به مدت 1 ساعت در تاریکی در دمای 4 درجه سانتیگراد حل کنید. نمونه در 100 میلی‌مولار تری اتیل آمونیوم کربنات (pH 8.0) (TEAB؛ مرک، انگلستان) تا غلظت پروتئین 2.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر (آنالیز Bio-Rad) رقیق شد. پردازش بیشتر از روش منتشر شده قبلی (54) انجام شد و با رقیق کردن 50 میکروگرم پروتئین در مجموع 50 میکرولیتر TEAB حاوی 1٪ (w/v) سدیم لورات (مرک، انگلستان) شروع شد. پس از اعمال فراصوت به مدت ۶۰ ثانیه، با ۵ میلی‌مولار تریس(۲-کربوکسی اتیل)فسفین (مرک، انگلستان) در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه احیا شد. برای S-آلکیلاسیون، نمونه را با ۱۰ میلی‌مولار متیل S-متیل تیومتان سولفونات (مرک، انگلستان) انکوبه کنید و آن را از محلول استوک ۲۰۰ میلی‌مولار ایزوپروپانول به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق اضافه کنید. هضم پروتئولیتیک با اضافه کردن ۲ میکروگرم مخلوط تریپسین/اندوپروتئیناز Lys-C (پرومگا انگلستان) انجام شد و به مدت ۳ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد. سورفکتانت لورات با اضافه کردن ۵۰ میکرولیتر اتیل استات و ۱۰ میکرولیتر تری فلوئورو استیک اسید ۱۰٪ (حجمی/حجمی) با درجه LC (TFA؛ ترمو فیشر ساینتیفیک، انگلستان) و ورتکس کردن به مدت ۶۰ ثانیه استخراج شد. جداسازی فاز با سانتریفیوژ در ۱۵۷۰۰ RCF به مدت ۵ دقیقه انجام شد. طبق پروتکل سازنده، از یک ستون اسپین C18 (Thermo Fisher Scientific، انگلستان) برای آسپیراسیون و نمک‌زدایی دقیق فاز پایینی حاوی پپتید استفاده شد. پس از خشک شدن با سانتریفیوژ در خلاء، نمونه در ۰.۵٪ TFA و ۳٪ استونیتریل حل شد و ۵۰۰ نانوگرم با کروماتوگرافی RP نانوجریان همراه با طیف‌سنجی جرمی با استفاده از پارامترهای سیستم که قبلاً شرح داده شده بود، تجزیه و تحلیل شد.
برای شناسایی و تعیین مقدار پروتئین از MaxQuant نسخه 1.5.3.30 (56) استفاده کنید تا پایگاه داده پروتئوم Rps. palustris را جستجو کنید (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). داده‌های پروتئومیکس طیف‌سنجی جرمی از طریق مخزن شریک PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) تحت شناسه مجموعه داده PXD020402 در ProteomeXchange Alliance ذخیره شده است.
برای تجزیه و تحلیل با RPLC همراه با طیف‌سنجی جرمی یونیزاسیون الکترواسپری، کمپلکس RC-LH1 از Rps نوع وحشی تهیه شد. با استفاده از روش منتشر شده قبلی (16)، غلظت پروتئین تولید شده در سلول‌های پالوستریس 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر در 20 میلی‌مولار Hepes (pH 7.8)، 100 میلی‌مولار NaCl و 0.03٪ (w/v) β- (Bio-Rad analysis)) DDM بود. طبق پروتکل سازنده، از کیت خالص‌سازی 2D (GE Healthcare، ایالات متحده آمریکا) برای استخراج 10 میکروگرم پروتئین با روش رسوب‌دهی استفاده کنید و رسوب را در 20 میکرولیتر 60٪ (v/v) اسید فرمیک (FA)، 20٪ (v/v) استونیتریل و 20٪ (v/v) آب حل کنید. پنج میکرولیتر با RPLC (Dionex RSLC) همراه با طیف‌سنجی جرمی (Maxis UHR-TOF، Bruker) تجزیه و تحلیل شد. برای جداسازی در دمای 60 درجه سانتیگراد و 100 میکرولیتر بر دقیقه، از ستون MabPac 1.2×100 میلی‌متر (Thermo Fisher Scientific, UK) با گرادیان 85% (حجمی/حجمی) حلال A [محلول آبی 0.1% (حجمی/حجمی) FA و 0.02% (حجمی/حجمی) TFA] به 85% (حجمی/حجمی) حلال B [0.1% (حجمی/حجمی) FA و 0.02% (حجمی/حجمی) در 90% (حجمی/حجمی) TFA] استفاده کنید. با استفاده از منبع یونیزاسیون الکترواسپری استاندارد و پارامترهای پیش‌فرض برای بیش از 60 دقیقه، طیف‌سنج جرمی 100 تا 2750 m/z (نسبت جرم به بار) را به دست می‌آورد. با کمک ابزار FindPept پورتال منابع بیوانفورماتیک ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/)، طیف جرمی را به زیر واحدهای کمپلکس نگاشت کنید.
سلول‌ها به مدت 72 ساعت تحت نور 100 میلی‌لیتر NF - کم (10 میکرومولار بر متر مربع در ثانیه)، متوسط ​​(30 میکرومولار بر متر مربع در ثانیه) یا زیاد (300 میکرومولار بر متر مربع در ثانیه) - رشد داده شدند. محیط کشت M22 (محیط کشت M22 که در آن سولفات آمونیوم حذف شده و سدیم سوکسینات با سدیم استات جایگزین شده است) در یک بطری 100 میلی‌لیتری در پیچ (23) قرار داده شد. در پنج چرخه 30 ثانیه‌ای، دانه‌های شیشه‌ای 0.1 میکرونی با نسبت حجمی 1:1 برای لیز کردن سلول‌ها دانه‌بندی شدند و به مدت 5 دقیقه روی یخ سرد شدند. مواد نامحلول، سلول‌های سالم و دانه‌های شیشه‌ای با سانتریفیوژ در 16000 RCF به مدت 10 دقیقه در یک میکروسانتریفیوژ رومیزی حذف شدند. غشاء در یک روتور Ti 70.1 با 100000 RCF در 20 میلی‌مولار تریس-HCl (pH 8.0) با گرادیان ساکارز 40/15٪ (w/w) به مدت 10 ساعت جداسازی شد.
همانطور که در کار قبلی ما توضیح داده شد، تشخیص ایمنی برچسب His روی PufW (16). به طور خلاصه، کمپلکس هسته خالص شده (11.8 نانومولار) یا غشای حاوی همان غلظت RC (که با اکسیداسیون، تفریق طیف اختلاف کاهش یافته و تطبیق بار روی ژل رنگ‌آمیزی شده تعیین می‌شود) در بافر بارگذاری 2x SDS (مرک، انگلستان) دو بار رقیق شد. پروتئین‌ها روی یک ژل NuPage 12٪ bis-tris (ترمو فیشر ساینتیفیک، انگلستان) جداسازی شدند. یک ژل با Coomassie Brilliant Blue (بیو-راد، انگلستان) رنگ‌آمیزی شد تا زیر واحد RC-L بارگذاری و مشاهده شود. پروتئین روی ژل دوم برای سنجش ایمنی به غشای پلی وینیلیدین فلوراید فعال شده با متانول (ترمو فیشر ساینتیفیک، انگلستان) منتقل شد. غشای PVDF در 50 میلی‌مولار تریس-هیدروکلراید (pH 7.6)، 150 میلی‌مولار سدیم کلرید، 0.2% (حجمی/حجمی) توئین-20 و 5% (وزنی/حجمی) پودر شیر بدون چربی مسدود شد و سپس به مدت 4 ساعت با آنتی‌بادی اولیه ضد هیس (در بافر آنتی‌بادی رقیق‌شده [50 میلی‌مولار تریس-هیدروکلراید (pH 7.6)، 150 میلی‌مولار سدیم کلرید و 0.05% (حجمی/حجمی) توئین-20] در محلول 1:1000 A190-114A، آزمایشگاه‌های بتیل، ایالات متحده آمریکا) انکوبه شد. پس از ۳ بار شستشو به مدت ۵ دقیقه در بافر آنتی‌بادی، غشاء با آنتی‌بادی ثانویه ضد موش ترب کوهی پراکسیداز (سیگما-آلدریچ، انگلستان) (رقیق شده به نسبت ۱:۱۰۰۰۰ در بافر آنتی‌بادی) ترکیب شد. برای تشخیص (۵ دقیقه پس از ۳ بار شستشو در بافر آنتی‌بادی) با استفاده از سوبسترای کمی‌لومینسانس WESTAR ETA C 2.0 (سیاناژن، ایتالیا) و Amersham Imager 600 (GE Healthcare، انگلستان) انکوبه شد.
با رسم توزیع شدت هر ژل رنگ‌آمیزی شده یا لاین ایمونواسی، انتگرال‌گیری از ناحیه زیر پیک و محاسبه نسبت شدت RC-L (ژل رنگ‌آمیزی شده) و پروتئین-W (ایمونواسی)، در ImageJ (57) تصویر را پردازش کنید. این نسبت‌ها با فرض اینکه نسبت RC-L به پروتئین-W در نمونه خالص RC-LH114-W برابر با 1:1 است و نرمال‌سازی کل مجموعه داده‌ها بر این اساس، به نسبت‌های مولی تبدیل شدند.
برای مطالب تکمیلی این مقاله، لطفاً به http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 مراجعه کنید.
این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution توزیع شده است. این مقاله اجازه استفاده، توزیع و تکثیر نامحدود در هر رسانه‌ای را می‌دهد، مشروط بر اینکه به اثر اصلی به درستی استناد شود.
توجه: ما فقط از شما می‌خواهیم آدرس ایمیل خود را ارائه دهید تا شخصی که به صفحه توصیه می‌کنید بداند که می‌خواهید ایمیل را ببیند و اینکه هرزنامه نیست. ما هیچ آدرس ایمیلی را ثبت نخواهیم کرد.
این سوال برای بررسی اینکه آیا شما بازدیدکننده هستید یا خیر و جلوگیری از ارسال خودکار هرزنامه استفاده می‌شود.
دیوید جی. کی. سوینزبری، پارک کیان، فیلیپ جی. جکسون، کیتلین ام. فاریس، داریوش ام. نیدزویدزکی، الیزابت سی. مارتین، دیوید ای. فارمر، لورنا ای. مالون، ربکا اف. تامپسون، نیل ای. رانسون، دنیل پی. کانیف، مارک جی. دیکمن، دیویی هولتن، کریستین کرمایر، اندرو هیچکاک، سی. نیل هانتر
ساختار با وضوح بالای کمپلکس تله نوری ۱ در مرکز واکنش، بینش‌های جدیدی در مورد دینامیک کینون‌ها ارائه می‌دهد.
دیوید جی. کی. سوینزبری، پارک کیان، فیلیپ جی. جکسون، کیتلین ام. فاریس، داریوش ام. نیدزویدزکی، الیزابت سی. مارتین، دیوید ای. فارمر، لورنا ای. مالون، ربکا اف. تامپسون، نیل ای. رانسون، دنیل پی. کانیف، مارک جی. دیکمن، دیویی هولتن، کریستین کرمایر، اندرو هیچکاک، سی. نیل هانتر
ساختار با وضوح بالای کمپلکس تله نوری ۱ در مرکز واکنش، بینش‌های جدیدی در مورد دینامیک کینون‌ها ارائه می‌دهد.
©2021 انجمن آمریکایی برای پیشرفت علم. تمامی حقوق محفوظ است AAAS شریک HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER است. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.