آدرس فعلی: کلن ۵۰۹۳۱، آلمان، خوشه تحقیقات عالی کلن در مورد پاسخ به استرس سلولی در بیماری‌های مرتبط با پیری (CECAD).
تخریب عصبی بیماری‌های میتوکندریایی برگشت‌ناپذیر تلقی می‌شود زیرا انعطاف‌پذیری متابولیکی نورون‌ها محدود است، اما تأثیر اختلال عملکرد میتوکندری بر استقلال سلولی متابولیسم نورونی در بدن به خوبی درک نشده است. در اینجا، ما پروتئوم اختصاصی سلول نورون‌های پورکنژ با کمبود پیشرونده OXPHOS ناشی از اختلال در دینامیک همجوشی میتوکندری را معرفی می‌کنیم. ما دریافتیم که اختلال عملکرد میتوکندری باعث تغییر عمیقی در حوزه پروتئومیکس می‌شود که در نهایت منجر به فعال شدن متوالی برنامه‌های متابولیکی دقیق قبل از مرگ سلولی می‌شود. به طور غیرمنتظره‌ای، ما القای آشکار پیروات کربوکسیلاز (PCx) و سایر آنزیم‌های ضد پیری را که واسطه‌های چرخه TCA را تکمیل می‌کنند، تعیین کردیم. مهار PCx استرس اکسیداتیو و تخریب عصبی را تشدید می‌کند، که نشان می‌دهد تصلب شرایین در نورون‌های فاقد OXPHOS اثر محافظتی دارد. بازیابی همجوشی میتوکندری در نورون‌های تخریب‌شده نهایی، این ویژگی‌های متابولیکی را به طور کامل معکوس می‌کند و در نتیجه از مرگ سلولی جلوگیری می‌کند. یافته‌های ما مسیرهای ناشناخته‌ای را شناسایی می‌کند که به اختلال عملکرد میتوکندری مقاومت می‌دهند و نشان می‌دهند که حتی در مراحل پایانی بیماری، می‌توان روند تخریب عصبی را معکوس کرد.
نقش اصلی میتوکندری در حفظ متابولیسم انرژی عصبی با علائم عصبی گسترده مرتبط با بیماری‌های میتوکندریایی انسان مورد تأکید قرار می‌گیرد. اکثر این بیماری‌ها ناشی از جهش‌های ژنی هستند که بیان ژن میتوکندریایی (1، 2) یا تخریب ژن مربوط به دینامیک میتوکندریایی را تنظیم می‌کنند که به طور غیرمستقیم بر پایداری DNA میتوکندریایی (mtDNA) تأثیر می‌گذارند (3، 4). کار در مدل‌های حیوانی نشان داده است که در پاسخ به اختلال عملکرد میتوکندری در بافت‌های اطراف، مسیرهای متابولیکی محافظه‌کارانه (5-7) می‌توانند فعال شوند که اطلاعات مهمی را برای درک عمیق پاتوژنز این بیماری‌های پیچیده فراهم می‌کند. در مقابل، درک ما از تغییرات متابولیکی انواع خاص سلول ناشی از نارسایی کلی تولید آدنوزین تری فسفات (ATP) میتوکندریایی مغز اساسی است (8)، که بر نیاز به شناسایی اهداف درمانی که می‌توانند برای پیشگیری یا جلوگیری از بیماری استفاده شوند، تأکید می‌کند. جلوگیری از تخریب عصبی (9). کمبود اطلاعات این واقعیت است که سلول‌های عصبی به طور گسترده در مقایسه با انواع سلول‌های بافت‌های اطراف، انعطاف‌پذیری متابولیکی بسیار محدودی دارند (10). با توجه به اینکه این سلول‌ها نقش محوری در هماهنگی تأمین متابولیت‌ها برای نورون‌ها جهت ارتقای انتقال سیناپسی و پاسخ به آسیب و شرایط بیماری دارند، توانایی تطبیق متابولیسم سلولی با شرایط چالش‌برانگیز بافت مغز تقریباً محدود به سلول‌های گلیال است (11-14). علاوه بر این، ناهمگونی سلولی ذاتی بافت مغز تا حد زیادی مانع مطالعه تغییرات متابولیکی می‌شود که در زیرگروه‌های خاص نورونی رخ می‌دهد. در نتیجه، اطلاعات کمی در مورد پیامدهای دقیق سلولی و متابولیکی اختلال عملکرد میتوکندری در نورون‌ها وجود دارد.
به منظور درک پیامدهای متابولیکی اختلال عملکرد میتوکندری، ما نورون‌های پورکینژ (PNs) را در مراحل مختلف تخریب عصبی ناشی از تخریب همجوشی غشای خارجی میتوکندری (Mfn2) جدا کردیم. اگرچه جهش‌های Mfn2 در انسان با نوعی نوروپاتی حسی حرکتی ارثی شناخته شده به نام Charcot-Marie-Tooth نوع 2A (15) مرتبط است، تخریب شرطی Mfn2 در موش‌ها یک روش شناخته شده برای اختلال عملکرد القای اکسیداسیون فسفوریلاسیون (OXPHOS) است. زیرگروه‌های مختلف نورونی (16-19) و فنوتیپ تخریب عصبی حاصل از آن با علائم عصبی پیشرونده، مانند اختلالات حرکتی (18، 19) یا آتاکسی مخچه‌ای (16) همراه هستند. با استفاده از ترکیبی از روش‌های پروتئومیکس کمی بدون برچسب (LFQ)، متابولومیکس، تصویربرداری و ویروس‌شناسی، نشان می‌دهیم که تخریب عصبی پیشرونده به شدت پیروات کربوکسیلاز (PCx) و سایر عوامل دخیل در تصلب شرایین PNها را در داخل بدن القا می‌کند. بیان آنزیم‌ها. برای تأیید ارتباط این یافته، ما به طور خاص بیان PCx را در PNهای دارای کمبود Mfn2 کاهش دادیم و دریافتیم که این عمل استرس اکسیداتیو را تشدید کرده و تخریب عصبی را تسریع می‌کند، بنابراین ثابت می‌کند که آزواسپرمی باعث مرگ سلولی می‌شود. سازگاری متابولیکی. بیان شدید MFN2 می‌تواند PN تخریب نهایی را با کمبود شدید OXPHOS، مصرف گسترده DNA میتوکندری و شبکه میتوکندری ظاهراً شکسته به طور کامل نجات دهد، که تأکید بیشتری می‌کند که این شکل از تخریب عصبی حتی می‌تواند در مرحله پیشرفته بیماری قبل از مرگ سلولی بهبود یابد.
به منظور تجسم میتوکندری در نورون‌های عصبی فاقد Mfn2، ما از یک سویه موش استفاده کردیم که به میتوکندری‌های وابسته به Cre اجازه می‌دهد تا بیان پروتئین فلورسنت زرد (YFP) (mtYFP) (20) Cre را هدف قرار دهند و مورفولوژی میتوکندری را در داخل بدن بررسی کردیم. ما دریافتیم که تخریب ژن Mfn2 در نورون‌های عصبی منجر به تقسیم تدریجی شبکه میتوکندری می‌شود (شکل S1A) و اولین تغییر در سن 3 هفتگی مشاهده شد. در مقابل، تخریب قابل توجه لایه سلولی نورون عصبی، همانطور که با از دست دادن رنگ‌آمیزی ایمنی کالبیندین نشان داده شده است، تا 12 هفتگی شروع نشد (شکل 1، A و B). عدم تطابق زمانی بین اولین تغییرات در مورفولوژی میتوکندری و شروع قابل مشاهده مرگ نورونی، ما را بر آن داشت تا تغییرات متابولیکی ناشی از اختلال عملکرد میتوکندری را قبل از مرگ سلولی بررسی کنیم. ما یک استراتژی مبتنی بر مرتب‌سازی سلول‌های فعال‌شده با فلورسانس (FACS) برای جداسازی PN بیان‌کننده YFP (YFP+) (شکل 1C) و در موش‌های کنترل (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) که از این پس CTRL نامیده می‌شود (شکل S1B) توسعه دادیم. بهینه‌سازی استراتژی گیتینگ بر اساس شدت نسبی سیگنال YFP به ما این امکان را می‌دهد که بدنه YFP+ (YFPhigh) سلول‌های PN را از غیر PNها (YFPneg) (شکل S1B) یا قطعات آکسون/دندریتیک فلورسنت فرضی (YFPlow؛ شکل S1D، سمت چپ) که توسط میکروسکوپ کانفوکال تأیید شده‌اند، خالص‌سازی کنیم (شکل S1D، سمت راست). به منظور تأیید هویت جمعیت طبقه‌بندی‌شده، پروتئومیکس LFQ و سپس تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی را انجام دادیم و دریافتیم که جدایی واضحی بین سلول‌های YFPhigh و YFPneg وجود دارد (شکل S1C). سلول‌های YFPhigh غنی‌سازی خالصی از نشانگرهای PN شناخته‌شده (یعنی Calb1، Pcp2، Grid2 و Itpr3) را نشان دادند (21، 22)، اما هیچ غنی‌سازی از پروتئین‌هایی که معمولاً در نورون‌ها یا سایر انواع سلول‌ها بیان می‌شوند، مشاهده نشد (شکل 1D). مقایسه بین نمونه‌های سلول‌های YFPhigh طبقه‌بندی‌شده جمع‌آوری‌شده در آزمایش‌های مستقل، ضریب همبستگی > 0.9 را نشان داد که نشان‌دهنده تکرارپذیری خوب بین تکرارهای بیولوژیکی است (شکل S1E). به طور خلاصه، این داده‌ها برنامه ما را برای جداسازی حاد و اختصاصی PN امکان‌پذیر تأیید کرد. از آنجا که سیستم محرک L7-cre مورد استفاده، نوترکیبی موزاییکی را در هفته اول پس از زایمان القا می‌کند (23)، ما شروع به حذف موش‌ها از CTRL و شرطی (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) کردیم. نورون‌ها را جمع‌آوری کردیم. پس از تکمیل نوترکیبی، در 4 هفتگی Mfn2cKO نامیده می‌شود. به عنوان نقطه پایانی، ما 8 هفتگی را انتخاب کردیم که لایه PN با وجود قطعه قطعه شدن آشکار میتوکندری سالم بود (شکل 1B و شکل S1A). در مجموع، ما 3013 پروتئین را کمّی‌سازی کردیم که حدود 22٪ آنها بر اساس حاشیه‌نویسی‌های MitoCarta 2.0 بر اساس پروتئوم میتوکندری به عنوان میتوکندری بودند (شکل 1E) (شکل 1E) (24). تجزیه و تحلیل بیان ژن افتراقی انجام شده در هفته 8 نشان داد که تنها 10.5٪ از کل پروتئین‌ها تغییرات قابل توجهی داشتند (شکل 1F و شکل S1F)، که از این تعداد 195 پروتئین کاهش بیان و 120 پروتئین افزایش بیان داشتند (شکل 1F). شایان ذکر است که "تجزیه و تحلیل مسیر نوآورانه" این مجموعه داده‌ها نشان می‌دهد که ژن‌های با بیان افتراقی عمدتاً متعلق به مجموعه‌ای محدود از مسیرهای متابولیکی خاص هستند (شکل 1G). جالب توجه است که اگرچه کاهش بیان مسیرهای مرتبط با OXPHOS و سیگنالینگ کلسیم، القای اختلال عملکرد میتوکندریایی در PNهای دارای نقص همجوشی را تأیید می‌کند، اما سایر دسته‌ها که عمدتاً شامل متابولیسم اسید آمینه هستند، به طور قابل توجهی افزایش بیان دارند، که با متابولیسمی که در PNهای میتوکندریایی رخ می‌دهد، مطابقت دارد. اختلال عملکرد Rewiring ثابت است.
(الف) عکس‌های کانفوکال نمایشی از بخش‌های مخچه موش‌های CTRL و Mfn2cKO که نشان‌دهنده از دست رفتن پیشرونده PNها (کالبیندین، خاکستری) است؛ هسته‌ها با DAPI رنگ‌آمیزی متقابل شدند. (ب) کمی‌سازی (الف) (آنالیز واریانس یک‌طرفه، ***P<0.001؛ n = 4 تا 6 دایره از سه موش). (ج) گردش کار آزمایش. (د) توزیع نقشه حرارتی نشانگرهای اختصاصی پورکنژ (بالا) و سایر انواع سلول‌ها (وسط). (ه) نمودار ون که تعداد پروتئین‌های میتوکندریایی شناسایی‌شده در PN طبقه‌بندی‌شده را نشان می‌دهد. (و) نمودار آتشفشانی پروتئین‌های با بیان متفاوت در نورون‌های Mfn2cKO در 8 هفته (مقدار آستانه معنی‌داری 1.3). (ز) تجزیه و تحلیل مسیر خلاقیت، پنج مسیر مهم افزایش بیان (قرمز) و کاهش بیان (آبی) را در PN Mfn2cKO طبقه‌بندی‌شده به عنوان 8 هفته نشان می‌دهد. میانگین سطح بیان هر پروتئین شناسایی‌شده نشان داده شده است. نقشه حرارتی خاکستری: مقدار P تنظیم‌شده. ن، مهم نیست.
داده‌های پروتئومیکس نشان داد که بیان پروتئین کمپلکس‌های I، III و IV به تدریج کاهش یافت. کمپلکس‌های I، III و IV همگی حاوی زیرواحدهای ضروری کدگذاری شده توسط mtDNA بودند، در حالی که کمپلکس II که فقط کدگذاری شده توسط هسته بود، اساساً تحت تأثیر قرار نگرفت (شکل 2A و شکل S2A). مطابق با نتایج پروتئومیکس، ایمونوهیستوشیمی مقاطع بافت مخچه نشان داد که سطح زیرواحد MTCO1 (زیرواحد 1 سیتوکروم اکسیداز C میتوکندریایی) کمپلکس IV در PN به تدریج کاهش یافت (شکل 2B). زیرواحد Mtatp8 کدگذاری شده توسط mtDNA به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل S2A)، در حالی که سطح حالت پایدار زیرواحد ATP سنتاز کدگذاری شده توسط هسته بدون تغییر باقی ماند، که با کمپلکس F1 زیرمجموعه ATP سنتاز پایدار شناخته شده در زمانی که بیان mtDNA پایدار است، سازگار است. تشکیل ثابت است. وقفه (7). ارزیابی سطح mtDNA در PN های Mfn2cKO مرتب شده با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (qPCR) در زمان واقعی، کاهش تدریجی تعداد کپی mtDNA را تأیید کرد. در مقایسه با گروه کنترل، در سن 8 هفتگی، تنها حدود 20٪ از سطح mtDNA حفظ شد (شکل 2C). مطابق با این نتایج، رنگ‌آمیزی میکروسکوپی کانفوکال PN های Mfn2cKO برای تشخیص DNA استفاده شد که مصرف وابسته به زمان نوکلئوتیدهای میتوکندری را نشان می‌دهد (شکل 2D). ما دریافتیم که تنها برخی از کاندیداهای دخیل در تخریب پروتئین میتوکندری و پاسخ به استرس، از جمله Lonp1، Afg3l2 و Clpx و فاکتورهای مونتاژ کمپلکس OXPHOS، افزایش بیان داشته‌اند. هیچ تغییر قابل توجهی در سطح پروتئین‌های دخیل در آپوپتوز مشاهده نشد (شکل S2B). به طور مشابه، ما دریافتیم که کانال‌های میتوکندری و شبکه آندوپلاسمی دخیل در انتقال کلسیم، تنها تغییرات جزئی دارند (شکل S2C). علاوه بر این، ارزیابی پروتئین‌های مرتبط با اتوفاژی هیچ تغییر قابل توجهی را نشان نداد، که با القای قابل مشاهده اتوفاگوزوم‌ها در داخل بدن توسط ایمونوهیستوشیمی و میکروسکوپ الکترونی مطابقت دارد (شکل S3). با این حال، اختلال عملکرد پیشرونده OXPHOS در PNها با تغییرات فراساختاری میتوکندریایی آشکار همراه است. خوشه‌های میتوکندریایی را می‌توان در اجسام سلولی و درختان دندریتیک PNهای Mfn2cKO در سنین 5 و 8 هفته مشاهده کرد و ساختار غشای داخلی دستخوش تغییرات عمیقی شده است (شکل S4، A و B). مطابق با این تغییرات فراساختاری و کاهش قابل توجه mtDNA، تجزیه و تحلیل برش‌های حاد مخچه مغزی با تترامتیل رودامین متیل استر (TMRM) نشان داد که پتانسیل غشای میتوکندری در PNهای Mfn2cKO به طور قابل توجهی کاهش یافته است (شکل S4C).
(الف) تحلیل دوره زمانی سطح بیان کمپلکس OXPHOS. فقط پروتئین‌هایی با P<0.05 در 8 هفته را در نظر بگیرید (ANOVA دوطرفه). خط چین: در مقایسه با CTRL هیچ تنظیمی انجام نشده است. (ب) سمت چپ: نمونه‌ای از یک برش مخچه که با آنتی‌بادی ضد MTCO1 برچسب‌گذاری شده است (نوار مقیاس، 20 میکرومتر). ناحیه اشغال شده توسط اجسام سلولی پورکنژ با رنگ زرد پوشانده شده است. سمت راست: تعیین کمی سطح MTCO1 (تحلیل واریانس یک طرفه؛ n = 7 تا 20 سلول تجزیه و تحلیل شده از سه موش). (ج) تحلیل qPCR از تعداد کپی mtDNA در PN مرتب شده (تحلیل واریانس یک طرفه؛ n = 3 تا 7 موش). (د) سمت چپ: نمونه‌ای از یک برش مخچه که با آنتی‌بادی ضد DNA برچسب‌گذاری شده است (نوار مقیاس، 20 میکرومتر). ناحیه اشغال شده توسط اجسام سلولی پورکنژ با رنگ زرد پوشانده شده است. راست: کمی‌سازی ضایعات mtDNA (آنالیز واریانس یک‌طرفه؛ n = 5 تا 9 سلول از سه موش). (E) نمونه‌ای از یک برش حاد مخچه که سلول‌های mitoYFP + Purkinje (فلش) را در یک ضبط گیره پچ کل سلول نشان می‌دهد. (F) کمی‌سازی منحنی IV. (G) ثبت‌های نماینده تزریق جریان دپلاریزه‌کننده در سلول‌های پورکنژ CTRL و Mfn2cKO. رد بالا: اولین پالسی که AP را فعال کرد. رد پایین: حداکثر فرکانس AP. (H) کمی‌سازی ورودی‌های خودبه‌خودی پس‌سیناپسی (sPSPs). رد ثبت نماینده و نسبت بزرگنمایی آن در (I) نشان داده شده است. آنالیز واریانس یک‌طرفه n = 5 تا 20 سلول از سه موش را تجزیه و تحلیل کرد. داده‌ها به صورت میانگین ± SEM بیان شده‌اند؛ *P<0.05؛ **P<0.01؛ ***P<0.001. (J) ردهای نماینده AP خودبه‌خودی ثبت شده با استفاده از حالت گیره پچ سوراخ‌دار. رد بالا: حداکثر فرکانس AP. رد پایین: بزرگنمایی یک AP واحد. (K) میانگین و حداکثر فراوانی AP را طبق (J) کمّی کنید. آزمون من-ویتنی؛ n = 5 سلول از چهار موش مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده‌اند؛ مهم نیستند.
آسیب آشکار OXPHOS در نورون‌های PN 8 هفته‌ای Mfn2cKO مشاهده شد که نشان می‌دهد عملکرد فیزیولوژیکی نورون‌ها به شدت غیرطبیعی است. بنابراین، ما ویژگی‌های الکتریکی غیرفعال نورون‌های دارای کمبود OXPHOS را در 4 تا 5 هفته و 7 تا 8 هفته با انجام ثبت‌های گیره پچ کل سلول در برش‌های حاد مخچه تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 2E). به طور غیرمنتظره‌ای، میانگین پتانسیل استراحت غشاء و مقاومت ورودی نورون‌های Mfn2cKO مشابه گروه کنترل بود، اگرچه تفاوت‌های ظریفی بین سلول‌ها وجود داشت (جدول 1). به طور مشابه، در 4 تا 5 هفته، هیچ تغییر قابل توجهی در رابطه جریان-ولتاژ (منحنی IV) مشاهده نشد (شکل 2F). با این حال، هیچ نورون Mfn2cKO 7 تا 8 هفته‌ای از رژیم IV (مرحله هایپرپلاریزاسیون) جان سالم به در نبرد، که نشان می‌دهد در این مرحله پایانی حساسیت واضحی به پتانسیل هایپرپلاریزاسیون وجود دارد. در مقابل، در نورون‌های Mfn2cKO، جریان‌های دپلاریزه‌کننده که باعث تخلیه‌های پتانسیل عمل تکراری (AP) می‌شوند، به خوبی تحمل می‌شوند، که نشان می‌دهد الگوهای تخلیه کلی آنها تفاوت معنی‌داری با نورون‌های کنترل 8 هفته‌ای ندارد (جدول 1 و شکل 2G). به طور مشابه، فرکانس و دامنه جریان‌های پس‌سیناپسی خودبه‌خودی (sPSCs) با گروه کنترل قابل مقایسه بود و فرکانس رویدادها از 4 هفته به 5 هفته به 7 هفته به 8 هفته با افزایش مشابه افزایش یافت (شکل 2، H و I). دوره بلوغ سیناپسی در PNها (25). نتایج مشابهی پس از وصله‌های PN سوراخ‌دار به دست آمد. این پیکربندی از جبران احتمالی نقص‌های ATP سلولی، همانطور که ممکن است در ضبط گیره وصله تمام سلولی اتفاق بیفتد، جلوگیری می‌کند. به طور خاص، پتانسیل غشای استراحت و فرکانس شلیک خودبه‌خودی نورون‌های Mfn2cKO تحت تأثیر قرار نگرفتند (شکل 2، J و K). به طور خلاصه، این نتایج نشان می‌دهد که PNها با اختلال عملکرد آشکار OXPHOS می‌توانند به خوبی با الگوهای تخلیه فرکانس بالا کنار بیایند، که نشان می‌دهد یک مکانیسم جبران وجود دارد که به آنها اجازه می‌دهد پاسخ‌های الکتروفیزیولوژیکی تقریباً طبیعی را حفظ کنند.
داده‌ها به صورت میانگین ± SEM (آنالیز واریانس یک‌طرفه، آزمون مقایسه چندگانه هولم-سیداک؛ *P<0.05) بیان شده‌اند. شماره واحد داخل پرانتز نشان داده شده است.
ما بررسی کردیم که آیا هیچ دسته‌ای در مجموعه داده‌های پروتئومیکس (شکل 1G) شامل مسیرهایی است که می‌توانند کمبود شدید OXPHOS را خنثی کنند، و در نتیجه توضیح دهیم که چرا PN آسیب‌دیده می‌تواند الکتروفیزیولوژی تقریباً طبیعی را حفظ کند (شکل 2، E تا K). تجزیه و تحلیل پروتئومیکس نشان داد که آنزیم‌های دخیل در کاتابولیسم اسیدهای آمینه شاخه‌دار (BCAA) به طور قابل توجهی افزایش یافته‌اند (شکل 3A و شکل S5A)، و محصول نهایی استیل-CoA (CoA) یا سوکسینیل CoA می‌تواند تری‌کربوکسیلات‌ها را در چرخه اسید آترواسکلروز (TCA) تکمیل کند. ما دریافتیم که محتوای BCAA ترانس‌آمیناز 1 (BCAT1) و BCAT2 هر دو افزایش یافته است. آنها اولین مرحله کاتابولیسم BCAA را با تولید گلوتامات از α-کتوگلوتارات کاتالیز می‌کنند (26). تمام زیر واحدهایی که کمپلکس کتواسید دهیدروژناز شاخه‌دار (BCKD) را تشکیل می‌دهند، افزایش بیان دارند (این کمپلکس، دکربوکسیلاسیون بعدی و برگشت‌ناپذیر اسکلت کربنی BCAA حاصل را کاتالیز می‌کند) (شکل 3A و شکل S5A). با این حال، هیچ تغییر آشکاری در خود BCAA در PN مرتب‌شده یافت نشد، که ممکن است به دلیل افزایش جذب سلولی این اسیدهای آمینه ضروری یا استفاده از منابع دیگر (گلوکز یا اسید لاکتیک) برای تکمیل چرخه TCA باشد (شکل S5B). PN های فاقد OXPHOS همچنین افزایش تجزیه گلوتامین و فعالیت‌های ترانس‌آمیناسیون را در 8 هفتگی نشان دادند، که می‌تواند با افزایش بیان آنزیم‌های میتوکندریایی گلوتامیناز (GLS) و گلوتامین پیروات ترانس‌آمیناز 2 (GPT2) منعکس شود (شکل 3، A و C). شایان ذکر است که افزایش بیان GLS محدود به ایزوفرم متصل شده گلوتامیناز C (GLS-GAC) است (تغییر Mfn2cKO/CTRL تقریباً 4.5 برابر است، P = 0.05) و افزایش بیان اختصاصی آن در بافت‌های سرطانی می‌تواند از انرژی زیستی میتوکندری پشتیبانی کند (27).
(الف) نقشه حرارتی، تغییر در سطح پروتئین را برای مسیر مشخص شده در 8 هفته نشان می‌دهد. (ب) نمونه‌ای از یک برش مخچه که با آنتی‌بادی ضد PCx نشاندار شده است (نوار مقیاس، 20 میکرومتر). فلش زرد به جسم سلولی پورکنژ اشاره دارد. (ج) تجزیه و تحلیل بیان پروتئین در طول زمان که به عنوان یک کاندیدای مهم برای تصلب شرایین شناسایی شده است (آزمون t چندگانه، *FDR <5%؛ n = 3-5 موش). (د) بالا: یک نمودار شماتیک که روش‌های مختلف ورود کربن نشاندار شده موجود در ردیاب [1-13C]پیروات را نشان می‌دهد (یعنی از طریق PDH یا مسیر شریانی). پایین: نمودار ویولن درصد کربن نشاندار شده تکی (M1) را که پس از نشاندار کردن برش‌های مخچه حاد با [1-13C]پیروات به اسید آسپارتیک، اسید سیتریک و اسید مالیک تبدیل شده است، نشان می‌دهد (آزمون t زوجی؛ ** P <0.01). (ه) تجزیه و تحلیل جامع تاریخچه زمانی مسیر نشان داده شده. فقط پروتئین‌هایی را در نظر بگیرید که در ۸ هفته P<0.05 دارند. خط چین: بدون مقدار تعدیل (آنالیز واریانس دو طرفه؛ * P <0.05؛ *** P <0.001). داده‌ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد بیان شده‌اند.
در تجزیه و تحلیل ما، کاتابولیسم BCAA به یکی از مسیرهای کلیدی تنظیم افزایشی تبدیل شده است. این واقعیت قویاً نشان می‌دهد که حجم تهویه‌ای که وارد چرخه TCA می‌شود، ممکن است در PN فاقد OXPHOS تغییر کند. این ممکن است نشان‌دهنده شکل اصلی سیم‌کشی مجدد متابولیک عصبی باشد که می‌تواند تأثیر مستقیمی بر فیزیولوژی و بقای عصبی در طول حفظ اختلال عملکرد شدید OXPHOS داشته باشد. مطابق با این فرضیه، ما دریافتیم که آنزیم اصلی ضد تصلب شرایین PCx تنظیم افزایشی دارد (Mfn2cKO/CTRL تقریباً 1.5 برابر تغییر می‌کند؛ شکل 3A)، که تبدیل پیروات به اگزالواستات را کاتالیز می‌کند (28)، که اعتقاد بر این است که در بافت مغز وجود دارد. بیان آن به آستروسیت‌ها محدود می‌شود (29، 30). مطابق با نتایج پروتئومیکس، میکروسکوپ کانفوکال نشان داد که بیان PCx به طور خاص و قابل توجهی در PN های دارای کمبود OXPHOS افزایش یافته است، در حالی که واکنش پذیری PCx عمدتاً به سلول های گلیال برگمن مجاور گروه کنترل محدود شده است (شکل 3B). برای آزمایش عملکردی افزایش بیان مشاهده شده PCx، برش های مخچه حاد را با ردیاب [1-13C] پیرووات تیمار کردیم. هنگامی که پیرووات توسط پیرووات دهیدروژناز (PDH) اکسید شد، برچسب ایزوتوپ آن ناپدید شد، اما هنگامی که پیرووات توسط واکنش های عروقی متابولیزه می شود، در واسطه های چرخه TCA گنجانده می شود (شکل 3D). در تأیید داده های پروتئومیکس ما، تعداد زیادی از نشانگرهای این ردیاب را در اسید آسپارتیک برش های Mfn2cKO مشاهده کردیم، در حالی که اسید سیتریک و اسید مالیک نیز روند متوسطی داشتند، اگرچه قابل توجه نبودند (شکل 3D).
در نورون‌های دوپامین موش‌های MitoPark با اختلال عملکرد میتوکندری ناشی از تخریب ژن فاکتور رونویسی A میتوکندریایی (Tfam) توسط نورون‌های دوپامین (شکل S6B)، بیان PCx نیز به طور قابل توجهی افزایش یافت (31)، که نشان می‌دهد تصلب شرایین ناشی از اسید استون در بدن در طول اختلال عملکرد OXPHOS عصبی تنظیم می‌شود. شایان ذکر است که مشخص شده است که آنزیم‌های منحصر به فردی (32-34) که ممکن است در نورون‌هایی که ممکن است با تصلب شرایین مرتبط باشند بیان شوند، در PN های فاقد OXPHOS به طور قابل توجهی افزایش می‌یابند، مانند پروپیونیل-CoA کربوکسیلاز (PCC-A)، مالونیل-CoA پروپیونیل-CoA را به سوکسینیل-CoA و آنزیم مالیک میتوکندریایی 3 (ME3) تبدیل می‌کند که نقش اصلی آن بازیابی پیروات از مالات است (شکل 3، A و C) (33، 35). علاوه بر این، ما افزایش قابل توجهی در آنزیم Pdk3 که PDH را فسفریله و در نتیجه غیرفعال می‌کند، مشاهده کردیم (36)، در حالی که هیچ تغییری در آنزیم Pdp1 که PDH را فعال می‌کند یا خود کمپلکس آنزیمی PDH مشاهده نشد (شکل 3A). به طور مداوم، در Mern2cKO PNها، فسفوریلاسیون زیر واحد α1 زیر واحد α (PDHE1α) از جزء پیرووات دهیدروژناز E1 کمپلکس PDH در Ser293 (که به عنوان مهار کننده فعالیت آنزیم PDH شناخته می‌شود) افزایش یافته بود (شکل S6C) (شکل S6C). پیرووات هیچ دسترسی عروقی ندارد.
در نهایت، ما دریافتیم که مسیر فوق‌العاده بیوسنتز سرین و گلیسین، چرخه فولات میتوکندریایی (1C) و بیوسنتز پرولین (شکل 1G و شکل S5C) طبق گزارش‌ها، همگی در طول فرآیند فعال‌سازی به طور قابل توجهی افزایش می‌یابند. بافت‌های اطراف با اختلال عملکرد میتوکندری فعال می‌شوند (5-7). تجزیه و تحلیل کانفوکال که از این داده‌های پروتئومیکس پشتیبانی می‌کند، نشان داد که در PN با فقدان OXPHOS، برش‌های مخچه موش‌های 8 هفته‌ای در معرض سرین هیدروکسی متیل ترانسفراز 2 (SHMT2)، یک آنزیم کلیدی چرخه فولات میتوکندریایی، قرار گرفتند. پاسخ ایمنی قابل توجه (شکل S5D). در 13 برش مخچه حاد انکوبه شده با CU-گلوکز، آزمایش‌های ردیابی متابولیک، افزایش بیوسنتز سرین و پرولین را بیشتر تأیید کردند، که نشان می‌دهد جریان ایزوفرم‌های کربن به سرین و پرولین افزایش یافته است (شکل S5E). از آنجایی که واکنش‌های ایجاد شده توسط GLS و GPT2 مسئول سنتز گلوتامات از گلوتامین و ترانس‌آمیناسیون بین گلوتامات و α-کتوگلوتارات هستند، افزایش بیان آنها نشان می‌دهد که نورون‌های دارای کمبود OXPHOS تقاضای بیشتری برای گلوتامات دارند. این امر ممکن است با هدف حفظ بیوسنتز افزایش یافته پرولین باشد (شکل S5C). در مقابل این تغییرات، تجزیه و تحلیل پروتئومیک آستروسیت‌های مخچه از موش‌های Mfn2cKO اختصاصی PN نشان داد که این مسیرها (شامل همه آنتی‌پراکسیدازها) تغییر قابل توجهی در بیان نشان ندادند، بنابراین نشان می‌دهد که این تغییر مسیر متابولیکی به سمت PN تخریب شده انتخابی است (شکل S6، D تا G).
به طور خلاصه، این تجزیه و تحلیل‌ها الگوهای به طور قابل توجهی متفاوتی از فعال‌سازی زمانی مسیرهای متابولیکی خاص در PNها را نشان داد. اگرچه عملکرد غیرطبیعی میتوکندری عصبی می‌تواند منجر به آترواسکلروز اولیه و بازسازی 1C (شکل 3E و شکل S5C) و حتی تغییرات قابل پیش‌بینی در بیان کمپلکس‌های I و IV شود، اما تغییرات در سنتز سرین de novo فقط در مراحل پایانی اختلال عملکرد OXPHOS آشکار می‌شود (شکل 3E و شکل S5C). این یافته‌ها یک فرآیند متوالی را تعریف می‌کنند که در آن پاسخ میتوکندریایی (چرخه 1C) و سیتوپلاسمی (بیوسنتز سرین) ناشی از استرس به طور هم‌افزایی با افزایش آترواسکلروز در چرخه TCA برای تغییر شکل متابولیسم عصبی انجام می‌شود.
سلول‌های عصبی محیطی (PN) 8 هفته‌ای فاقد OXPHOS می‌توانند فعالیت تحریک فرکانس بالا را حفظ کرده و برای جبران اختلال عملکرد میتوکندری، اتصال مجدد متابولیکی قابل توجهی را متحمل شوند. این کشف، احتمال جالبی را مطرح می‌کند که حتی در حال حاضر، این سلول‌ها نیز ممکن است مداخله درمانی برای به تأخیر انداختن یا جلوگیری از تخریب عصبی دریافت کنند. دیرهنگام. ما این احتمال را از طریق دو مداخله مستقل برطرف کردیم. در روش اول، ما یک وکتور ویروس وابسته به آدنو (AAV) وابسته به Cre طراحی کردیم تا MFN2 بتواند به صورت انتخابی در PN های فاقد OXPHOS در داخل بدن بیان شود (شکل S7A). AAV کدکننده MFN2 و ژن گزارشگر فلورسنت mCherry (Mfn2-AAV) در کشت‌های نورونی اولیه در شرایط آزمایشگاهی تأیید شدند که باعث بیان MFN2 به صورت وابسته به Cre و نجات مورفولوژی میتوکندری شد و در نتیجه از جهش عصبی در نورون‌های Mfn2cKO جلوگیری کرد (شکل S7، B، D و E). در مرحله بعد، ما آزمایش‌های درون‌تنی (in vivo) را برای انتقال استریوتاکتیک Mfn2-AAV هشت هفته‌ای به قشر مخچه موش‌های Mfn2cKO و کنترل انجام دادیم و موش‌های 12 هفته‌ای را نیز مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم (شکل 4A). موش‌های Mfn2cKO تحت درمان مردند (شکل 1، A و B) (16). انتقال ویروسی در درون‌تنی منجر به بیان انتخابی PN در برخی از حلقه‌های مخچه شد (شکل S7، G و H). تزریق AAV کنترل که فقط mCherry را بیان می‌کرد (Ctrl-AAV) هیچ تأثیر معنی‌داری بر میزان تخریب عصبی در حیوانات Mfn2cKO نداشت. در مقابل، تجزیه و تحلیل Mfn2cKO های منتقل شده با Mfn2-AAV اثر محافظتی قابل توجهی بر لایه سلولی PN نشان داد (شکل 4، B و C). به طور خاص، به نظر می‌رسد تراکم نورونی تقریباً از حیوانات کنترل قابل تشخیص نیست (شکل 4، B و C، و شکل S7، H و I). بیان MFN1 اما نه MFN2 به یک اندازه در جلوگیری از مرگ نورونی مؤثر است (شکل 4C و شکل S7، C و F)، که نشان می‌دهد بیان MFN1 نابجا می‌تواند به طور مؤثر کمبود MFN2 را جبران کند. تجزیه و تحلیل بیشتر در سطح PN واحد نشان داد که Mfn2-AAV تا حد زیادی ساختار فوق‌ساختار میتوکندری را احیا می‌کند، سطح mtDNA را نرمال می‌کند و بیان بالای نشانگر ضد رگ‌زایی PCx را معکوس می‌کند (شکل 4، C تا E). بررسی بصری موش‌های Mfn2cKO نجات‌یافته در حالت استراحت نشان داد که وضعیت بدن و علائم حرکتی آنها (حرکت S1 تا S3) بهبود یافته است. در نتیجه، این آزمایش‌ها نشان می‌دهند که تأخیر در ورود مجدد MFN2 به PNهایی که به شدت دچار کمبود OXPHOS هستند، برای معکوس کردن مصرف mtDNA و القای تصلب شرایین کافی است و در نتیجه از تخریب آکسون و مرگ نورونی در داخل بدن جلوگیری می‌کند.
(الف) طرحی که برنامه‌ی آزمایشی تزریق AAV کدکننده‌ی MFN2 را هنگام فعال شدن مسیر متابولیکی نشان می‌دهد. (ب) تصاویر کانفوکال نمایشی از برش‌های مخچه‌ی ۱۲ هفته‌ای که در ۸ هفتگی در موش‌های Mfn2cKO ترانسداکت شده و با آنتی‌بادی ضد کالبیندین برچسب‌گذاری شده‌اند. راست: مقیاس‌بندی فیبرهای آکسون. مقیاس بزرگنمایی آکسون ۴۵۰ و ۷۵ میکرومتر است. (ج) چپ: کمی‌سازی تراکم سلول‌های پورکنژ در حلقه‌ی ترانسداکشن AAV (AAV+) (آنالیز واریانس یک‌طرفه؛ n = 3 موش). راست: آنالیز تمرکز mtDNA در PN ترانسداکت شده در هفته‌ی ۱۲ (آزمون t جفت نشده؛ n = 6 سلول از سه موش). * P <0.05؛ ** P <0.01. (د) تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نمایشی از PNهای بخش‌های مخچه‌ی Mfn2cKO که با ناقل‌های ویروسی نشان داده شده ترانسداکت شده‌اند. ماسک صورتی ناحیه اشغال شده توسط دندریت‌ها را نشان می‌دهد و مربع نقطه‌چین زرد بزرگنمایی ارائه شده در سمت راست را نشان می‌دهد؛ n نشان دهنده هسته است. نمودار مقیاس، ۱ میکرومتر. (E) نمونه‌ای از رنگ‌آمیزی PCx در PN ترانسداکت شده در ۱۲ هفته را نشان می‌دهد. نمودار مقیاس، ۲۰ میکرومتر. OE، بیان بیش از حد؛ FC، تغییر تاخوردگی.
در نهایت، ما اهمیت بقای سلولی ناشی از پراکسیداز را در PN هایی که اختلال عملکرد OXPHOS را تجربه کرده‌اند، بررسی کردیم. ما mCherry AAV-shRNA (RNA کوتاه سنجاق سری) را که به طور خاص mRNAی PCx موش (AAV-shPCx) را هدف قرار می‌دهد، تولید کردیم و ویروس یا کنترل درهم‌ریخته شده آن (AAV-scr) را به مخچه موش‌های Mfn2cKO تزریق کردیم. این تزریق در هفته چهارم (شکل 5A) انجام شد تا در دوره‌ای که بیان PCx افزایش یافته بود (شکل 3C) و لایه سلولی PN هنوز دست نخورده بود (شکل 1A)، به مهار مؤثر PCx دست یابیم. شایان ذکر است که مهار PCx (شکل S8A) منجر به تسریع قابل توجه مرگ PN می‌شود که محدود به حلقه آلوده است (شکل 5، B و C). به منظور درک مکانیسم اثرات متابولیکی ناشی از تنظیم افزایشی PCx، ما وضعیت ردوکس نورون‌های عصبی (PNs) را پس از مهار PCx و بیان همزمان حسگر نوری Grx1-roGFP2 با واسطه AAV (شکل S8، B تا D) برای ارزیابی تغییر نسبی پتانسیل ردوکس پپتید گلوتاتیون (38) بررسی کردیم. سپس، ما میکروسکوپ تصویربرداری طول عمر فلورسانس دو فوتونی (FLIM) را در برش‌های حاد مغز Mfn2cKO 7 هفته‌ای یا هم‌زادهای کنترل انجام دادیم تا تغییرات بالقوه در وضعیت ردوکس سیتوپلاسمی را پس از تأیید شرایط FLIM تشخیص دهیم (شکل S8، E تا G). تجزیه و تحلیل افزایش قابل توجهی در حالت اکسیداسیون یک نورون عصبی Mfn2cKO منفرد فاقد بیان PCx را نشان داد، که با نورون‌های کنترل یا نورون عصبی Mfn2cKO که فقط shRNA درهم‌ریخته را بیان می‌کنند، متفاوت است (شکل 5، D و E). هنگامی که بیان PCx کاهش یافت، درصد نورون‌های پیش‌ساز Mfn2cKO که حالت اکسید شده بالایی نشان می‌دادند، بیش از سه برابر افزایش یافت (شکل 5E)، که نشان می‌دهد افزایش بیان PCx ظرفیت ردوکس نورون‌های تخریب‌شده را حفظ کرده است.
(الف) طرحی که برنامه‌ی آزمایشی برای تزریق AAV کدکننده‌ی shPCx را هنگام فعال شدن مسیر متابولیکی نشان می‌دهد. (ب) عکس‌های کانفوکال نمونه از بخش‌های مخچه‌ی 8 هفته‌ای در موش‌های Mfn2cKO که در 4 هفته با آنتی‌بادی ضد کلسینورین ترانسداکت و برچسب‌گذاری شده‌اند. نمودار مقیاس، 450 میکرومتر. (ج) کمی‌سازی تراکم سلول‌های پورکنژ در حلقه‌های ترانسداکت‌شده با AAV (آنالیز واریانس یک‌طرفه؛ n = 3 تا 4 موش). داده‌ها به صورت میانگین ± SEM بیان شده‌اند؛ ***P<0.001. (د) تصویر FLIM نمونه، میانگین طول عمر PN 7 هفته‌ای بیان‌کننده‌ی حسگر ردوکس گلوتاتیون Grx1-roGFP2 را تحت شرایط آزمایشی مشخص‌شده نشان می‌دهد. نسبت LUT (جدول جستجو): فاصله‌ی زمانی بقا (برحسب پیکوثانیه). نمودار مقیاس، 25 میکرومتر. (E) هیستوگرام توزیع مقادیر طول عمر Grx1-roGFP2 را از (D) (n=158 تا 368 سلول در دو موش تحت هر شرایط) نشان می‌دهد. نمودار دایره‌ای بالای هر هیستوگرام: تعداد سلول‌هایی را نشان می‌دهد که مقادیر طول عمر آنها به طور قابل توجهی طولانی‌تر (قرمز، اکسید شده) یا کوتاه‌تر (آبی، کاهش یافته) است، که از 1 SD از میانگین طول عمر در CTRL-AAV-scr بیشتر است. (F) مدل پیشنهادی اثر محافظتی تنظیم افزایشی PCx نورونی را نشان می‌دهد.
روی هم رفته، داده‌هایی که ما در اینجا ارائه می‌دهیم نشان می‌دهد که بیان مجدد MFN2 می‌تواند PN پیشرفته با کمبود شدید OXPHOS، کاهش شدید mtDNA و مورفولوژی بسیار غیرطبیعی شبه ایستا را به طور کامل نجات دهد و در نتیجه پیشرفت مداوم را حتی در بیماری‌های پیشرفته فراهم کند. تخریب عصبی شواهد برگشت‌پذیر از مرحله قبل از مرگ سلولی را ارائه می‌دهد. این درجه از انعطاف‌پذیری متابولیکی با توانایی نورون‌ها در القای تصلب شرایین (سیم‌کشی مجدد چرخه TCA) که بیان PCx را در PN های فاقد OXPHOS مهار می‌کند و مرگ سلولی را افزایش می‌دهد، بیشتر مورد تأکید قرار می‌گیرد و در نتیجه نقش محافظتی ایفا می‌کند (شکل 5F).
در این مطالعه، ما شواهدی ارائه دادیم که نشان می‌دهد پاسخ نورون‌های عصبی به اختلال عملکرد OXPHOS به تدریج از طریق مسیر فعال‌سازی افتراقی فعال‌شده توسط برنامه‌های متابولیکی به آترواسکلروز چرخه TCA همگرا می‌شود. ما تجزیه و تحلیل پروتئومیک را با بسیاری از روش‌های مکمل تأیید کردیم و نشان دادیم که وقتی نورون‌ها با اختلال عملکرد شدید میتوکندری مواجه می‌شوند، نوعی از خاصیت ارتجاعی متابولیکی دارند که قبلاً ناشناخته بود. در کمال تعجب، کل فرآیند سیم‌کشی مجدد لزوماً نشان‌دهنده حالت متابولیک نهایی نیست که با تخریب تدریجی و برگشت‌ناپذیر عصبی همراه است، اما داده‌های ما نشان می‌دهد که ممکن است حتی در مرحله قبل از مرگ سلولی، یک نورون نگهدارنده تشکیل دهد. مکانیسم جبران عملکردی. این یافته نشان می‌دهد که نورون‌ها درجه قابل توجهی از انعطاف‌پذیری متابولیکی در بدن دارند. این واقعیت ثابت می‌کند که معرفی مجدد MFN2 در مراحل بعدی می‌تواند بیان نشانگرهای متابولیک کلیدی را معکوس کند و از تخریب PN جلوگیری کند. برعکس، آترواسکلروز را مهار می‌کند و اعصاب را تسریع می‌کند. تراجنسیتی.
یکی از جذاب‌ترین یافته‌ها در تحقیقات ما این است که PN های فاقد OXPHOS می‌توانند متابولیسم چرخه TCA را با تنظیم افزایشی آنزیم‌هایی که به‌طور خاص تصلب شرایین را تحریک می‌کنند، تغییر دهند. بازآرایی متابولیکی یکی از ویژگی‌های رایج سلول‌های سرطانی است که برخی از آنها برای تکمیل واسطه‌های چرخه TCA به گلوتامین متکی هستند تا معادل‌های کاهنده تولید کنند که زنجیره تنفسی را هدایت می‌کنند و تولید پیش‌سازهای بیوسنتز لیپید و نوکلئوتید را حفظ می‌کنند (39، 40). یک مطالعه اخیر نشان داد که در بافت‌های محیطی که اختلال عملکرد OXPHOS را تجربه می‌کنند، اتصال مجدد متابولیسم گلوتامین/گلوتامات نیز یک ویژگی برجسته است (5، 41)، که در آن جهت ورود گلوتامین به چرخه TCA به شدت آسیب OXPHOS بستگی دارد (41). با این حال، شواهد روشنی در مورد هرگونه شباهت انعطاف‌پذیری متابولیک عصبی در بدن و ارتباط احتمالی آن در زمینه بیماری وجود ندارد. در یک مطالعه آزمایشگاهی اخیر، نشان داده شد که نورون‌های قشری اولیه، ذخایر گلوتامات را برای انتقال عصبی بسیج می‌کنند و در نتیجه متابولیسم اکسیداتیو و تصلب شرایین را در شرایط استرس متابولیکی تقویت می‌کنند (42). شایان ذکر است که تحت مهار دارویی آنزیم سوکسینات دهیدروژناز چرخه TCA، کربوکسیلاسیون پیروات، سنتز اگزالواستات را در نورون‌های گرانول مخچه کشت‌شده حفظ می‌کند (34). با این حال، ارتباط فیزیولوژیکی این مکانیسم‌ها با بافت مغز (جایی که اعتقاد بر این است که تصلب شرایین عمدتاً به آستروسیت‌ها محدود می‌شود) هنوز اهمیت فیزیولوژیکی مهمی دارد (43). در این مورد، داده‌های ما نشان می‌دهد که PN های آسیب دیده توسط OXPHOS در بدن می‌توانند به تخریب BCAA و کربوکسیلاسیون پیروات تغییر کنند، که دو منبع اصلی مکمل واسطه‌های ذخایر TCA هستند. اگرچه علاوه بر نقش گلوتامات و گابا برای انتقال عصبی، سهم احتمالی کاتابولیسم BCAA در متابولیسم انرژی عصبی پیشنهاد شده است (44)، اما هنوز هیچ مدرکی برای این مکانیسم‌ها در داخل بدن وجود ندارد. بنابراین، به راحتی می‌توان حدس زد که نورون‌های عصبی ناکارآمد می‌توانند به طور خودکار مصرف واسطه‌های TCA ناشی از فرآیند جذب را با افزایش تصلب شرایین جبران کنند. به طور خاص، ممکن است افزایش تنظیم PCx برای حفظ تقاضای افزایش یافته برای اسید آسپارتیک مورد نیاز باشد، که در سلول‌های تکثیر شونده با اختلال عملکرد میتوکندری پیشنهاد می‌شود (45). با این حال، تجزیه و تحلیل متابولومیکس ما هیچ تغییر قابل توجهی در سطح پایدار اسید آسپارتیک در نورون‌های عصبی Mfn2cKO نشان نداد (شکل S6A)، که احتمالاً نشان دهنده استفاده متابولیکی متفاوت از اسید آسپارتیک بین سلول‌های تکثیر شونده و نورون‌های پس از میتوز است. اگرچه مکانیسم دقیق تنظیم افزایشی PCx در نورون‌های ناکارآمد در داخل بدن هنوز مشخص نشده است، ما نشان دادیم که این پاسخ زودرس نقش مهمی در حفظ حالت اکسایش-کاهش نورون‌ها ایفا می‌کند، که در آزمایش‌های FLIM روی برش‌های مخچه نشان داده شد. به طور خاص، جلوگیری از تنظیم افزایشی PCx توسط PNها می‌تواند منجر به حالت اکسید شده‌تر و تسریع مرگ سلولی شود. فعال شدن تخریب BCAA و کربوکسیلاسیون پیروات، راه‌هایی برای توصیف بافت‌های محیطی با اختلال عملکرد میتوکندری نیستند (7). بنابراین، به نظر می‌رسد که آنها یک ویژگی اولویت‌دار نورون‌های دارای کمبود OXPHOS هستند، حتی اگر تنها ویژگی نباشند، که برای تخریب عصبی مهم است.
بیماری مخچه نوعی ناهمگن از بیماری نورودژنراتیو است که معمولاً به صورت آتاکسی بروز می‌کند و اغلب به PNها آسیب می‌رساند (46). این جمعیت نورونی به ویژه در برابر اختلال عملکرد میتوکندری آسیب‌پذیر است زیرا تخریب انتخابی آنها در موش‌ها برای بازتولید بسیاری از علائم حرکتی که آتاکسی نخاعی-مخچه‌ای انسان را مشخص می‌کند، کافی است (16، 47، 48). طبق گزارش‌ها، یک مدل موش تراریخته با یک ژن جهش‌یافته با آتاکسی نخاعی-مخچه‌ای انسان مرتبط است و اختلال عملکرد میتوکندری دارد (49، 50)، که بر اهمیت مطالعه عواقب کمبود OXPHOS در PNPH تأکید می‌کند. بنابراین، جداسازی و مطالعه مؤثر این جمعیت نورونی منحصر به فرد به ویژه مناسب است. با این حال، با توجه به اینکه PNها به فشار بسیار حساس هستند و نسبت کمی از کل جمعیت سلول‌های مخچه را تشکیل می‌دهند، برای بسیاری از مطالعات مبتنی بر اومیکس، جداسازی انتخابی آنها به عنوان سلول‌های کامل هنوز یک جنبه چالش برانگیز است. اگرچه دستیابی به عدم آلودگی مطلق سایر انواع سلول‌ها (به‌ویژه بافت‌های بالغ) تقریباً غیرممکن است، ما یک مرحله جداسازی مؤثر را با FACS ترکیب کردیم تا تعداد کافی نورون زنده برای تجزیه و تحلیل پروتئومیکس پایین‌دست به دست آوریم و پوشش پروتئینی نسبتاً بالایی (حدود 3000 پروتئین) در مقایسه با مجموعه داده‌های موجود از کل مخچه داشته باشیم (51). با حفظ زیست‌پذیری کل سلول‌ها، روشی که ما در اینجا ارائه می‌دهیم به ما این امکان را می‌دهد که نه تنها تغییرات در مسیرهای متابولیکی در میتوکندری را بررسی کنیم، بلکه تغییرات در همتایان سیتوپلاسمی آن را نیز بررسی کنیم، که مکمل استفاده از برچسب‌های غشایی میتوکندری برای غنی‌سازی نوع سلول است. روش جدید برای تعداد میتوکندری‌ها در بافت‌های پیچیده (52، 53). روشی که ما توصیف می‌کنیم نه تنها مربوط به مطالعه سلول‌های پورکنژ است، بلکه می‌تواند به راحتی برای هر نوع سلولی برای بررسی تغییرات متابولیکی در مغزهای بیمار، از جمله سایر مدل‌های اختلال عملکرد میتوکندری، اعمال شود.
در نهایت، ما یک بازه درمانی را در طول این فرآیند بازآرایی متابولیک شناسایی کرده‌ایم که می‌تواند علائم کلیدی استرس سلولی را به طور کامل معکوس کرده و از تخریب نورونی جلوگیری کند. بنابراین، درک پیامدهای عملکردی سیم‌کشی مجدد شرح داده شده در اینجا ممکن است بینش‌های اساسی در مورد درمان‌های احتمالی برای حفظ حیات نورونی در طول اختلال عملکرد میتوکندری ارائه دهد. تحقیقات آینده با هدف تشریح تغییرات در متابولیسم انرژی در سایر انواع سلول‌های مغزی مورد نیاز است تا کاربرد این اصل را در سایر بیماری‌های عصبی به طور کامل آشکار کند.
موش‌های MitoPark قبلاً شرح داده شده‌اند (31). موش‌های C57BL/6N با ژن‌های Mfn2 مجاور loxP قبلاً شرح داده شده‌اند (18) و با موش‌های L7-Cre تلاقی داده شده‌اند (23). سپس فرزندان هتروزیگوت دوگانه حاصل با موش‌های هموزیگوت Mfn2loxP/Mfn2loxP تلاقی داده شدند تا ناک‌اوت‌های ژن پورکینژ اختصاصی برای Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ایجاد شود. در زیرمجموعه‌ای از جفت‌گیری، آلل Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) از طریق تلاقی‌های اضافی معرفی شد (20). تمام مراحل حیوانی مطابق با دستورالعمل‌های اروپایی، ملی و نهادی انجام شد و توسط LandesamtfürNatur از Umwelt و Verbraucherschutz، نوردراین-وستفالن، آلمان تأیید شد. کار حیوانی همچنین از راهنمایی‌های فدراسیون اروپایی انجمن‌های علوم آزمایشگاهی حیوانات پیروی می‌کند.
پس از بی‌هوش کردن زن باردار در ناحیه گردن رحم، جنین موش جدا می‌شود (E13). قشر مغز در محلول نمکی متعادل هنکس (HBSS) حاوی 10 میلی‌مولار هپس تشریح شد و به محیط کشت اصلاح‌شده عقاب دولبکو حاوی پاپائین (20 واحد در میلی‌لیتر) و سیستئین (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) منتقل شد. بافت را در DMEM (محلول نمکی متعادل هنکس) انکوبه کرده و با هضم آنزیمی (میلی‌لیتر) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه جدا کنید و سپس به صورت مکانیکی در DMEM حاوی 10٪ سرم جنین گاوی آسیاب کنید. سلول‌ها روی لامل‌های شیشه‌ای پوشیده شده با پلی‌لیزین با تراکم 2×106 در هر ظرف کشت 6 سانتی‌متری یا با تراکم 0.5×105 سلول در سانتی‌متر مربع برای تجزیه و تحلیل تصویربرداری کاشته شدند. پس از 4 ساعت، محیط کشت با محیط کشت بدون سرم نوروبازال حاوی 1٪ مکمل B27 و 0.5 میلی‌مولار گلوتامکس جایگزین شد. سپس نورون‌ها در طول آزمایش در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و ۵٪ CO2 نگهداری شدند و هفته‌ای یک بار تغذیه شدند. به منظور القای نوترکیبی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، در روز دوم در شرایط آزمایشگاهی، از ۳ میکرولیتر (ظرف کشت ۲۴ خانه‌ای) یا ۰.۵ میکرولیتر (پلیت ۲۴ خانه‌ای) از ناقل ویروس AAV9 زیر برای تیمار نورون‌ها استفاده شد: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene، شماره کاتالوگ ۱۰۵۵۳۰-AAV9) و AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، شماره کاتالوگ ۱۰۵۵۴۵-AAV9).
DNA مکمل Mfn1 و Mfn2 موش (به ترتیب از پلاسمید Addgene شماره ۲۳۲۱۲ و ۲۳۲۱۳ به دست آمده‌اند) با توالی V5 (GKPIPNPLLGLDST) در انتهای C علامت‌گذاری شده‌اند و از طریق توالی T2A با mCherry در قاب ترکیب می‌شوند. Grx1-roGFP2 هدیه‌ای از Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) است. با جایگزینی کاست tdTomato با استفاده از روش‌های کلونینگ مرسوم، کاست در اسکلت pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (شماره مرجع Addgene 28306) زیرکلون شد تا وکتورهای pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5، pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 و pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 تولید شوند. از استراتژی مشابهی برای تولید وکتور کنترل pAAV-CAG-FLEX-mCherry استفاده شد. برای تولید سازه AAV-shPCx، به یک وکتور پلاسمیدی AAV (VectorBuilder، pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) نیاز است که حاوی توالی DNA کدکننده shRNA هدف قرار دهنده PCx موش (5′CTTTCGCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) است. تحت کنترل پروموتر U6، از mCherry تحت کنترل پروموتر CMV استفاده می‌شود. تولید وکتورهای کمکی AAV طبق دستورالعمل سازنده (Cell Biolabs) انجام شد. به طور خلاصه، از یک پلاسمید انتقالی حامل mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) به صورت گذرا استفاده کنید. ترانسفکشن موقت ژن کدکننده 293AAV cells-T2A-MFN1-V5)، mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) یا Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2)، و همچنین کدکننده پروتئین کپسید AAV1 و پلاسمید بسته‌بندی پروتئین جانبی، با استفاده از روش فسفات کلسیم. مایع رویی ویروس خام با چرخه‌های انجماد-ذوب در حمام یخ خشک/اتانول و لیز سلول‌ها در محلول نمکی بافر فسفات (PBS) به دست آمد. ناقل AAV با استفاده از اولتراسانتریفیوژ گرادیان آیودیکسانول ناپیوسته (24 ساعت در 32000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد) خالص‌سازی و با استفاده از فیلتر سانتریفیوژ Amicon ultra-15 تغلیظ شد. تیتر ژنوم AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 کپی ژنوم (GC)/ml]، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG-FLEX همانطور که قبلاً توضیح داده شد (54)، با استفاده از PCR کمی زمان واقعی (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) و AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) اندازه‌گیری شد.
نورون‌های اولیه در محلول PBS 1x سرد جدا شده، رسوب داده شدند و سپس در بافر لیز Triton X-100 0.5% / 0.5% سدیم دئوکسی کولات/PBS حاوی مهارکننده فسفاتاز و پروتئاز (Roche) همگن شدند. تعیین مقدار پروتئین با استفاده از روش سنجش اسید بیسینکونینیک (Thermo Fisher Scientific) انجام شد. سپس پروتئین‌ها با الکتروفورز ژل SDS-پلی آکریل آمید جدا شده و سپس روی غشای پلی وینیلیدین فلوراید (GE Healthcare) لکه‌گذاری شدند. مکان‌های غیر اختصاصی را مسدود کرده و با آنتی‌بادی اولیه (برای جزئیات به جدول S1 مراجعه کنید) در شیر 5% در TBST (محلول نمکی تریس با Tween) انکوبه کنید، مراحل شستشو و آنتی‌بادی ثانویه را در انکوباتور TBST انجام دهید. با آنتی‌بادی اولیه یک شب در دمای +4 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. پس از شستشو، آنتی‌بادی ثانویه را به مدت 2 ساعت در دمای اتاق اعمال کنید. متعاقباً، با انکوبه کردن همان لکه با آنتی‌بادی ضد β-اکتین، همان بارگذاری تأیید شد. تشخیص با تبدیل به کمی‌لومینسانس و افزایش کمی‌لومینسانس (GE Healthcare).
نورون‌هایی که قبلاً روی لامل‌های شیشه‌ای کاشته شده بودند، در زمان مشخص شده در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه با 4% پارافرمالدهید (PFA)/PBS تثبیت شدند. لامل‌ها ابتدا به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق با 0.1% تریتون X-100/PBS و سپس در بافر مسدودکننده [3% آلبومین سرم گاوی (BSA)/PBS] آغشته شدند. در روز دوم، لامل‌ها با بافر مسدودکننده شسته شده و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق با آنتی‌بادی ثانویه متصل به فلوروفور مناسب انکوبه شدند. در نهایت، نمونه‌ها به طور کامل در PBS با 4′,6-دی‌آمیدینو-2-فنیل‌لیندول (DAPI) شسته شده و رنگ‌آمیزی متقابل روی آنها انجام شد و سپس با Aqua-Poly/Mount روی لام میکروسکوپ تثبیت شدند.
موش‌ها (نر و ماده) با تزریق داخل صفاقی کتامین (130 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند و مسکن کارپروفن (5 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به صورت زیر جلدی به آنها تزریق شد و در دستگاه استریوتاکتیک (Kopf) مجهز به پد گرم قرار داده شدند. جمجمه را باز کنید و با استفاده از یک مته دندانپزشکی، بخشی از قشر مخچه مربوط به استخوان میس (از لامبدا: دم 1.8، جانبی 1، مربوط به لوبول‌های IV و V) را نازک کنید. با استفاده از یک سوزن سرنگ خمیده، با دقت یک سوراخ کوچک در جمجمه ایجاد کنید تا از اختلال در عروق زیرین جلوگیری شود. سپس مویرگ شیشه‌ای نازک کشیده شده به آرامی به داخل میکروسوراخ (از -1.3 تا -1 در سمت شکمی سخت‌شامه) وارد می‌شود و 200 تا 300 نانولیتر AAV با سرنگ‌های دستی (Narishige) چندین بار با فشار کم در یک دوره زمانی 10 تا 20 دقیقه‌ای به میکرواینجکتور (Narishige) تزریق می‌شود. پس از تزریق، مویرگ را به مدت 10 دقیقه دیگر قرار دهید تا ویروس به طور کامل پخش شود. پس از خارج کردن مویرگ‌ها، پوست با دقت بخیه می‌شود تا التهاب زخم به حداقل برسد و حیوان بهبود یابد. حیوانات به مدت چند روز پس از عمل با مسکن (کاسپوفن) تحت درمان قرار گرفتند، در این مدت وضعیت جسمی آنها به دقت تحت نظر بود و سپس در زمان تعیین شده، معدوم شدند. تمام مراحل مطابق با دستورالعمل‌های اروپایی، ملی و نهادی انجام شد و توسط LandesamtfürNatur از Umwelt و Verbraucherschutz، نوردراین-وستفالن، آلمان تأیید شد.
حیوانات با کتامین (100 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند و قلب ابتدا با 0.1 مولار PBS و سپس با 4٪ PFA در PBS پرفیوژن شد. بافت تشریح و در 4٪ PFA/PBS به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد تثبیت شد. از یک چاقوی ارتعاشی (Leica Microsystems GmbH، وین، اتریش) برای تهیه برش‌های ساژیتال (ضخامت 50 میکرومتر) از مغز تثبیت شده در PBS استفاده شد. مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد، رنگ‌آمیزی برش‌های شناور آزاد همانطور که در بالا (13) توضیح داده شد در دمای اتاق و هم زدن انجام شد. به طور خلاصه، ابتدا برش‌های به‌دست‌آمده با 0.5٪ Triton X-100/PBS به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق نفوذپذیر شدند. برای برخی از اپی‌توپ‌ها (Pcx و Shmt2)، با استفاده از بافر tris-EDTA در دمای 80 درجه سانتیگراد (PH 9) برش‌ها را به مدت 25 دقیقه به جای این مرحله گرم کنید. در مرحله بعد، برش‌ها با آنتی‌بادی اولیه (به جدول S1 مراجعه کنید) در بافر مسدودکننده (3% BSA/PBS) در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت یک شب و همراه با هم زدن انکوبه شدند. روز بعد، برش‌ها با بافر مسدودکننده شسته شده و با آنتی‌بادی ثانویه متصل به فلوروفور مناسب به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. در نهایت، برش‌ها به طور کامل در PBS شسته شدند، با DAPI رنگ‌آمیزی متقابل شدند و سپس با AquaPolymount روی لام میکروسکوپ تثبیت شدند.
یک میکروسکوپ کانفوکال روبشی لیزری (TCS SP8-X یا TCS Digital Light Sheet، Leica Microsystems) مجهز به لیزر نور سفید و لیزر فرابنفش دیودی ۴۰۵ برای تصویربرداری از نمونه استفاده شد. با تحریک فلوروفور و جمع‌آوری سیگنال با آشکارساز هیبریدی (HyDs)، از نرم‌افزار LAS-X برای جمع‌آوری تصاویر انباشته مطابق با نمونه‌برداری نایکوئیست در حالت متوالی استفاده شد: برای پنل‌های غیرکمی، سیگنال‌های بسیار پویا (به عنوان مثال، در سلول‌های سوماتیک و دندریت‌ها) mtYFP) از HyD برای تشخیص تعداد PNها در حالت BrightR استفاده می‌شود. گیتینگ از ۰.۳ تا ۶ نانوثانیه برای کاهش پس‌زمینه اعمال می‌شود.
تصویربرداری در زمان واقعی از سلول‌های مرتب‌شده. پس از مرتب‌سازی در محیط کشت Neurobasal-A حاوی ۱٪ مکمل B27 و ۰.۵ میلی‌مولار GlutaMax، سلول‌ها بلافاصله روی اسلایدهای شیشه‌ای پوشیده شده با پلی-ال-لیزین (μ-Slide8 Well، Ibidi، شماره کاتالوگ ۸۰۸۲۶) کشت داده شدند و سپس به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و ۵٪ CO2 نگه داشته شدند تا سلول‌ها ته‌نشین شوند. تصویربرداری در زمان واقعی با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال لیزری Leica SP8 مجهز به لیزر سفید، HyD، لنز شیئی روغنی با دیافراگم عددی ۶۳×[۱.۴ (NA)] و یک مرحله گرمایش انجام شد.
موش به سرعت با دی اکسید کربن بیهوش و سر آن بریده شد، مغز به سرعت از جمجمه خارج شد و به برش‌های ساژیتال با ضخامت ۲۰۰ میکرومتر (برای آزمایش برچسب‌گذاری ۱۳C) یا ۲۷۵ میکرومتر (برای آزمایش دو فوتون) برش داده شد و با مواد زیر پر شد. بستنی (HM-650 V، Thermo Fisher Scientific، والدورف، آلمان) با مواد زیر پر شد: ۱۲۵ میلی‌مولار یخ سرد، اشباع‌شده با کربن (۹۵٪ O2 و ۵٪ CO2) کم Ca2 + مایع مغزی نخاعی مصنوعی (ACSF) NaCl، ۲.۵ میلی‌مولار KCl، ۱.۲۵ میلی‌مولار بافر فسفات سدیم، ۲۵ میلی‌مولار NaHCO3، ۲۵ میلی‌مولار گلوکز، ۰.۵ میلی‌مولار CaCl2 و ۳.۵ میلی‌مولار MgCl2 (فشار اسمزی ۳۱۰ تا ۳۳۰ میلی‌مول). برش‌های مغز به‌دست‌آمده را به یک محفظه پیش‌انکوباسیون حاوی Ca2+ACSF بالاتر (125.0 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار بافر فسفات سدیم، 25.0 میلی‌مولار NaHCO3، 25.0 میلی‌مولار d-گلوکز، 1.0 میلی‌مولار CaCl2 و 2.0 میلی‌مولار MgCl2) با pH 7.4 و 310 تا 320 میلی‌مولار منتقل کنید.
در طول فرآیند تصویربرداری، برش‌ها به یک اتاق تصویربرداری اختصاصی منتقل شدند و آزمایش تحت پرفیوژن مداوم ACSF در دمای ثابت 32 تا 33 درجه سانتیگراد انجام شد. برای تصویربرداری برشی از یک میکروسکوپ اسکن لیزری چند فوتونی (TCS SP8 MP-OPO، Leica Microsystems) مجهز به لنز شیئی Leica 25x (NA 0.95، آب)، لیزر Ti: Sapphire (Chameleon Vision II، Coherent) و ماژول FLIM (PicoHarp300، PicoQuant) استفاده شد.
FLIM مربوط به Grx1-roGFP2. تغییرات در حالت ردوکس سیتوپلاسمی PNها توسط FLIM دو فوتونی در برش‌های ساژیتال مغز اندازه‌گیری شد، جایی که حسگر زیستی Grx1-roGFP2، PNها را هدف قرار داد. در لایه PN، میدان اکتساب حدود 50 تا 80 میکرومتر زیر سطح برش انتخاب می‌شود تا از وجود یک PN قابل دوام (یعنی عدم وجود ساختار مهره‌ای یا تغییرات مورفولوژیکی عصبی در امتداد دندریت‌ها) و حسگر roGFP2 مثبت دوگانه و AAV که shRNA PCx یا توالی کنترل آن را کدگذاری می‌کند (هر کدام mCherry را به طور همزمان بیان می‌کنند) اطمینان حاصل شود. تصاویر تک پشته‌ای را با بزرگنمایی دیجیتال 2 برابر جمع‌آوری کنید [طول موج تحریک: 890 نانومتر؛ 512 نانومتر 512 پیکسل]. تشخیص: HyD داخلی، گروه فیلتر فلورسین ایزوتیوسیانات (FITC) و میانگین‌گیری تصویر در عرض 2 تا 3 دقیقه برای اطمینان از جمع‌آوری فوتون‌های کافی (در مجموع 1000 فوتون) برای برازش منحنی استفاده می‌شود. حساسیت پروب Grx1-roGFP2 و تأیید شرایط FLIM با نظارت بر مقدار طول عمر roGFP2 هنگام افزودن 10 میلی‌مولار H2O2 خارجی به ACSF پرفیوژن (برای به حداکثر رساندن اکسیداسیون، در نتیجه افزایش طول عمر) و سپس افزودن 2 میلی‌مولار دی‌تیوتریتول (به حداقل رساندن درجه کاهش، در نتیجه کاهش طول عمر) انجام شد (شکل S8، D تا G). از نرم‌افزار FLIMfit 5.1.1 برای تجزیه و تحلیل نتایج به دست آمده استفاده کنید، منحنی واپاشی نمایی واحد کل تصویر را بر IRF (تابع پاسخ دستگاه) اندازه‌گیری شده برازش دهید، و χ2 تقریباً برابر با 1 است. برای محاسبه طول عمر یک PN واحد، ماسک اطراف جسم عصبی به صورت دستی رسم شد و میانگین طول عمر در هر ماسک برای کمی‌سازی استفاده شد.
تجزیه و تحلیل پتانسیل میتوکندری. پس از انکوباسیون بخش حاد با ۱۰۰ نانومولار TMRM که مستقیماً به ACSF پرفیوژن شده به مدت ۳۰ دقیقه اضافه شد، تغییرات پتانسیل میتوکندریایی PNها توسط میکروسکوپ دو فوتونی اندازه‌گیری شد. تصویربرداری TMRM با تحریک پروب در طول موج ۹۲۰ نانومتر و استفاده از HyD داخلی (تترامتیل رودامین ایزوتیوسیانات: ۵۸۵/۴۰ نانومتر) برای جمع‌آوری سیگنال‌ها انجام شد؛ با استفاده از همان طول موج تحریک اما با استفاده از HyD داخلی متفاوت (FITC: ۵۲۵/۵۰) برای تصویربرداری از mtYFP. از افزونه Image Calculator نرم‌افزار ImageJ برای ارزیابی پتانسیل میتوکندری در سطح تک سلولی استفاده کنید. به طور خلاصه، معادله افزونه: signal = min (mtYFP, TMRM) برای شناسایی ناحیه میتوکندریایی که سیگنال TMRM را در پورکنژ سومالی در تصویر کانفوکال تک پشته‌ای کانال مربوطه نشان می‌دهد، استفاده می‌شود. سپس مساحت پیکسل در ماسک حاصل، اندازه‌گیری و سپس بر روی تصویر تک پشته‌ای آستانه مربوطه از کانال mtYFP نرمال‌سازی می‌شود تا کسر میتوکندریایی که پتانسیل میتوکندری را نشان می‌دهد، به دست آید.
تصویر با نرم‌افزار Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) از هم گسیخته‌سازی شد. برای تصاویر اسکن‌شده کاشی‌ها، مونتاژ یک کاشی واحد با استفاده از الگوریتم دوخت خودکار ارائه شده توسط نرم‌افزار LAS-X انجام می‌شود. پس از کالیبراسیون تصویر، از ImageJ و Adobe Photoshop برای پردازش بیشتر تصویر و تنظیم یکنواخت روشنایی و کنتراست استفاده کنید. برای آماده‌سازی گرافیکی از Adobe Illustrator استفاده کنید.
آنالیز تمرکز mtDNA. تعداد ضایعات mtDNA در بخش‌های مخچه‌ای که با آنتی‌بادی‌های علیه DNA برچسب‌گذاری شده بودند، توسط میکروسکوپ کانفوکال تعیین مقدار شد. هر ناحیه هدف برای جسم سلولی و هسته هر سلول ایجاد شد و ناحیه مربوطه با استفاده از افزونه Multi Measure (نرم‌افزار ImageJ) محاسبه شد. ناحیه هسته‌ای را از ناحیه جسم سلولی کم کنید تا ناحیه سیتوپلاسمی به دست آید. در نهایت، افزونه Analyze Particles (نرم‌افزار ImageJ) برای تعیین مقدار خودکار نقاط DNA سیتوپلاسمی که نشان‌دهنده mtDNA در تصویر آستانه هستند، استفاده شد و نتایج به‌دست‌آمده با میانگین PN موش‌های CTRL نرمال‌سازی شدند. نتایج به صورت میانگین تعداد نوکلئوزیدها در هر سلول بیان می‌شوند.
تحلیل بیان پروتئین. از افزونه Image Calculator در ImageJ برای ارزیابی بیان پروتئین در PN در سطح تک سلولی استفاده کنید. به طور خلاصه، در تصویر کانفوکال تک لایه از کانال مربوطه، از طریق معادله: signal = min (mtYFP، آنتی‌بادی)، ناحیه میتوکندریایی که واکنش‌پذیری ایمنی به یک آنتی‌بادی خاص در پورکینا نشان می‌دهد، شناسایی می‌شود. سپس ناحیه پیکسلی در ماسک حاصل، کمی‌سازی شده و سپس بر روی تصویر تک پشته‌ای آستانه مربوطه از کانال mtYFP نرمال‌سازی می‌شود تا کسر میتوکندریایی پروتئین نمایش داده شده به دست آید.
آنالیز تراکم سلول‌های پورکنژ. افزونه شمارنده سلولی ImageJ برای ارزیابی تراکم پورکنژ با تقسیم تعداد سلول‌های پورکنژ شمارش‌شده بر طول حلقه مخچه اشغال‌شده توسط سلول‌های شمارش‌شده، استفاده شد.
آماده‌سازی و جمع‌آوری نمونه. مغز موش‌های گروه کنترل و موش‌های Mfn2cKO در محلول 2% PFA/2.5% گلوتارآلدئید در بافر فسفات 0.1 مولار (PB) تثبیت شدند و سپس برش‌های کرونالی با استفاده از مژه‌داران (Leica Mikrosysteme GmbH، وین، اتریش) (با ضخامت 50 تا 60 میکرومتر) تهیه شدند. سپس به مدت 1 ساعت در بافر PB در تتراکسید 1% os و 1.5% فروسیانید پتاسیم در دمای اتاق تثبیت شدند. برش‌ها سه بار با آب مقطر شسته شدند و سپس به مدت 20 دقیقه با اتانول 70% حاوی 1% اورانیل استات رنگ‌آمیزی شدند. سپس برش‌ها در الکل درجه‌بندی شده دهیدراته شده و در رزین اپوکسی Durcupan ACM (رزین ریخته‌گری Araldite M) (Electron Microscopy Sciences، شماره کاتالوگ 14040) بین اسلایدهای شیشه‌ای با پوشش سیلیکونی قرار داده شدند و در نهایت در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت در فر پلیمریزه شدند. ناحیه قشر مخچه انتخاب شد و برش‌های فوق نازک ۵۰ نانومتری با استفاده از Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH، وین، اتریش) برش داده شدند و روی یک شبکه شکاف مسی ۲×۱ میلی‌متری که با فیلم پلی‌استایرن پوشانده شده بود، برداشته شدند. برش‌ها به مدت ۱۰ دقیقه با محلول ۴٪ اورانیل استات در H2O رنگ‌آمیزی شدند، چندین بار با H2O شسته شدند، سپس به مدت ۱۰ دقیقه با سیترات سرب رینولدز در H2O شسته شدند و سپس چندین بار با H2O شسته شدند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) با استفاده از دوربین دیجیتال TVIPS (سیستم پردازش تصویر و ویدئوی Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH، Gauting، USA، آلمان) گرفته شدند.
برای موش‌های آلوده به AAV، مغز جدا شده و به یک مقطع ساژیتال به ضخامت ۱ میلی‌متر برش داده شد و مخچه با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس برای شناسایی حلقه آلوده به AAV (یعنی بیان mCherry) بررسی شد. فقط آزمایش‌هایی که در آن‌ها تزریق AAV منجر به راندمان انتقال بسیار بالای لایه سلولی پورکنژ (یعنی تقریباً کل لایه) در حداقل دو حلقه مخچه متوالی می‌شود، استفاده می‌شوند. حلقه انتقال یافته با AAV برای تثبیت پس از یک شب (۴٪ PFA و ۲.۵٪ گلوتارآلدئید در بافر کوکوات ۰.۱ مولار) میکرودیسکشن شد و بیشتر پردازش شد. برای جاسازی EPON، بافت تثبیت شده با بافر کوکوات سدیم ۰.۱ مولار (Applichem) شسته شد و با ۲٪ OsO4 (os، خدمات علمی؛ Caco) در بافر کوکوات سدیم ۰.۱ مولار (Applichem) به مدت ۴ ساعت انکوبه شد، سپس به مدت ۲ ساعت شسته شد. ۳ بار با بافر کوکامید ۰.۱ مولار تکرار شد. پس از آن، از سری صعودی اتانول برای انکوباسیون هر محلول اتانول در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه برای دهیدراته کردن بافت استفاده شد. بافت به پروپیلن اکسید منتقل شد و یک شب در EPON (سیگما-آلدریچ) در دمای ۴ درجه سانتیگراد انکوبه شد. بافت را به مدت ۲ ساعت در دمای اتاق در EPON تازه قرار دهید و سپس آن را به مدت ۷۲ ساعت در دمای ۶۲ درجه سانتیگراد جاسازی کنید. از یک اولترا میکروتوم (Leica Microsystems, UC6) و یک چاقوی الماس (Diatome, Biel, Switzerland) برای برش مقاطع فوق نازک ۷۰ نانومتری استفاده کنید و با ۱.۵٪ اورانیل استات به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد رنگ‌آمیزی کنید و ۴ دقیقه با محلول سیترات سرب رنگ‌آمیزی کنید. تصاویر میکروسکوپ الکترونی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری JEM-2100 Plus (JEOL) مجهز به دوربین OneView 4K 16 بیتی (Gatan) و نرم‌افزار DigitalMicrograph (Gatan) گرفته شدند. برای تجزیه و تحلیل، تصاویر میکروسکوپ الکترونی با بزرگنمایی دیجیتال ۵۰۰۰ یا ۱۰۰۰۰ برابر گرفته شدند.
تجزیه و تحلیل مورفولوژیکی میتوکندری. برای همه تجزیه و تحلیل‌ها، خطوط هر میتوکندری به صورت دستی در تصاویر دیجیتال با استفاده از نرم‌افزار ImageJ ترسیم شدند. پارامترهای مورفولوژیکی مختلف تجزیه و تحلیل شدند. تراکم میتوکندری به صورت درصدی بیان می‌شود که با تقسیم کل مساحت میتوکندری هر سلول بر مساحت سیتوپلاسم (مساحت سیتوپلاسم = مساحت سلول - مساحت هسته سلول) × ۱۰۰ به دست می‌آید. گردی میتوکندری با فرمول [4π∙(مساحت/محیط ۲)] محاسبه می‌شود. مورفولوژی ایستا میتوکندری تجزیه و تحلیل شد و بر اساس شکل اصلی آنها به دو دسته ("لوله‌ای" و "تاول") تقسیم شد.
تجزیه و تحلیل تعداد و تراکم اتوفاگوزوم/لیزوزوم. از نرم‌افزار ImageJ برای ترسیم دستی خطوط هر اتوفاگوزوم/لیزوزوم در تصویر دیجیتال استفاده کنید. مساحت اتوفاگوزوم/لیزوزوم به صورت درصدی بیان می‌شود که با تقسیم کل مساحت ساختار اتوفاگوزوم/لیزوزوم هر سلول بر مساحت سیتوپلاسم (مساحت سیتوپلاسم = مساحت سلول - مساحت هسته) × ۱۰۰ محاسبه می‌شود. تراکم اتوفاگوزوم‌ها/لیزوزوم‌ها با تقسیم تعداد کل بر تعداد ساختارهای اتوفاگوزوم/لیزوزوم در هر سلول (بر حسب مساحت سیتوپلاسمی) محاسبه می‌شود (مساحت سیتوپلاسمی = مساحت سلول - مساحت هسته).
برچسب‌گذاری برای برش‌های حاد و آماده‌سازی نمونه. برای آزمایش‌هایی که نیاز به برچسب‌گذاری گلوکز دارند، برش‌های حاد مغز را به یک محفظه پیش از انکوباسیون منتقل کنید که حاوی کربن اشباع (95% O2 و 5% CO2)، Ca2 + ACSF بالا (125.0 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار بافر فسفات سدیم، 25.0 میلی‌مولار NaHCO3، 25.0 میلی‌مولار d-گلوکز، 1.0 میلی‌مولار CaCl2 و 2.0 میلی‌مولار MgCl2، تنظیم‌شده روی pH 7.4 و 310 تا 320 میلی‌اسمول) است که در آن گلوکز 13 C 6- جایگزینی گلوکز است (Eurisotop، شماره کاتالوگ CLM-1396). برای آزمایش‌هایی که نیاز به برچسب‌گذاری پیروات دارند، برش‌های حاد مغز را به Ca2 + ACSF بالاتر (125.0 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار بافر فسفات سدیم، 25.0 میلی‌مولار NaHCO3، 25.0 میلی‌مولار d-گلوکز، 1.0 میلی‌مولار CaCl2 و 2.0 میلی‌مولار MgCl2 اضافه کنید، pH را روی 7.4 و 310 تا 320 میلی‌اسمول تنظیم کنید) منتقل کنید و 1 میلی‌مولار 1-[1-13C] پیروات (Eurisotop، شماره کاتالوگ CLM-1082) اضافه کنید. برش‌ها را به مدت 90 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. در پایان آزمایش، برش‌ها به سرعت با محلول آبی (pH 7.4) حاوی 75 میلی‌مولار کربنات آمونیوم شسته شدند و سپس در نسبت 40:40:20 (v:v:v) استونیتریل (ACN): متانول: آب همگن شدند. پس از انکوباسیون برش‌ها روی یخ به مدت 30 دقیقه، نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 21000 گرم سانتریفیوژ شدند و محلول شفاف رویی در دستگاه تغلیظ SpeedVac خشک شد. پلت متابولیت خشک شده حاصل تا زمان تجزیه و تحلیل در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
آنالیز کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی اسیدهای آمینه نشاندار شده با 13 کربن. برای آنالیز کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی (LC-MS)، پلت متابولیت در 75 میکرولیتر آب درجه LC-MS (Honeywell) دوباره به حالت تعلیق درآمد. پس از سانتریفیوژ با سرعت 21000 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، 20 میکرولیتر از محلول رویی شفاف شده برای آنالیز شار اسید آمینه استفاده شد، در حالی که بقیه عصاره بلافاصله برای آنالیز آنیون استفاده شد (به زیر مراجعه کنید). آنالیز اسید آمینه با استفاده از پروتکل مشتق‌سازی بنزوئیل کلرید که قبلاً شرح داده شده است (55، 56) انجام شد. در مرحله اول، 10 میکرولیتر کربنات سدیم 100 میلی‌مولار (سیگما-آلدریچ) به 20 میکرولیتر عصاره متابولیت اضافه شد و سپس 10 میکرولیتر بنزوئیل کلرید 2٪ (سیگما-آلدریچ) به ACN درجه LC اضافه شد. نمونه به مدت کوتاهی ورتکس شد و سپس به مدت 5 دقیقه در دمای 20 درجه سانتیگراد با سرعت 21000 گرم سانتریفیوژ شد. مایع رویی شفاف شده را به یک ویال نمونه بردار خودکار 2 میلی لیتری با یک درج شیشه ای مخروطی (حجم 200 میکرولیتر) منتقل کنید. نمونه ها با استفاده از سیستم LC با کارایی فوق العاده بالا Acquity iClass (Waters) متصل به طیف سنج جرمی دقیق با وضوح بالا Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific) تجزیه و تحلیل شدند. برای تجزیه و تحلیل، 2 میکرولیتر از نمونه مشتق شده به یک ستون T3 سیلیکا با استحکام بالا 100×1.0 میلی متر (Waters) حاوی ذرات 1.8 میکرومتر تزریق شد. سرعت جریان 100 میکرولیتر در دقیقه است و سیستم بافر شامل بافر A (10 میلی مولار فرمات آمونیوم و 0.15٪ اسید فرمیک در آب) و بافر B (ACN) است. گرادیان به شرح زیر است: 0%B در دقیقه 0؛ 0%B. 0 تا 15% B در دقیقه 0 تا 0.1؛ 15 تا 17% B در دقیقه 0.1 تا 0.5؛ 17 تا 55% B در دقیقه 0.5 تا 14؛ 55 تا 70% B در دقیقه 14 تا 14.5؛ 14.5 تا 70 تا 100% B در دقیقه 18؛ 100% B در دقیقه 18 تا 19؛ 100 تا 0% B در دقیقه 19 تا 19.1؛ 0% B در دقیقه 19.1 تا 28 (55، 56). طیف‌سنج جرمی QE-HF در حالت یونیزاسیون مثبت با محدوده جرمی m/z (نسبت جرم/بار) 50 تا 750 کار می‌کند. وضوح اعمال شده 60000 است و هدف یونی کنترل بهره (AGC) به دست آمده 3×106 و حداکثر زمان یونش 100 میلی‌ثانیه است. منبع یونیزاسیون الکترواسپری گرم شده (ESI) با ولتاژ اسپری 3.5 کیلوولت، دمای مویرگی 250 درجه سانتیگراد، جریان هوای غلاف 60 واحد نجومی (واحد دلخواه) و جریان هوای کمکی 20 واحد نجومی (250 درجه سانتیگراد) کار می‌کند. لنز S روی 60 واحد نجومی تنظیم شده است.
کروماتوگرافی آنیونی-آنالیز MS اسیدهای آلی نشاندار شده با 13C. رسوب متابولیت باقیمانده (55 میکرولیتر) با استفاده از سیستم کروماتوگرافی یونی Dionex (ICS 5000+، Thermo Fisher Scientific) متصل به طیف‌سنج جرمی QE-HF (Thermo Fisher Scientific) آنالیز شد. به طور خلاصه، 5 میکرولیتر از عصاره متابولیت به ستون Dionex IonPac AS11-HC مجهز به HPLC (2 میلی‌متر × 250 میلی‌متر، اندازه ذرات 4 میکرومتر، Thermo Fisher Scientific) در حالت حلقه جزئی push-in با نسبت پر شدن 1 تزریق شد. ستون محافظ Dionex IonPac AG11-HC (2 میلی‌متر × 50 میلی‌متر، 4 میکرومتر، Thermo Fisher Scientific). دمای ستون در 30 درجه سانتیگراد حفظ می‌شود و نمونه‌گیر خودکار روی 6 درجه سانتیگراد تنظیم می‌شود. از یک کارتریج هیدروکسید پتاسیم که با آب دیونیزه تهیه شده است برای ایجاد گرادیان هیدروکسید پتاسیم از طریق مولد شوینده استفاده کنید. جداسازی متابولیت‌ها با سرعت جریان ۳۸۰ میکرولیتر بر دقیقه، با اعمال گرادیان زیر: ۰ تا ۳ دقیقه، ۱۰ میلی‌مولار KOH؛ ۳ تا ۱۲ دقیقه، ۱۰ تا ۵۰ میلی‌مولار KOH؛ ۱۲ تا ۱۹ دقیقه، ۵۰ تا ۱۰۰ میلی‌مولار KOH؛ ۱۹ تا ۲۱ دقیقه، ۱۰۰ میلی‌مولار KOH؛ ۲۱ تا ۲۱.۵ دقیقه، ۱۰۰ تا ۱۰ میلی‌مولار KOH. ستون به مدت ۸.۵ دقیقه تحت ۱۰ میلی‌مولار KOH دوباره به تعادل رسید.
متابولیت‌های شسته شده پس از ستون با جریان مکمل ایزوپروپانول با غلظت ۱۵۰ میکرولیتر در دقیقه ترکیب شده و سپس به یک طیف‌سنج جرمی با وضوح بالا که در حالت یونیزاسیون منفی کار می‌کند، هدایت می‌شوند. طیف‌سنج جرمی (MS) محدوده جرمی از m/z 50 تا ۷۵۰ را با وضوح ۶۰۰۰۰ رصد می‌کند. AGC روی ۱×۱۰^۶ تنظیم شده و حداکثر زمان یونیزاسیون روی ۱۰۰ میلی‌ثانیه نگه داشته می‌شود. منبع ESI گرم شده با ولتاژ اسپری ۳.۵ کیلوولت کار می‌کند. سایر تنظیمات منبع یون به شرح زیر است: دمای مویرگی ۲۷۵ درجه سانتیگراد؛ جریان گاز غلاف، ۶۰ واحد نجومی؛ جریان گاز کمکی، ۲۰ واحد نجومی در دمای ۳۰۰ درجه سانتیگراد و تنظیم لنز S روی ۶۰ واحد نجومی.
تجزیه و تحلیل داده‌های متابولیت‌های نشاندار شده با 13C. برای تجزیه و تحلیل داده‌های نسبت ایزوتوپی از نرم‌افزار TraceFinder (نسخه 4.2، Thermo Fisher Scientific) استفاده کنید. هویت هر ترکیب توسط یک ترکیب مرجع قابل اعتماد تأیید و به طور مستقل تجزیه و تحلیل شد. به منظور انجام تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ایزوتوپی، مساحت کروماتوگرام یونی استخراج شده (XIC) هر ایزوتوپ 13C (Mn) از [M + H] + استخراج شد، که در آن n عدد کربن ترکیب هدف است که برای تجزیه و تحلیل اسیدهای آمینه یا [MH] + برای تجزیه و تحلیل آنیون‌ها استفاده می‌شود. دقت جرمی XIC کمتر از پنج قسمت در میلیون است و دقت RT 0.05 دقیقه است. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی با محاسبه نسبت هر ایزوتوپ شناسایی شده به مجموع تمام ایزوتوپ‌های ترکیب مربوطه انجام می‌شود. این نسبت‌ها به صورت مقادیر درصد برای هر ایزوتوپ ارائه می‌شوند و نتایج به صورت غنی‌سازی درصد مولی (MPE) بیان می‌شوند، همانطور که قبلاً توضیح داده شد (42).
گلوله نورون منجمد در متانول 80٪ (v/v) سرد شده در یخ همگن شد، ورتکس شد و به مدت 30 دقیقه در دمای 20- درجه سانتیگراد انکوبه شد. نمونه را دوباره ورتکس کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای 4+ درجه سانتیگراد هم بزنید. نمونه به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 21000 گرم سانتریفیوژ شد و سپس مایع رویی حاصل با استفاده از متمرکزکننده SpeedVac در دمای 25 درجه سانتیگراد برای تجزیه و تحلیل بعدی جمع آوری و خشک شد. همانطور که در بالا توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل LC-MS بر روی اسیدهای آمینه سلول‌های مرتب شده انجام شد. با استفاده از TraceFinder (نسخه 4.2، Thermo Fisher Scientific)، تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از جرم تک ایزوتوپی هر ترکیب انجام شد. نرمال‌سازی چندکی داده‌های متابولیت با استفاده از بسته نرم‌افزاری preprocessCore (57) انجام شد.
آماده‌سازی برش. موش به سرعت با دی‌اکسید کربن بی‌هوش و سر آن بریده شد، مغز به سرعت از جمجمه خارج شد و با چاقوی لرزان پر از یخ (HM-650 V، Thermo Fisher Scientific، والدورف، آلمان) به برش‌های ساژیتال 300 تا 375 میکرومتری تبدیل شد. گازسازی با کربن سرد (95٪ O2 و 5٪ CO2). Ca2 کم + ACSF (125.0 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار بافر فسفات سدیم، 25.0 میلی‌مولار NaHCO3، 25.0 میلی‌مولار d-گلوکز، 1.0 میلی‌مولار CaCl2 و 6.0 میلی‌مولار MgCl2. تنظیم pH روی 7.4 و 310 تا 330 میلی‌اسمول). برش‌های مغز به‌دست‌آمده را به محفظه‌ای حاوی Ca2+ACSF بالاتر (125.0 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار KCl، 1.25 میلی‌مولار بافر فسفات سدیم، 25.0 میلی‌مولار NaHCO3، 25.0 میلی‌مولار d-گلوکز، 4.0 میلی‌مولار CaCl2 و 3.5 میلی‌مولار MgCl2) با pH 7.4 و 310 تا 320 میلی‌اسمول منتقل کنید. برش‌ها را به مدت 20 تا 30 دقیقه نگهداری کنید تا قبل از ثبت، قابل بازیابی باشند.
ضبط. برای تمام ضبط‌ها از یک صفحه میکروسکوپ مجهز به محفظه ضبط ثابت و یک لنز شیئی غوطه‌وری در آب با بزرگنمایی 20 برابر (Scientifica) استفاده شد. سلول‌های پورکنژ فرضی بر اساس (i) اندازه بدن، (ii) محل آناتومیکی مخچه و (iii) بیان ژن گزارشگر فلورسنت mtYFP شناسایی شدند. پیپت پچ با مقاومت نوک 5 تا 11 مگا اهم توسط یک لوله مویین شیشه‌ای بوروسیلیکات (GB150-10، 0.86 میلی‌متر × 1.5 میلی‌متر × 100 میلی‌متر، Science Products، Hofheim، آلمان) و یک پیپت افقی Instruments (P-1000، Sutter)، Novato، CA بیرون کشیده می‌شود. تمام ضبط‌ها توسط تقویت‌کننده گیره پچ ELC-03XS npi (npi electronic GmbH، Tam، آلمان) انجام شد که توسط نرم‌افزار Signal (نسخه 6.0، Cambridge Electronic، کمبریج، انگلستان) کنترل می‌شد. آزمایش با نرخ نمونه‌برداری 12.5 کیلوهرتز ضبط شد. سیگنال با دو فیلتر بسل کوتاه‌گذر با فرکانس‌های قطع به ترتیب ۱.۳ و ۱۰ کیلوهرتز فیلتر می‌شود. ظرفیت خازنی غشاء و پیپت توسط مدار جبران با استفاده از تقویت‌کننده جبران می‌شود. تمام آزمایش‌ها تحت کنترل یک دوربین Orca-Flash 4.0 (هاماماتسو، گردن، آلمان) انجام شد که توسط نرم‌افزار Hokawo (نسخه ۲.۸، هاماماتسو، گردن، آلمان) کنترل می‌شد.
پیکربندی و آنالیز روتین کل سلول. بلافاصله قبل از ثبت، پیپت را با محلول داخلی حاوی مواد زیر پر کنید: 4.0 میلی‌مولار KCl، 2.0 میلی‌مولار NaCl، 0.2 میلی‌مولار EGTA، 135.0 میلی‌مولار گلوکونات پتاسیم، 10.0 میلی‌مولار Hepes، 4.0 میلی‌مولار ATP (Mg)، 0.5 میلی‌مولار گوانوزین تری فسفات (GTP) (Na) و 10.0 میلی‌مولار کراتینین فسفات روی pH 7.25 تنظیم شدند و فشار اسمزی 290 میلی‌اسمول (ساکارز) بود. بلافاصله پس از اعمال نیروی 0 pA برای پارگی غشاء، پتانسیل استراحت غشاء اندازه‌گیری شد. مقاومت ورودی با اعمال جریان‌های فوق قطبی 40-، 30-، 20- و 10- pA اندازه‌گیری می‌شود. بزرگی پاسخ ولتاژ را اندازه‌گیری کرده و از قانون اهم برای محاسبه مقاومت ورودی استفاده کنید. فعالیت خودبخودی به مدت 5 دقیقه در یک گیره ولتاژ ثبت شد و sPSC با استفاده از یک اسکریپت تشخیص نیمه اتوماتیک در Igor Pro (نسخه 32 7.01، WaveMetrics، Lake Oswego، Oregon، USA) شناسایی و اندازه‌گیری شد. منحنی IV و جریان حالت پایدار با بستن باتری در پتانسیل‌های مختلف (از -110 میلی‌ولت شروع می‌شود) و افزایش ولتاژ در مراحل 5 میلی‌ولت اندازه‌گیری می‌شوند. تولید AP با اعمال جریان دپلاریزه کننده آزمایش شد. سلول را در -70 میلی‌ولت در حین اعمال پالس جریان دپلاریزه کننده گیره کنید. اندازه گام هر واحد ضبط را جداگانه تنظیم کنید (10 تا 60 pA). حداکثر فرکانس AP را با شمارش دستی پالس‌هایی که باعث بالاترین فرکانس AP می‌شوند، محاسبه کنید. آستانه AP با استفاده از مشتق دوم پالس دپلاریزاسیون که ابتدا یک یا چند AP را فعال می‌کند، تجزیه و تحلیل می‌شود.
پیکربندی و تجزیه و تحلیل پچ سوراخ‌دار. ثبت پچ سوراخ‌دار را با استفاده از پروتکل‌های استاندارد انجام دهید. از یک پیپت بدون ATP و GTP استفاده کنید که حاوی مواد زیر نباشد: 128 میلی‌مولار گلوکونات پتاسیم، 10 میلی‌مولار KCl، 10 میلی‌مولار Hepes، 0.1 میلی‌مولار EGTA و 2 میلی‌مولار MgCl2، و pH را روی 7.2 (با استفاده از KOH) تنظیم کنید. ATP و GTP از محلول داخل سلولی حذف می‌شوند تا از نفوذپذیری کنترل نشده غشای سلولی جلوگیری شود. پیپت پچ با یک محلول داخلی حاوی آمفوتریسین (تقریباً 200 تا 250 میکروگرم در میلی‌لیتر؛ G4888، سیگما-آلدریچ) پر می‌شود تا یک ثبت پچ سوراخ‌دار به دست آید. آمفوتریسین در دی متیل سولفوکسید حل شد (غلظت نهایی: 0.1 تا 0.3٪؛ DMSO؛ D8418، سیگما-آلدریچ). غلظت DMSO مورد استفاده هیچ تأثیر قابل توجهی بر نورون‌های مورد مطالعه نداشت. در طول فرآیند پانچ، مقاومت کانال (Ra) به طور مداوم پایش شد و آزمایش پس از تثبیت دامنه Ra و AP (20-40 دقیقه) آغاز شد. فعالیت خودبخودی در یک گیره ولتاژ و/یا جریان به مدت 2 تا 5 دقیقه اندازه‌گیری شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از Igor Pro (نسخه 7.05.2، WaveMetrics، ایالات متحده)، Excel (نسخه 2010، شرکت مایکروسافت، ردموند، ایالات متحده) و GraphPad Prism (نسخه 8.1.2، GraphPad Software Inc.، لا هویا، کالیفرنیا). ایالات متحده انجام شد. به منظور شناسایی APهای خودبخودی، از افزونه NeuroMatic v3.0c IgorPro استفاده می‌شود. APها را با استفاده از یک آستانه مشخص که به صورت جداگانه برای هر رکورد تنظیم می‌شود، به طور خودکار شناسایی کنید. با استفاده از فاصله اسپایک، فرکانس اسپایک را با حداکثر فرکانس اسپایک لحظه‌ای و میانگین فرکانس اسپایک تعیین کنید.
جداسازی PN. با تطبیق با پروتکل منتشر شده قبلی، PNها در مرحله مشخصی (58) از مخچه موش خالص‌سازی شدند. به طور خلاصه، مخچه تشریح و در محیط جداسازی سرد [بدون HBSS Ca2+ و Mg2+، غنی‌شده با 20 میلی‌مولار گلوکز، پنی‌سیلین (50 واحد در میلی‌لیتر) و استرپتومایسین (0.05 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)] چرخانده شد و سپس محیط در پاپائین [HBSS، غنی‌شده با 1-سیستئین·HCl (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، پاپائین (16 واحد در میلی‌لیتر) و دئوکسی ریبونوکلئاز I (DNase I؛ 0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)] هضم شد. به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد قرار داده شد. ابتدا بافت‌ها را در محیط HBSS حاوی موکوس تخم مرغ (10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، BSA (10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) و DNase (0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) در دمای اتاق برای جلوگیری از هضم آنزیمی بشویید و سپس در محیط HBSS حاوی 20 میلی‌مولار گلوکز به آرامی آسیاب کنید. پنی‌سیلین (50 واحد در میلی‌لیتر)، استرپتومایسین (0.05 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) و DNase (0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) در HBSS به آرامی آسیاب می‌شوند تا سلول‌های منفرد آزاد شوند. سوسپانسیون سلولی حاصل از طریق یک صافی سلولی 70 میکرومتری فیلتر شد، سپس سلول‌ها با سانتریفیوژ (1110 دور در دقیقه، 5 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد) رسوب داده شدند و در محیط جداکننده [HBSS، غنی‌شده با 20 میلی‌مولار گلوکز، 20٪ سرم جنین گاوی، پنی‌سیلین (50 واحد در میلی‌لیتر) و استرپتومایسین (0.05 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)] دوباره به حالت تعلیق درآمدند. زیست‌پذیری سلول‌ها را با پروپیدیوم یدید ارزیابی کنید و تراکم سلول‌ها را به 1×106 تا 2×106 سلول در میلی‌لیتر تنظیم کنید. قبل از فلوسایتومتری، سوسپانسیون از طریق یک صافی سلولی 50 میکرومتری فیلتر شد.
دستگاه فلوسایتومتر. مرتب‌سازی سلول‌ها در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد با استفاده از دستگاه FACSAria III (BD Biosciences) و نرم‌افزار FACSDiva (BD Biosciences، نسخه ۸.۰.۱) انجام شد. سوسپانسیون سلولی با استفاده از یک نازل ۱۰۰ میکرومتری تحت فشار ۲۰ psi با سرعت تقریبی ۲۸۰۰ رویداد در ثانیه مرتب شد. از آنجایی که معیارهای دروازه‌بندی سنتی (اندازه سلول، تمایز دووجهی و ویژگی‌های پراکندگی) نمی‌توانند جداسازی صحیح PN را از سایر انواع سلول‌ها تضمین کنند، استراتژی دروازه‌بندی بر اساس مقایسه مستقیم شدت YFP و خودفلورسانس در موش‌های mitoYFP+ ​​و mitoYFP- کنترل تنظیم می‌شود. YFP با تابش خط لیزر ۴۸۸ نانومتر به نمونه تحریک می‌شود و سیگنال با استفاده از یک فیلتر عبور باند ۵۳۰/۳۰ نانومتر شناسایی می‌شود. در موش‌های mitoYFP+، از قدرت نسبی ژن گزارشگر Rosa26-mitoYFP نیز برای تشخیص قطعات جسم نورونی و آکسون استفاده می‌شود. 7-AAD با لیزر زرد 561 نانومتر تحریک و با فیلتر باندگذر 675/20 نانومتر شناسایی شد تا سلول‌های مرده حذف شوند. به منظور جداسازی همزمان آستروسیت‌ها، سوسپانسیون سلولی با ACSA-2-APC رنگ‌آمیزی شد، سپس نمونه با خط لیزر 640 نانومتر تابش داده شد و از فیلتر باندگذر 660/20 نانومتر برای تشخیص سیگنال استفاده شد.
سلول‌های جمع‌آوری‌شده با سانتریفیوژ (1110 دور در دقیقه، 5 دقیقه، 4 درجه سانتی‌گراد) رسوب داده شدند و تا زمان استفاده در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. موش‌های Mfn2cKO و توله‌های آنها در همان روز طبقه‌بندی می‌شوند تا تنوع رویه به حداقل برسد. ارائه و تجزیه و تحلیل داده‌های FACS با استفاده از نرم‌افزار FlowJo (FlowJo LLC، اشلند، اورگان، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.
همانطور که در بالا ذکر شد (59)، از PCR در زمان واقعی برای جداسازی DNA از نورون‌های مرتب شده برای تعیین مقدار mtDNA بعدی استفاده می‌شود. خطی بودن و حساسیت آستانه در ابتدا با اجرای qPCR روی تعداد مختلفی از سلول‌ها آزمایش شدند. به طور خلاصه، 300 PN را در یک بافر لیز کننده شامل 50 میلی‌مولار tris-HCl (pH 8.5)، 1 میلی‌مولار EDTA، 0.5٪ Tween 20 و پروتئیناز K (200 نانوگرم در میلی‌لیتر) جمع‌آوری کرده و به مدت 120 دقیقه در دمای 55 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. سلول‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد انکوبه شدند تا از غیرفعال شدن کامل پروتئیناز K اطمینان حاصل شود. با استفاده از یک پروب TaqMan (Thermo Fisher) مخصوص mt-Nd1، mtDNA با PCR نیمه کمی در سیستم PCR در زمان واقعی 7900HT (Thermo Fisher Scientific) اندازه‌گیری شد. ژن‌های Science، شماره کاتالوگ Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific، شماره کاتالوگ AIVI3E8) و 18S (Thermo Fisher Scientific، شماره کاتالوگ Hs99999901_s1).
آماده‌سازی نمونه پروتئوم. با حرارت دادن محلول در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۰ دقیقه و اعمال فراصوت، در بافر لیز [۶ مولار گوانیدین کلرید، ۱۰ میلی‌مولار تریس(۲-کربوکسی اتیل) فسفین هیدروکلراید، ۱۰ میلی‌مولار کلرواستامید و ۱۰۰ میلی‌مولار پلت‌های نورونی منجمد تریس-لیز در HCl]. روی بایورپتور (دیاژنود) به مدت ۱۰ دقیقه (۳۰ ثانیه پالس / ۳۰ ثانیه دوره مکث). نمونه به نسبت ۱:۱۰ در ۲۰ میلی‌مولار تریس-HCl (pH ۸.۰) رقیق شد، با ۳۰۰ نانوگرم تریپسین گلد (پرومگا) مخلوط شد و برای هضم کامل، یک شب در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در روز دوم، نمونه به مدت ۲۰ دقیقه با سرعت ۲۰۰۰۰ گرم سانتریفیوژ شد. محلول رویی با ۰.۱٪ اسید فرمیک رقیق شد و محلول با StageTips ساخته شده نمک‌زدایی شد. نمونه در دستگاه SpeedVac (تغلیظ‌کننده Eppendorf plus 5305) در دمای ۴۵ درجه سانتیگراد خشک شد و سپس پپتید در اسید فرمیک ۰.۱٪ به حالت تعلیق درآمد. همه نمونه‌ها به طور همزمان توسط یک فرد تهیه شدند. به منظور تجزیه و تحلیل نمونه‌های آستروسیت، ۴ میکروگرم پپتید نمک‌زدایی شده با یک برچسب جرمی پشت سر هم (TMT10plex، شماره کاتالوگ ۹۰۱۱۰، Thermo Fisher Scientific) با نسبت پپتید به معرف TMT ۱:۲۰ برچسب‌گذاری شدند. برای برچسب‌گذاری TMT، ۰.۸ میلی‌گرم معرف TMT در ۷۰ میکرولیتر ACN بی‌آب دوباره به حالت تعلیق درآمد و پپتید خشک شده به ۹ میکرولیتر TEAB (تری اتیل آمونیوم بی‌کربنات) ۰.۱ مولار تبدیل شد که به آن ۷ میکرولیتر معرف TMT در ACN اضافه شد. غلظت ۴۳.۷۵٪ بود. پس از 60 دقیقه انکوباسیون، واکنش با 2 میکرولیتر هیدروکسیل آمین 5٪ خاموش شد. پپتیدهای نشاندار شده جمع‌آوری، خشک، در 200 میکرولیتر اسید فرمیک 0.1٪ (FA) دوباره به حالت تعلیق درآمدند، به دو قسمت تقسیم شدند و سپس با استفاده از StageTips ساخته شده، نمک‌زدایی شدند. با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالای UltiMate 3000 (کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالای UltiMate 3000)، یکی از دو نیمه روی یک ستون کروماتوگرافی Acquity با ابعاد 1 میلی‌متر در 150 میلی‌متر پر از ذرات C18 با اندازه 130 در 1.7 میکرومتر (واترز، شماره کاتالوگ SKU: 186006935) تجزیه شد. Thermo Fisher Scientific). پپتیدها را با سرعت جریان 30 میکرولیتر در دقیقه جدا کنید، به مدت 85 دقیقه با شیب گام به گام 96 دقیقه از بافر B با غلظت 1% تا 50% جدا کنید، به مدت 3 دقیقه از بافر B با غلظت 50% تا 95% جدا کنید، سپس به مدت 8 دقیقه بافر B با غلظت 95% جدا کنید؛ بافر A شامل 5% ACN و 10 میلی‌مولار بی‌کربنات آمونیوم (ABC) و بافر B شامل 80% ACN و 10 میلی‌مولار ABC است. هر 3 دقیقه بخش‌ها را جمع‌آوری کرده و آنها را در دو گروه (1 + 17، 2 + 18 و غیره) ترکیب کنید و در سانتریفیوژ خلاء خشک کنید.
آنالیز LC-MS/MS. برای طیف‌سنجی جرمی، پپتیدها (شماره r119.aq) روی یک ستون تحلیلی PicoFrit با قطر داخلی 25 سانتی‌متر و 75 میکرومتر (لنز شیئی جدید، شماره قطعه PF7508250) مجهز به محیط کشت 1.9 میکرومتری ReproSil-Pur 120 C18-AQ (دکتر مایش، mat)، از EASY-nLC 1200 (ترمو فیشر ساینتیفیک، آلمان) جدا شدند. ستون در دمای 50 درجه سانتیگراد نگهداری شد. بافرهای A و B به ترتیب 0.1٪ اسید فرمیک در آب و 0.1٪ اسید فرمیک در 80٪ ACN هستند. پپتیدها به مدت 65 دقیقه از بافر B با غلظت 6٪ تا 31٪ و به مدت 5 دقیقه از بافر B با غلظت 31٪ تا 50٪ با گرادیان 200 نانولیتر در دقیقه جدا شدند. پپتیدهای شسته شده با استفاده از طیف‌سنج جرمی Orbitrap Fusion (شرکت Thermo Fisher Scientific) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. اندازه‌گیری m/z پیش‌ساز پپتید با وضوح 120000 در محدوده 350 تا 1500 m/z انجام شد. با استفاده از انرژی برخورد نرمال‌شده 27%، قوی‌ترین پیش‌ساز با حالت بار 2 تا 6 برای تجزیه تله C با انرژی بالا (HCD) انتخاب شد. زمان چرخه روی 1 ثانیه تنظیم شده است. مقدار m/z قطعه پپتیدی در تله یونی با استفاده از کوچکترین هدف AGC برابر با 5×104 و حداکثر زمان تزریق 86 میلی‌ثانیه اندازه‌گیری شد. پس از قطعه قطعه شدن، پیش‌ساز به مدت 45 ثانیه در لیست حذف پویا قرار گرفت. پپتیدهای نشاندار شده با TMT بر روی ستون Acclaim PepMap با قطر 50 سانتی‌متر و قطر 75 میکرومتر (Thermo Fisher Scientific، شماره کاتالوگ 164942) جداسازی شدند و طیف‌های مهاجرت بر روی طیف‌سنج جرمی Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) مجهز به تجهیزات یون‌های شکل موج نامتقارن با میدان بالا (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) که در دو ولتاژ جبرانی 50- و 70- ولت کار می‌کند، تجزیه و تحلیل شدند. MS3 که بر اساس پیش‌ساز همگام‌سازی انتخاب شده است، برای اندازه‌گیری سیگنال یون گزارش TMT استفاده می‌شود. جداسازی پپتید بر روی EASY-nLC 1200 با استفاده از یک شویش گرادیان خطی 90٪، با غلظت بافر 6٪ تا 31٪ انجام شد؛ بافر A شامل 0.1٪ FA و بافر B شامل 0.1٪ FA و 80٪ ACN بود. ستون تحلیلی در دمای 50 درجه سانتیگراد کار می‌کند. از FreeStyle (نسخه ۱.۶، Thermo Fisher Scientific) برای تقسیم فایل اصلی بر اساس ولتاژ جبران FAIMS استفاده کنید.
شناسایی و تعیین مقدار پروتئین. با استفاده از موتور جستجوی یکپارچه Andromeda، داده‌های اصلی با استفاده از MaxQuant نسخه 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) تجزیه و تحلیل شدند. علاوه بر توالی‌های Cre recombinase و YFP به‌دست‌آمده از Aequorea victoria، طیف‌های قطعه پپتیدی برای توالی متعارف و توالی ایزوفرم پروتئوم مرجع موش (شناسه پروتئوم UP000000589، دانلود شده از UniProt در ماه مه 2017) جستجو شدند. اکسیداسیون متیونین و استیلاسیون N-ترمینال پروتئین به عنوان تغییرات متغیر تنظیم شدند؛ متیلاسیون سیستئین کارباموئیل به عنوان تغییرات ثابت تنظیم شد. پارامترهای هضم روی "ویژگی" و "تریپسین/P" تنظیم شدند. حداقل تعداد پپتیدهای مورد استفاده برای شناسایی پروتئین 1 است؛ حداقل تعداد پپتیدهای منحصر به فرد 0 است. تحت شرایط تطبیق نقشه پپتید، نرخ شناسایی پروتئین 0.01 بود. گزینه «پپتید دوم» فعال است. از گزینه «مطابقت بین اجراها» برای انتقال شناسایی‌های موفق بین فایل‌های اصلی مختلف استفاده کنید. برای کمی‌سازی بدون برچسب (LFQ) از تعداد حداقل نسبت LFQ برابر با 1 استفاده کنید (60). شدت LFQ برای حداقل دو مقدار معتبر در حداقل یک گروه ژنوتیپ در هر نقطه زمانی فیلتر می‌شود و از یک توزیع نرمال با عرض 0.3 برون‌یابی شده و به سمت پایین 1.8 حرکت می‌کند. از پلتفرم محاسباتی Perseus (https://maxquant.net/perseus/) و R (https://r-project.org/) برای تجزیه و تحلیل نتایج LFQ استفاده کنید. برای تجزیه و تحلیل بیان افتراقی از آزمون t دو طرفه متوسط ​​از بسته نرم‌افزاری limma استفاده شد (61). تجزیه و تحلیل داده‌های اکتشافی با استفاده از ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally و pheatmap انجام شد. داده‌های پروتئومیکس مبتنی بر TMT با استفاده از MaxQuant نسخه 1.6.10.43 تجزیه و تحلیل شدند. جستجوی داده‌های خام پروتئومیکس از پایگاه داده پروتئومیکس انسانی UniProt که در سپتامبر ۲۰۱۸ دانلود شده است. این تجزیه و تحلیل شامل ضریب تصحیح خلوص ایزوتوپ ارائه شده توسط سازنده است. برای تجزیه و تحلیل بیان افتراقی از limma در R استفاده کنید. داده‌های اصلی، نتایج جستجوی پایگاه داده و گردش کار و نتایج تجزیه و تحلیل داده‌ها، همگی از طریق مخزن شریک PRIDE با شناسه مجموعه داده PXD019690 در اتحاد ProteomeXchange ذخیره می‌شوند.
حاشیه‌نویسی‌های عملکردی، تحلیل را غنی‌تر می‌کنند. از ابزار تحلیل مسیر نبوغ (QIAGEN) برای تعیین غنای اصطلاحات حاشیه‌نویسی عملکردی مجموعه داده‌ها در 8 هفته استفاده شد (شکل 1). به طور خلاصه، فهرست کمی پروتئین به‌دست‌آمده از تحلیل داده‌های LC-MS/MS (طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم) با معیارهای فیلتر زیر استفاده می‌شود: Mus musculus به عنوان گونه و پس‌زمینه انتخاب می‌شود و دسته، مقدار P تنظیم‌شده توسط Benjamini را برای غنی‌سازی 0.05 یا کمتر که معنی‌دار در نظر گرفته می‌شود، نشان می‌دهد. برای این نمودار، پنج دسته اضافی برتر در هر خوشه بر اساس مقدار P تنظیم‌شده نشان داده شده است. با استفاده از آزمون t چندگانه، با استفاده از برنامه تقویت خطی دو مرحله‌ای Benjamini، Krieger و Yekutieli (Q = 5%)، تحلیل بیان پروتئین در طول زمان بر روی کاندیداهای مهم شناسایی‌شده در هر دسته انجام می‌شود و هر ردیف به‌طور جداگانه تحلیل می‌شود. نیازی به اتخاذ یک انحراف معیار ثابت نیست.
به منظور مقایسه نتایج این مطالعه با پایگاه‌های داده منتشر شده و ایجاد نمودار ون در شکل 1، فهرست کمی پروتئین را با حاشیه‌نویسی‌های MitoCarta 2.0 ترکیب کردیم (24). از ابزار آنلاین Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) برای ایجاد نمودار استفاده کنید.
برای اطلاعات دقیق در مورد رویه‌های آماری مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل پروتئومیکس، لطفاً به بخش مربوطه از مواد و روش‌ها مراجعه کنید. برای سایر آزمایش‌ها، اطلاعات دقیق را می‌توانید در راهنمای مربوطه بیابید. مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد، تمام داده‌ها به صورت میانگین ± SEM بیان شده‌اند و تمام تجزیه و تحلیل‌های آماری با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism 8.1.2 انجام شده است.
برای مطالب تکمیلی این مقاله، لطفاً به http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 مراجعه کنید.
این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution-Non-Commercial توزیع شده است، که استفاده، توزیع و تکثیر در هر رسانه‌ای را مجاز می‌داند، مادامی که استفاده نهایی برای سود تجاری نباشد و فرض بر این باشد که اثر اصلی صحیح است. مرجع.
توجه: ما فقط از شما می‌خواهیم آدرس ایمیل خود را ارائه دهید تا شخصی که به صفحه توصیه می‌کنید بداند که می‌خواهید ایمیل را ببیند و اینکه هرزنامه نیست. ما هیچ آدرس ایمیلی را ثبت نخواهیم کرد.
این سوال برای بررسی اینکه آیا شما بازدیدکننده هستید یا خیر و جلوگیری از ارسال خودکار هرزنامه استفاده می‌شود.
توسط E. Motori، I. Atanassov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.-G. لارسون
تجزیه و تحلیل پروتئومیکس نورون‌های ناکارآمد نشان داد که برنامه‌های متابولیکی برای مقابله با تخریب عصبی فعال می‌شوند.
توسط E. Motori، I. Atanassov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.-G. لارسون
تجزیه و تحلیل پروتئومیکس نورون‌های ناکارآمد نشان داد که برنامه‌های متابولیکی برای مقابله با تخریب عصبی فعال می‌شوند.
©2020 انجمن آمریکایی برای پیشرفت علم. تمامی حقوق محفوظ است AAAS شریک HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER است. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.