از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتیجه، توصیه می‌کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
اسید پروپیونیک (PPA) برای مطالعه نقش اختلال عملکرد میتوکندری در اختلالات عصبی-رشدی مانند اختلال طیف اوتیسم استفاده می‌شود. PPA به عنوان مختل کننده بیوژنز، متابولیسم و ​​گردش میتوکندری شناخته شده است. با این حال، اثرات PPA بر دینامیک، شکافت و همجوشی میتوکندری به دلیل ماهیت زمانی پیچیده این مکانیسم‌ها همچنان مشکل‌ساز است. در اینجا، ما از تکنیک‌های تصویربرداری کمی مکمل برای بررسی چگونگی تأثیر PPA بر فراساختار، مورفولوژی و دینامیک میتوکندری در سلول‌های SH-SY5Y شبه نورونی استفاده می‌کنیم. PPA (5 میلی‌مولار) باعث کاهش قابل توجهی در مساحت میتوکندری (p < 0.01)، قطر و محیط Feret (p < 0.05) و ناحیه 2 (p < 0.01) شد. تجزیه و تحلیل مکان‌یاب رویداد میتوکندری افزایش قابل توجهی (p < 0.05) در رویدادهای شکافت و همجوشی نشان داد و در نتیجه یکپارچگی شبکه میتوکندری را در شرایط استرس حفظ کرد. علاوه بر این، بیان mRNA مربوط به cMYC (p < 0.0001)، NRF1 (p < 0.01)، TFAM (p < 0.05)، STOML2 (p < 0.0001) و OPA1 (p < 0.05) به طور قابل توجهی کاهش یافت. 01). این نشان دهنده بازسازی مورفولوژی، بیوژنز و دینامیک میتوکندری برای حفظ عملکرد در شرایط استرس است. داده‌های ما بینش جدیدی در مورد اثرات PPA بر دینامیک میتوکندری ارائه می‌دهند و کاربرد تکنیک‌های تصویربرداری را برای مطالعه مکانیسم‌های تنظیمی پیچیده دخیل در پاسخ‌های استرس میتوکندری برجسته می‌کنند.
میتوکندری‌ها فراتر از نقش‌های معمول خود در تولید انرژی و بیوسنتز، در انواع عملکردهای سلولی مشارکت دارند. متابولیسم میتوکندری تنظیم‌کننده کلیدی سیگنالینگ کلسیم، هموستاز متابولیک و ردوکس، سیگنالینگ التهابی، تغییرات اپی‌ژنتیکی، تکثیر سلولی، تمایز و مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی است.1 به طور خاص، متابولیسم میتوکندری برای رشد، بقا و عملکرد عصبی حیاتی است و به طور گسترده در تظاهرات مختلف نوروپاتولوژی نقش دارد.2،3،4
در طول دهه گذشته، وضعیت متابولیک به عنوان تنظیم‌کننده اصلی نوروژنز، تمایز، بلوغ و انعطاف‌پذیری ظاهر شده است5،6. اخیراً، مورفولوژی و دینامیک میتوکندری به اجزای بسیار مهمی از میتوز تبدیل شده‌اند، فرآیندی پویا که مجموعه‌ای از میتوکندری‌های سالم را در سلول‌ها حفظ می‌کند. دینامیک میتوکندری توسط مسیرهای پیچیده و وابسته به هم از بیوژنز و بیوانرژتیک میتوکندری گرفته تا شکافت، همجوشی، انتقال و پاکسازی میتوکندری تنظیم می‌شود7،8. اختلال در هر یک از این مکانیسم‌های یکپارچه، حفظ شبکه‌های سالم میتوکندری را مختل می‌کند و پیامدهای عملکردی عمیقی برای رشد عصبی دارد9،10. در واقع، اختلال در تنظیم دینامیک میتوکندری در بسیاری از اختلالات روانپزشکی، عصبی-تخریبی و عصبی-رشدی، از جمله اختلالات طیف اوتیسم (ASD)11،12 مشاهده می‌شود11.
ASD یک اختلال عصبی-رشدی ناهمگن با معماری ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی پیچیده است. وراثت‌پذیری ASD مسلم است، اما علت مولکولی زمینه‌ای آن هنوز به خوبی شناخته نشده است. داده‌های جمع‌آوری‌شده از مدل‌های پیش‌بالینی، مطالعات بالینی و مجموعه داده‌های مولکولی چند اُمیکس، شواهد فزاینده‌ای از اختلال عملکرد میتوکندری در ASD13،14 ارائه می‌دهند. ما قبلاً یک غربالگری متیلاسیون DNA در سطح ژنوم را در گروهی از بیماران مبتلا به ASD انجام دادیم و ژن‌های متیله‌شده‌ی متفاوتی را که در امتداد مسیرهای متابولیکی میتوکندریایی خوشه‌بندی شده بودند، شناسایی کردیم15. متعاقباً متیلاسیون متمایز تنظیم‌کننده‌های مرکزی بیوژنز و دینامیک میتوکندری را گزارش کردیم که با افزایش تعداد کپی mtDNA و تغییر پروفایل متابولیک ادراری در ASD16 مرتبط بود. داده‌های ما شواهد فزاینده‌ای را ارائه می‌دهند که دینامیک و هموستاز میتوکندری نقش محوری در پاتوفیزیولوژی ASD ایفا می‌کنند. بنابراین، بهبود درک مکانیسمی از رابطه بین دینامیک، مورفولوژی و عملکرد میتوکندری، هدف اصلی تحقیقات مداوم در مورد بیماری‌های عصبی است که با اختلال عملکرد ثانویه میتوکندری مشخص می‌شوند.
تکنیک‌های مولکولی اغلب برای مطالعه نقش ژن‌های خاص در پاسخ‌های استرس میتوکندریایی استفاده می‌شوند. با این حال، این رویکرد ممکن است به دلیل ماهیت چندوجهی و زمانی مکانیسم‌های کنترل میتوزی محدود شود. علاوه بر این، بیان متفاوت ژن‌های میتوکندریایی یک شاخص غیرمستقیم از تغییرات عملکردی است، به ویژه از آنجایی که معمولاً فقط تعداد محدودی از ژن‌ها مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند. بنابراین، روش‌های مستقیم‌تری برای مطالعه عملکرد و انرژی زیستی میتوکندری پیشنهاد شده است17. مورفولوژی میتوکندری ارتباط نزدیکی با دینامیک میتوکندری دارد. شکل، اتصال و ساختار میتوکندری برای تولید انرژی و بقای میتوکندری و سلول حیاتی است5،18. علاوه بر این، اجزای مختلف میتوز بر تغییرات در مورفولوژی میتوکندریایی تمرکز دارند که ممکن است به عنوان نقاط پایانی مفید اختلال عملکرد میتوکندری عمل کنند و مبنایی برای مطالعات مکانیسمی بعدی فراهم کنند.
مورفولوژی میتوکندری را می‌توان مستقیماً با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) مشاهده کرد و امکان مطالعه دقیق فراساختار سلولی را فراهم نمود. TEM به جای تکیه صرف بر رونویسی ژن، بیان پروتئین یا پارامترهای عملکردی میتوکندری در جمعیت‌های سلولی، مستقیماً مورفولوژی، شکل و ساختار کریستاهای میتوکندری را در وضوح میتوکندری‌های منفرد تجسم می‌کند17،19،20. علاوه بر این، TEM مطالعه تعاملات بین میتوکندری و سایر اندامک‌ها، مانند شبکه آندوپلاسمی و اتوفاگوزوم‌ها را که نقش‌های کلیدی در عملکرد و هموستاز میتوکندری دارند، تسهیل می‌کند21،22. بنابراین، این امر TEM را به نقطه شروع خوبی برای مطالعه اختلال عملکرد میتوکندری قبل از تمرکز بر مسیرها یا ژن‌های خاص تبدیل می‌کند. از آنجایی که عملکرد میتوکندری به طور فزاینده‌ای با نوروپاتولوژی مرتبط می‌شود، نیاز مبرمی به توانایی مطالعه مستقیم و کمی مورفولوژی و دینامیک میتوکندری در مدل‌های عصبی آزمایشگاهی وجود دارد.
در این مقاله، ما دینامیک میتوکندری را در یک مدل عصبی از اختلال عملکرد میتوکندری در اختلال طیف اوتیسم بررسی می‌کنیم. ما قبلاً متیلاسیون افتراقی پروپیونیل-کوآ کربوکسیلاز بتا (PCCB) را در ASD15، زیر واحدی از آنزیم پروپیونیل-کوآ کربوکسیلاز میتوکندریایی PCC گزارش کرده‌ایم. اختلال در تنظیم PCC باعث تجمع سمی مشتقات پروپیونیل، از جمله اسید پروپیونیک (PPA) می‌شود23،24،25. نشان داده شده است که PPA متابولیسم عصبی را مختل می‌کند و رفتار را در داخل بدن تغییر می‌دهد و یک مدل حیوانی تثبیت شده برای مطالعه مکانیسم‌های عصبی-رشدی دخیل در ASD26،27،28 است. علاوه بر این، گزارش شده است که PPA پتانسیل غشای میتوکندری، بیوژنز و تنفس را در شرایط آزمایشگاهی مختل می‌کند و به طور گسترده برای مدل‌سازی اختلال عملکرد میتوکندری در نورون‌ها استفاده شده است29،30. با این حال، تأثیر اختلال عملکرد میتوکندری ناشی از PPA بر مورفولوژی و دینامیک میتوکندری هنوز به خوبی درک نشده است.
این مطالعه از تکنیک‌های تصویربرداری مکمل برای تعیین کمیت اثرات PPA بر مورفولوژی، دینامیک و عملکرد میتوکندری در سلول‌های SH-SY5Y استفاده می‌کند. ابتدا، ما یک روش TEM برای تجسم تغییرات در مورفولوژی و فراساختار میتوکندری توسعه دادیم17،31،32. با توجه به ماهیت پویای میتوکندری33، ما همچنین از آنالیز محلی‌ساز رویداد میتوکندری (MEL) برای تعیین کمیت تغییرات در تعادل بین رویدادهای شکافت و ادغام، تعداد و حجم میتوکندری تحت استرس PPA استفاده کردیم. در نهایت، بررسی کردیم که آیا مورفولوژی و دینامیک میتوکندری با تغییرات در بیان ژن‌های دخیل در بیوژنز، شکافت و ادغام مرتبط است یا خیر. در مجموع، داده‌های ما چالش روشن کردن پیچیدگی مکانیسم‌های تنظیم‌کننده دینامیک میتوکندری را نشان می‌دهند. ما بر کاربرد TEM در مطالعه مورفولوژی میتوکندری به عنوان یک نقطه پایانی همگرا و قابل اندازه‌گیری میتوز در سلول‌های SH-SY5Y تأکید می‌کنیم. علاوه بر این، ما تأکید می‌کنیم که داده‌های TEM در ترکیب با تکنیک‌های تصویربرداری که رویدادهای پویا را نیز در پاسخ به استرس متابولیک ثبت می‌کنند، غنی‌ترین اطلاعات را ارائه می‌دهند. توصیف بیشتر مکانیسم‌های تنظیمی مولکولی که از میتوز سلول‌های عصبی پشتیبانی می‌کنند، می‌تواند بینش مهمی در مورد جزء میتوکندریایی سیستم عصبی و بیماری‌های نورودژنراتیو ارائه دهد.
برای القای استرس میتوکندریایی، سلول‌های SH-SY5Y با PPA با استفاده از 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار پروپیونات سدیم (NaP) تیمار شدند. قبل از TEM، نمونه‌ها تحت آماده‌سازی نمونه کرایوژنیک با استفاده از انجماد و انجماد با فشار بالا قرار گرفتند (شکل 1a). ما یک خط لوله تجزیه و تحلیل تصویر میتوکندری خودکار برای اندازه‌گیری هشت پارامتر مورفولوژیکی جمعیت‌های میتوکندری در سه تکرار بیولوژیکی ایجاد کردیم. ما دریافتیم که تیمار PPA چهار پارامتر را به طور قابل توجهی تغییر داده است: ناحیه 2، مساحت، محیط و قطر فرت (شکل 1b-e). ناحیه 2 با تیمار 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار PPA به طور قابل توجهی کاهش یافت (به ترتیب p = 0.0183 و p = 0.002) (شکل 1b)، در حالی که مساحت (p = 0.003)، محیط (p = 0.0106) و قطر فرت همگی به طور قابل توجهی کاهش یافته‌اند. در گروه تیمار 5 میلی‌مولار در مقایسه با گروه کنترل، کاهش قابل توجهی (p = 0.0172) مشاهده شد (شکل 1c-e). کاهش قابل توجه در مساحت و محیط نشان داد که سلول‌های تیمار شده با 5 میلی‌مولار PPA، میتوکندری‌های کوچک‌تر و گردتری داشتند و این میتوکندری‌ها نسبت به سلول‌های کنترل، کمتر کشیده شده بودند. این موضوع همچنین با کاهش قابل توجه در قطر فرت، یک پارامتر مستقل که نشان دهنده کاهش در بزرگترین فاصله بین لبه‌های ذرات است، سازگار است. تغییرات در فراساختار کریستاها مشاهده شد: کریستاها تحت تأثیر تنش PPA کمتر مشخص شدند (شکل 1a، پنل B). با این حال، همه تصاویر به وضوح فراساختار کریستاها را منعکس نکردند، بنابراین تجزیه و تحلیل کمی از این تغییرات انجام نشد. این داده‌های TEM ممکن است سه سناریوی ممکن را منعکس کنند: (1) PPA شکافت را افزایش می‌دهد یا همجوشی را مهار می‌کند و باعث می‌شود میتوکندری‌های موجود از نظر اندازه کوچک شوند؛ (2) بیوژنز افزایش یافته، میتوکندری‌های جدید و کوچک‌تری ایجاد می‌کند یا (3) هر دو مکانیسم را به طور همزمان القا می‌کند. اگرچه این شرایط را نمی‌توان با TEM تشخیص داد، اما تغییرات مورفولوژیکی قابل توجه نشان دهنده تغییرات در هموستاز و دینامیک میتوکندری تحت تنش PPA است. متعاقباً پارامترهای اضافی را برای توصیف بیشتر این دینامیک‌ها و مکانیسم‌های بالقوه زیربنایی آنها بررسی کردیم.
اسید پروپیونیک (PPA) مورفولوژی میتوکندری را تغییر می‌دهد. (الف) تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نشان می‌دهد که با افزایش تیمار PPA، اندازه میتوکندری کاهش می‌یابد و میتوکندری کوچک‌تر و گردتر می‌شود؛ به ترتیب 0 میلی‌مولار (تیمار نشده)، 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار. فلش‌های قرمز میتوکندری را نشان می‌دهند. (ب-ه) سلول‌های SH-SY5Y تیمار شده با PPA به مدت 24 ساعت برای TEM آماده شدند و نتایج با استفاده از Fiji/ImageJ تجزیه و تحلیل شدند. چهار مورد از هشت پارامتر، تفاوت معنی‌داری بین سلول‌های کنترل (تیمار نشده، 0 میلی‌مولار PPA) و سلول‌های تیمار شده (3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار PPA) نشان دادند. (ب) ناحیه 2، (ج) مساحت، (د) محیط، (ه) قطر فرت. از آنالیز واریانس یک طرفه (کنترل در مقابل تیمار) و آزمون مقایسه چندگانه دانت برای تعیین تفاوت‌های معنی‌دار استفاده شد (p < 0.05). نقاط داده نشان دهنده میانگین مقدار میتوکندری برای هر سلول منفرد هستند و میله‌های خطا نشان دهنده میانگین ± SEM هستند. داده‌های نشان داده شده نشان‌دهنده n = 3، حداقل 24 سلول در هر تکرار است؛ در مجموع 266 تصویر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت؛ * نشان دهنده p < 0.05، ** نشان دهنده p < 0.01 است.
برای توصیف بیشتر چگونگی پاسخ دینامیک میتوکندری به PPA، میتوکندری‌ها را با تترامتیل رودامین اتیل استر (TMRE) رنگ‌آمیزی کردیم و از میکروسکوپ مرور زمان و آنالیز MEL برای مکان‌یابی و تعیین کمیت میتوکندری‌ها پس از 24 ساعت در غلظت‌های 3 و 5 میلی‌مولار PPA استفاده کردیم. بررسی رویدادهای شکافت و همجوشی. (شکل 2a). پس از آنالیز MEL، میتوکندری‌ها برای تعیین کمیت تعداد ساختارهای میتوکندری و حجم متوسط ​​آنها بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ما افزایش کوچک اما قابل توجهی در تعداد رویدادهای شکافت که در غلظت 3 میلی‌مولار [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] در مقایسه با شکافت [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] رخ می‌دهد، مشاهده کردیم و رویدادهای همجوشی [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] و همجوشی [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] < 0.05)] در غلظت 5 میلی‌مولار در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافتند (شکل 3b). تعداد میتوکندری‌ها در هر دو غلظت 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] و 5 میلی‌مولار [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 3c)، در حالی که میانگین حجم هر ساختار میتوکندری بدون تغییر باقی ماند (شکل 3c). 3d). روی هم رفته، این نشان می‌دهد که بازسازی دینامیک میتوکندری به عنوان یک پاسخ جبرانی عمل می‌کند که با موفقیت یکپارچگی شبکه میتوکندری را حفظ می‌کند. افزایش تعداد رویدادهای شکافت در غلظت 3 میلی‌مولار PPA نشان می‌دهد که افزایش تعداد میتوکندری تا حدی به دلیل شکافت میتوکندری است، اما با توجه به اینکه حجم متوسط ​​میتوکندری اساساً بدون تغییر باقی می‌ماند، نمی‌توان بیوژنز را به عنوان یک پاسخ جبرانی اضافی رد کرد. با این حال، این داده‌ها با ساختارهای میتوکندری کوچک‌تر و گرد مشاهده شده توسط TEM سازگار هستند و همچنین تغییرات قابل توجهی را در دینامیک میتوکندری ناشی از PPA نشان می‌دهند.
اسید پروپیونیک (PPA) باعث بازسازی پویای میتوکندری برای حفظ یکپارچگی شبکه می‌شود. سلول‌های SH-SY5Y کشت داده شدند، به مدت 24 ساعت با غلظت‌های 3 و 5 میلی‌مولار PPA تیمار شدند و با TMRE و Hoechst 33342 رنگ‌آمیزی و سپس آنالیز MEL انجام شد. (الف) تصاویر میکروسکوپی مرور زمان نماینده که رنگ و پیش‌بینی‌های حداکثر شدت دوتایی را در زمان 2 (t2) برای هر شرایط نشان می‌دهند. مناطق انتخاب‌شده نشان داده‌شده در هر تصویر دوتایی، بهبود یافته و به صورت سه‌بعدی در سه بازه زمانی مختلف (t1-t3) نمایش داده می‌شوند تا پویایی را در طول زمان نشان دهند. رویدادهای همجوشی با رنگ سبز برجسته شده‌اند؛ رویدادهای شکافت با رنگ سبز برجسته شده‌اند. با رنگ قرمز نمایش داده شده‌اند. (ب) میانگین تعداد رویدادهای پویا در هر شرایط. (ج) میانگین تعداد ساختارهای میتوکندری در هر سلول. (د) میانگین حجم (µm3) هر ساختار میتوکندری در هر سلول. داده‌های نشان داده‌شده نشان‌دهنده n = 15 سلول در هر گروه درمانی هستند. میله‌های خطا نشان داده شده نشان دهنده میانگین ± SEM، نوار مقیاس = 10 میکرومتر، * p < 0.05 هستند.
اسید پروپیونیک (PPA) باعث سرکوب رونویسی ژن‌های مرتبط با دینامیک میتوکندری می‌شود. سلول‌های SH-SY5Y به مدت 24 ساعت با غلظت‌های 3 و 5 میلی‌مولار PPA تیمار شدند. تعیین مقدار نسبی ژن با استفاده از RT-qPCR انجام شد و به B2M نرمال‌سازی شد. ژن‌های بیوژنز میتوکندری (a) cMYC، (b) TFAM، (c) NRF1 و (d) NFE2L2. ژن‌های همجوشی و شکافت میتوکندری (e) STOML2، (f) OPA1، (g) MFN1، (h) MFN2 و (i) DRP1. تفاوت‌های معنی‌دار (p < 0.05) با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (کنترل در مقابل تیمار) و آزمون مقایسه چندگانه دانت آزمایش شدند: * نشان دهنده p < 0.05، ** نشان دهنده p < 0.01 و **** نشان دهنده p < 0.0001 است. میله‌ها نشان دهنده میانگین بیان ± SEM هستند. داده‌های نشان داده شده نشان‌دهنده n = 3 (STOML2، OPA1، TFAM)، n = 4 (cMYC، NRF1، NFE2L2) و n = 5 (MFN1، MFN2، DRP1) تکرارهای بیولوژیکی هستند.
داده‌های حاصل از آنالیزهای TEM و MEL با هم نشان می‌دهند که PPA مورفولوژی و دینامیک میتوکندری را تغییر می‌دهد. با این حال، این تکنیک‌های تصویربرداری بینشی در مورد مکانیسم‌های اساسی هدایت این فرآیندها ارائه نمی‌دهند. بنابراین، ما بیان mRNA مربوط به نه تنظیم‌کننده کلیدی دینامیک، بیوژنز و میتوز میتوکندری را در پاسخ به درمان PPA بررسی کردیم. ما آنکوژن میلوما سلولی (cMYC)، فاکتور تنفسی هسته‌ای (NRF1)، فاکتور رونویسی میتوکندریایی 1 (TFAM)، فاکتور رونویسی شبه NFE2 BZIP (NFE2L2)، پروتئین شبه گاسترین 2 (STOML2)، آتروفی عصب بینایی 1 (OPA1)، میتوفوزین 1 (MFN1)، میتوفوزین 2 (MFN2) و پروتئین مرتبط با دینامین 1 (DRP1) را پس از 24 ساعت درمان با 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار PPA اندازه‌گیری کردیم. ما تیمار PPA با غلظت‌های 3 میلی‌مولار (به ترتیب p = 0.0053، p = 0.0415 و p < 0.0001) و 5 میلی‌مولار (p = 0.0031، p = 0.0233، p < 0.0001) را مشاهده کردیم. (شکل 3a-c). کاهش بیان mRNA وابسته به دوز بود: بیان cMYC، NRF1 و TFAM در غلظت 3 میلی‌مولار به ترتیب 5.7، 2.6 و 1.9 برابر و در غلظت 5 میلی‌مولار 11.2، 3 و 2.2 برابر کاهش یافت. در مقابل، ژن مرکزی بیوژنز ردوکس NFE2L2 در هیچ غلظتی از PPA تغییر نکرد، اگرچه روند وابسته به دوز مشابهی از کاهش بیان مشاهده شد (شکل 3d).
ما همچنین بیان ژن‌های کلاسیک دخیل در تنظیم شکافت و همجوشی را بررسی کردیم. تصور می‌شود STOML2 در همجوشی، میتوفاژی و بیوژنز نقش دارد و بیان آن به طور قابل توجهی (p < 0.0001) توسط 3 میلی‌مولار (تغییر 2.4 برابری) و 5 میلی‌مولار (تغییر 2.8 برابری) PPA کاهش یافت (شکل 1). 3d). به طور مشابه، بیان ژن همجوشی OPA1 در 3 میلی‌مولار (تغییر 1.6 برابری) و 5 میلی‌مولار (تغییر 1.9 برابری) PPA کاهش یافت (به ترتیب p = 0.006 و p = 0.0024) (شکل 3f). با این حال، ما تفاوت‌های قابل توجهی در بیان ژن‌های همجوشی MFN1، MFN2 یا ژن شکافت DRP1 تحت استرس 24 ساعته PPA پیدا نکردیم (شکل 3g-i). علاوه بر این، ما دریافتیم که سطح چهار پروتئین همجوشی و شکافت (OPA1، MFN1، MFN2 و DRP1) تحت شرایط یکسان تغییر نکرد (شکل 4a-d). توجه به این نکته مهم است که این داده‌ها یک نقطه زمانی واحد را منعکس می‌کنند و ممکن است تغییرات در بیان پروتئین یا سطح فعالیت را در مراحل اولیه استرس PPA منعکس نکنند. با این حال، کاهش قابل توجه در بیان cMYC، NRF1، TFAM، STOML2 و OPA1 نشان دهنده اختلال قابل توجه رونویسی در متابولیسم، بیوژنز و دینامیک میتوکندری است. علاوه بر این، این داده‌ها کاربرد تکنیک‌های تصویربرداری را برای مطالعه مستقیم تغییرات حالت نهایی در عملکرد میتوکندری برجسته می‌کنند.
سطح پروتئین فاکتور فیوژن و شکافت پس از تیمار با اسید پروپیونیک (PPA) تغییر نکرد. سلول‌های SH-SY5Y به مدت 24 ساعت با غلظت‌های 3 و 5 میلی‌مولار PPA تیمار شدند. سطح پروتئین با استفاده از آنالیز وسترن بلات تعیین شد و سطح بیان نسبت به پروتئین کل نرمال‌سازی شد. میانگین بیان پروتئین و وسترن بلات‌های نماینده پروتئین هدف و کل نشان داده شده است. a – OPA1، b – MFN1، c – MFN2، d – DRP1. میله‌ها نشان دهنده میانگین ± SEM هستند و داده‌های نشان داده شده نشان دهنده n = 3 تکرار بیولوژیکی هستند. مقایسه‌های چندگانه (p < 0.05) با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون دانت انجام شد. ژل و بلات اصلی در شکل S1 نشان داده شده است.
اختلال عملکرد میتوکندری با بیماری‌های چند سیستمی از بیماری‌های متابولیک، قلبی عروقی و عضلانی گرفته تا بیماری‌های عصبی مرتبط است1،10. بسیاری از بیماری‌های نورودژنراتیو و نورودژنراتیو با اختلال عملکرد میتوکندری مرتبط هستند که اهمیت این اندامک‌ها را در طول عمر مغز برجسته می‌کند. این بیماری‌ها شامل بیماری پارکینسون، بیماری آلزایمر و ASD3،4،18 هستند. با این حال، دسترسی به بافت مغز برای مطالعه این بیماری‌ها دشوار است، به خصوص در سطح مکانیسمی، و سیستم‌های مدل سلولی را به یک جایگزین ضروری تبدیل می‌کند. در این مطالعه، ما از یک سیستم مدل سلولی با استفاده از سلول‌های SH-SY5Y تیمار شده با PPA برای تکرار اختلال عملکرد میتوکندری مشاهده شده در بیماری‌های عصبی، به ویژه اختلالات طیف اوتیسم، استفاده می‌کنیم. استفاده از این مدل PPA برای مطالعه دینامیک میتوکندری در نورون‌ها ممکن است بینشی در مورد علت ASD ارائه دهد.
ما امکان استفاده از TEM برای مشاهده تغییرات در مورفولوژی میتوکندری را بررسی کردیم. توجه به این نکته مهم است که برای به حداکثر رساندن اثربخشی آن، باید از TEM به درستی استفاده شود. آماده‌سازی نمونه‌های کرایو، با تثبیت همزمان اجزای سلولی و کاهش تشکیل آرتیفکت‌ها، امکان حفظ بهتر ساختارهای عصبی را فراهم می‌کند34. مطابق با این، مشاهده کردیم که سلول‌های SH-SY5Y شبه نورونی، اندامک‌های زیرسلولی سالم و میتوکندری‌های کشیده‌ای دارند (شکل 1a). این امر، کاربرد تکنیک‌های آماده‌سازی کرایوژنیک را برای مطالعه مورفولوژی میتوکندری در مدل‌های سلول عصبی برجسته می‌کند. اگرچه اندازه‌گیری‌های کمی برای تجزیه و تحلیل عینی داده‌های TEM بسیار مهم هستند، اما هنوز هیچ اجماعی در مورد اینکه چه پارامترهای خاصی باید برای تأیید تغییرات مورفولوژیکی میتوکندری اندازه‌گیری شوند، وجود ندارد. بر اساس تعداد زیادی از مطالعاتی که مورفولوژی میتوکندری را به صورت کمی بررسی کرده‌اند17،31،32، ما یک خط لوله تجزیه و تحلیل تصویر میتوکندری خودکار ایجاد کردیم که هشت پارامتر مورفولوژیکی را اندازه‌گیری می‌کند، یعنی: مساحت، مساحت 2، نسبت ابعاد، محیط، دایره‌ای بودن، درجه، قطر فرت و گردی.
در میان آنها، PPA به طور قابل توجهی مساحت 2، مساحت، محیط و قطر Feret را کاهش داد (شکل 1b-e). این نشان داد که میتوکندری‌ها کوچکتر و گردتر شده‌اند، که با مطالعات قبلی که کاهش مساحت میتوکندری را پس از 72 ساعت استرس میتوکندریایی ناشی از PPA30 نشان می‌دهند، سازگار است. این ویژگی‌های مورفولوژیکی ممکن است نشان‌دهنده شکافت میتوکندریایی باشد، یک فرآیند ضروری برای جداسازی اجزای آسیب‌دیده از شبکه میتوکندریایی برای افزایش تخریب آنها از طریق میتوفاژی35،36،37. از سوی دیگر، کاهش اندازه متوسط ​​میتوکندری ممکن است با افزایش بیوژنز مرتبط باشد که منجر به تشکیل میتوکندری‌های کوچک نوپا می‌شود. افزایش شکافت یا بیوژنز نشان دهنده یک پاسخ جبرانی برای حفظ میتوز در برابر استرس میتوکندریایی است. با این حال، کاهش رشد میتوکندری، اختلال در همجوشی یا سایر شرایط را نمی‌توان رد کرد.
اگرچه تصاویر با وضوح بالای ایجاد شده توسط TEM امکان تعیین ویژگی‌های مورفولوژیکی را در سطح میتوکندری‌های منفرد فراهم می‌کند، اما این روش تصاویر دو بعدی را در یک نقطه از زمان تولید می‌کند. برای مطالعه پاسخ‌های دینامیکی به استرس متابولیک، میتوکندری‌ها را با TMRE رنگ‌آمیزی کردیم و از میکروسکوپ مرور زمان با آنالیز MEL استفاده کردیم که امکان تجسم سه‌بعدی با توان عملیاتی بالا از تغییرات در شبکه میتوکندری را در طول زمان فراهم می‌کند33،38. ما تغییرات ظریف اما قابل توجهی را در دینامیک میتوکندری تحت استرس PPA مشاهده کردیم (شکل 2). در 3 میلی‌مولار، تعداد رویدادهای شکافت به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که رویدادهای همجوشی مانند گروه کنترل باقی ماند. افزایش تعداد رویدادهای شکافت و همجوشی در 5 میلی‌مولار PPA مشاهده شد، اما این تغییرات تقریباً متناسب بودند، که نشان می‌دهد سینتیک شکافت و همجوشی در غلظت‌های بالاتر به تعادل می‌رسند (شکل 2b). میانگین حجم میتوکندری در هر دو غلظت 3 و 5 میلی‌مولار PPA بدون تغییر باقی ماند، که نشان می‌دهد یکپارچگی شبکه میتوکندری حفظ شده است (شکل 2d). این نشان دهنده توانایی شبکه‌های میتوکندری پویا در پاسخ به استرس متابولیک خفیف برای حفظ مؤثر هموستاز بدون ایجاد قطعه قطعه شدن شبکه است. در غلظت 3 میلی‌مولار PPA، افزایش شکافت برای پیشبرد انتقال به یک تعادل جدید کافی است، اما در پاسخ به استرس ناشی از غلظت‌های بالاتر PPA، بازسازی سینتیکی عمیق‌تری مورد نیاز است.
تعداد میتوکندری‌ها در هر دو غلظت استرس PPA افزایش یافت، اما میانگین حجم میتوکندری به طور قابل توجهی تغییر نکرد (شکل 2c). این ممکن است به دلیل افزایش بیوژنز یا افزایش تقسیم باشد. با این حال، در غیاب کاهش قابل توجه در میانگین حجم میتوکندری، احتمال بیشتری وجود دارد که بیوسنتز افزایش یابد. با این حال، داده‌های شکل 2 از وجود دو مکانیسم جبرانی پشتیبانی می‌کنند: افزایش تعداد رویدادهای شکافت، مطابق با تنظیم افزایشی شکافت میتوکندری، و افزایش تعداد رویدادها، مطابق با بیوژنز میتوکندری. در نهایت، جبران پویا برای استرس خفیف ممکن است شامل فرآیندهای همزمان شامل شکافت، همجوشی، بیوژنز و میتوفاژی باشد. اگرچه نویسندگان قبلی نشان داده‌اند که PPA میتوز30،39 و میتوفاژی29 را افزایش می‌دهد، ما شواهدی برای بازسازی دینامیک شکافت و همجوشی میتوکندری در پاسخ به PPA ارائه می‌دهیم. این داده‌ها تغییرات مورفولوژیکی مشاهده شده توسط TEM را تأیید می‌کنند و بینش بیشتری در مورد مکانیسم‌های مرتبط با اختلال عملکرد میتوکندری ناشی از PPA ارائه می‌دهند.
از آنجایی که نه آنالیز TEM و نه آنالیز MEL شواهد مستقیمی از مکانیسم‌های تنظیم ژن که زیربنای تغییرات مورفولوژیکی مشاهده شده هستند، ارائه نکردند، ما بیان RNA ژن‌های دخیل در متابولیسم، بیوژنز و دینامیک میتوکندری را بررسی کردیم. پروتوانکوژن cMYC یک فاکتور رونویسی است که در تنظیم میتوکندری، گلیکولیز، متابولیسم اسید آمینه و اسید چرب40 نقش دارد. علاوه بر این، cMYC به عنوان تنظیم کننده بیان نزدیک به 600 ژن میتوکندریایی دخیل در رونویسی، ترجمه و مونتاژ پیچیده میتوکندری، از جمله NRF1 و TFAM41، شناخته شده است. NRF1 و TFAM دو تنظیم کننده مرکزی میتوز هستند که در پایین دست PGC-1α برای فعال کردن تکثیر mtDNA عمل می‌کنند. این مسیر توسط سیگنالینگ cAMP و AMPK فعال می‌شود و به مصرف انرژی و استرس متابولیک حساس است. ما همچنین NFE2L2، یک تنظیم کننده ردوکس بیوژنز میتوکندری را بررسی کردیم تا مشخص کنیم که آیا اثرات PPA ممکن است توسط استرس اکسیداتیو واسطه‌گری شود یا خیر.
اگرچه بیان NFE2L2 بدون تغییر باقی ماند، ما کاهش وابسته به دوز ثابتی را در بیان cMYC، NRF1 و TFAM پس از 24 ساعت تیمار با 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار PPA مشاهده کردیم (شکل 3a-c). کاهش بیان cMYC قبلاً به عنوان پاسخی به استرس میتوکندری گزارش شده است42 و برعکس، کاهش بیان cMYC می‌تواند با تغییر متابولیسم میتوکندری، اتصال شبکه و قطبش غشا باعث اختلال در عملکرد میتوکندری شود43. جالب توجه است که cMYC همچنین در تنظیم شکافت و همجوشی میتوکندری نقش دارد42،43 و مشخص شده است که فسفوریلاسیون DRP1 و محلی‌سازی میتوکندری را در طول تقسیم سلولی افزایش می‌دهد44، و همچنین واسطه تغییر شکل مورفولوژیکی میتوکندری در سلول‌های بنیادی عصبی45 است. در واقع، فیبروبلاست‌های دارای کمبود cMYC، اندازه میتوکندری کاهش‌یافته‌ای را نشان می‌دهند که با تغییرات ناشی از استرس PPA43 سازگار است. این داده‌ها یک رابطه جالب اما هنوز نامشخص بین cMYC و دینامیک میتوکندری را نشان می‌دهند و هدف جالبی را برای مطالعات آینده در مورد بازسازی ناشی از استرس PPA فراهم می‌کنند.
کاهش NRF1 و TFAM با نقش cMYC به عنوان یک فعال‌کننده رونویسی مهم سازگار است. این داده‌ها همچنین با مطالعات قبلی در سلول‌های سرطانی روده بزرگ انسان مطابقت دارد که نشان می‌دهد PPA بیان mRNAی NRF1 را در 22 ساعت کاهش داده است، که با کاهش ATP و افزایش ROS46 همراه بوده است. این نویسندگان همچنین گزارش دادند که بیان TFAM در 8.5 ساعت افزایش یافته اما در 22 ساعت به سطوح پایه بازگشته است. در مقابل، کیم و همکاران (2019) نشان دادند که بیان mRNAی TFAM پس از 4 ساعت استرس PPA در سلول‌های SH-SY5Y به طور قابل توجهی کاهش یافته است. با این حال، پس از 72 ساعت، بیان پروتئین TFAM به طور قابل توجهی افزایش یافته و تعداد کپی mtDNA به طور قابل توجهی افزایش یافته است. بنابراین، کاهش تعداد ژن‌های بیوژنز میتوکندری که پس از 24 ساعت مشاهده کردیم، این احتمال را که افزایش تعداد میتوکندری‌ها با فعال شدن بیوژنز در نقاط زمانی قبلی مرتبط باشد، رد نمی‌کند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که PPA به طور قابل توجهی mRNA و پروتئین PGC-1α را در سلول‌های SH-SY5Y در 4 ساعت و 30 دقیقه افزایش می‌دهد، در حالی که اسید پروپیونیک بیوژنز میتوکندری را در هپاتوسیت‌های گوساله از طریق PGC-1α در 12 ساعت و 39 دقیقه افزایش می‌دهد. جالب توجه است که PGC-1α نه تنها یک تنظیم‌کننده رونویسی مستقیم NRF1 و TFAM است، بلکه نشان داده شده است که فعالیت MFN2 و DRP1 را نیز با تنظیم شکافت و همجوشی تنظیم می‌کند47. در مجموع، این امر اتصال نزدیک مکانیسم‌های تنظیم‌کننده پاسخ‌های جبرانی میتوکندری ناشی از PPA را برجسته می‌کند. علاوه بر این، داده‌های ما نشان‌دهنده اختلال قابل توجه در تنظیم رونویسی بیوژنز و متابولیسم تحت استرس PPA است.
ژن‌های STOML2، OPA1، MFN1، MFN2 و DRP1 از جمله تنظیم‌کننده‌های اصلی تقسیم، ادغام و دینامیک میتوکندری هستند37،48،49. ژن‌های بسیار دیگری نیز در دینامیک میتوکندری دخیل هستند، با این حال، قبلاً مشخص شده است که STOML2، OPA1 و MFN2 در گروه‌های ASD به طور متفاوتی متیله می‌شوند16 و چندین مطالعه مستقل، تغییراتی را در این فاکتورهای رونویسی در پاسخ به استرس میتوکندری گزارش کرده‌اند50،51.52. بیان هر دو OPA1 و STOML2 به طور قابل توجهی با تیمار 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار PPA کاهش یافت (شکل 3e، f). OPA1 یکی از تنظیم‌کننده‌های کلاسیک ادغام میتوکندری از طریق تعامل مستقیم با MFN1 و 2 است و در بازسازی کریستا و مورفولوژی میتوکندری نقش دارد53. نقش دقیق STOML2 در دینامیک میتوکندری هنوز مشخص نیست، اما شواهد نشان می‌دهد که در ادغام، بیوژنز و میتوفاژی میتوکندری نقش دارد.
STOML2 در حفظ اتصال تنفسی میتوکندری و تشکیل کمپلکس‌های زنجیره تنفسی نقش دارد54،55 و نشان داده شده است که ویژگی‌های متابولیک سلول‌های سرطانی را به شدت تغییر می‌دهد56. مطالعات نشان داده‌اند که STOML2 از طریق تعامل با BAN و کاردیولیپین، پتانسیل غشای میتوکندری و بیوژنز را ارتقا می‌دهد55، 57، 58. علاوه بر این، مطالعات مستقل نشان داده‌اند که تعامل بین STOML2 و PINK1، میتوفاژی را تنظیم می‌کند59،60. نکته قابل توجه این است که گزارش شده است STOML2 مستقیماً با MFN2 تعامل دارد و آن را تثبیت می‌کند و همچنین با مهار پروتئاز مسئول تخریب OPA1، نقش مهمی در تثبیت ایزوفرم‌های طولانی OPA1 ایفا می‌کند53،61،62. کاهش بیان STOML2 مشاهده شده در واکنش‌های PPA ممکن است این پروتئین‌های فیوژن را نسبت به تخریب از طریق مسیرهای وابسته به یوبیکوئیتین و پروتئازوم حساس‌تر کند48. اگرچه نقش دقیق STOML2 و OPA1 در پاسخ دینامیکی به PPA مشخص نیست، کاهش بیان این ژن‌های همجوشی (شکل 3) ممکن است تعادل بین شکافت و همجوشی را مختل کرده و منجر به کاهش اندازه میتوکندری شود (شکل 3).
از سوی دیگر، بیان پروتئین OPA1 پس از 24 ساعت بدون تغییر باقی ماند، در حالی که سطح mRNA و پروتئین MFN1، MFN2 یا DRP1 پس از تیمار با PPA تغییر قابل توجهی نکرد (شکل 3g-i، شکل 4). این ممکن است نشان دهد که هیچ تغییری در تنظیم این عوامل دخیل در ادغام و تقسیم میتوکندری وجود ندارد. با این حال، شایان ذکر است که هر یک از این چهار ژن توسط تغییرات پس از رونویسی (PTMs) که فعالیت پروتئین را کنترل می‌کنند نیز تنظیم می‌شوند. OPA1 دارای هشت نوع پیرایش جایگزین است که به صورت پروتئولیتیک در میتوکندری برش داده می‌شوند تا دو ایزوفرم مجزا تولید کنند63. تعادل بین ایزوفرم‌های بلند و کوتاه در نهایت نقش OPA1 را در ادغام میتوکندری و حفظ شبکه میتوکندری تعیین می‌کند64. فعالیت DRP1 توسط فسفوریلاسیون پروتئین کیناز II وابسته به کلسیم/کالمودولین (CaMKII) تنظیم می‌شود، در حالی که تخریب DRP1 توسط یوبیکوئیتیناسیون و SUMOylation65 تنظیم می‌شود. در نهایت، هم DRP1 و هم MFN1/2 GTPase هستند، بنابراین فعالیت آنها ممکن است تحت تأثیر میزان تولید GTP در میتوکندری قرار گیرد66. بنابراین، اگرچه بیان این پروتئین‌ها ثابت می‌ماند، اما این ممکن است نشان‌دهنده فعالیت یا محلی‌سازی بدون تغییر پروتئین نباشد67،68. در واقع، ذخایر پروتئینی PTM موجود اغلب به عنوان اولین خط دفاعی مسئول واسطه‌گری پاسخ‌های استرس حاد عمل می‌کنند. در حضور استرس متابولیک متوسط ​​در مدل ما، احتمالاً PTM فعالیت پروتئین‌های همجوشی و شکافت را افزایش می‌دهد تا یکپارچگی میتوکندری را به اندازه کافی بازیابی کند، بدون اینکه نیاز به فعال‌سازی اضافی این ژن‌ها در سطح mRNA یا پروتئین باشد.
روی هم رفته، داده‌های فوق، تنظیم پیچیده و وابسته به زمان مورفولوژی میتوکندری و چالش‌های روشن کردن این مکانیسم‌ها را برجسته می‌کنند. برای مطالعه بیان ژن، ابتدا لازم است ژن‌های هدف خاص در مسیر شناسایی شوند. با این حال، داده‌های ما نشان می‌دهد که ژن‌ها در یک مسیر به یک روش به استرس یکسان پاسخ نمی‌دهند. در واقع، مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ژن‌های مختلف در یک مسیر ممکن است پروفایل‌های پاسخ زمانی متفاوتی را نشان دهند30،46. علاوه بر این، مکانیسم‌های پیچیده پس از رونویسی وجود دارند که رابطه بین رونویسی و عملکرد ژن را مختل می‌کنند. مطالعات پروتئومیک می‌توانند بینشی در مورد تأثیر PTMها و عملکرد پروتئین ارائه دهند، اما چالش‌هایی از جمله روش‌های با توان عملیاتی پایین، نسبت سیگنال به نویز بالا و وضوح ضعیف را نیز ایجاد می‌کنند.
در این زمینه، مطالعه مورفولوژی میتوکندری با استفاده از TEM و MEL پتانسیل بالایی برای پرداختن به سوالات اساسی در مورد رابطه بین دینامیک و عملکرد میتوکندری و چگونگی تأثیر آن بر بیماری دارد. مهمتر از همه، TEM روشی مستقیم برای اندازه‌گیری مورفولوژی میتوکندری به عنوان نقطه پایانی همگرا از اختلال عملکرد و دینامیک میتوکندری ارائه می‌دهد51. MEL همچنین روشی مستقیم برای تجسم وقایع شکافت و همجوشی در یک محیط سلولی سه‌بعدی ارائه می‌دهد و امکان کمی‌سازی بازسازی دینامیک میتوکندری را حتی در غیاب تغییرات در بیان ژن فراهم می‌کند33. در اینجا ما کاربرد تکنیک‌های تصویربرداری میتوکندری را در بیماری‌های ثانویه میتوکندری برجسته می‌کنیم. این بیماری‌ها معمولاً با استرس متابولیک خفیف مزمن مشخص می‌شوند که با بازسازی ظریف شبکه‌های میتوکندری مشخص می‌شود تا آسیب حاد میتوکندری. با این حال، جبران میتوکندری مورد نیاز برای حفظ میتوز تحت استرس مزمن، پیامدهای عملکردی عمیقی دارد. در زمینه علوم اعصاب، درک بهتر این مکانیسم‌های جبرانی ممکن است اطلاعات مهمی در مورد نوروپاتولوژی پلیوتروپیک مرتبط با اختلال عملکرد میتوکندری ارائه دهد.
در نهایت، داده‌های ما کاربرد تکنیک‌های تصویربرداری را برای درک پیامدهای عملکردی تعاملات پیچیده بین بیان ژن، تغییرات پروتئین و فعالیت پروتئین که دینامیک میتوکندری عصبی را کنترل می‌کنند، برجسته می‌کند. ما از PPA برای مدل‌سازی اختلال عملکرد میتوکندری در یک مدل سلول عصبی استفاده کردیم تا بینشی نسبت به مؤلفه میتوکندریایی ASD به دست آوریم. سلول‌های SH-SY5Y تحت درمان با PPA تغییراتی در مورفولوژی میتوکندری نشان دادند: میتوکندری کوچک و گرد شد و کریستاها هنگام مشاهده توسط TEM به خوبی تعریف نشدند. تجزیه و تحلیل MEL نشان می‌دهد که این تغییرات همزمان با افزایش رویدادهای شکافت و همجوشی برای حفظ شبکه میتوکندری در پاسخ به استرس متابولیک خفیف رخ می‌دهد. علاوه بر این، PPA به طور قابل توجهی تنظیم رونویسی متابولیسم و ​​​​هموستاز میتوکندری را مختل می‌کند. ما cMYC، NRF1، TFAM، STOML2 و OPA1 را به عنوان تنظیم‌کننده‌های کلیدی میتوکندری که توسط استرس PPA مختل می‌شوند، شناسایی کردیم و ممکن است در واسطه‌گری تغییرات ناشی از PPA در مورفولوژی و عملکرد میتوکندری نقش داشته باشند. مطالعات آینده برای توصیف بهتر تغییرات زمانی ناشی از PPA در بیان ژن و فعالیت پروتئین، محلی‌سازی و اصلاحات پس از ترجمه مورد نیاز است. داده‌های ما پیچیدگی و وابستگی متقابل مکانیسم‌های تنظیمی واسطه پاسخ استرس میتوکندری را برجسته می‌کند و کاربرد TEM و سایر تکنیک‌های تصویربرداری را برای مطالعات مکانیسمی هدفمندتر نشان می‌دهد.
رده سلولی SH-SY5Y (ECACC، 94030304-1VL) از سیگما-آلدریچ خریداری شد. سلول‌های SH-SY5Y در محیط کشت اصلاح‌شده‌ی ایگل/مخلوط مواد مغذی F-12 دولبکو (DMEM/F-12) و ال-گلوتامین (SC09411، ScienCell) در فلاسک‌های 25 سانتی‌متر مربعی حاوی 20٪ سرم جنین گاوی (FBS) (10493106، ThermoFisher Scientific) و 1٪ پنی‌سیلین-استرپتومایسین (P4333-20ML، سیگما-آلدریچ) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5٪ CO2 کشت داده شدند. سلول‌ها با استفاده از تریپسین-EDTA با غلظت 0.05% (15400054، ThermoFisher Scientific) تا تراکم 80% کشت داده شدند، با سرعت 300 گرم سانتریفیوژ شدند و با تراکم تقریبی 7 × 105 سلول در میلی‌لیتر کشت داده شدند. تمام آزمایش‌ها بر روی سلول‌های SH-SY5Y تمایز نیافته بین پاساژهای 19 تا 22 انجام شد. PPA به صورت NaP تجویز می‌شود. پودر NaP (شماره CAS: 137-40-6، فرمول شیمیایی C3H5NaO2، P5436-100G، Sigma-Aldrich) را در آب گرم MilliQ تا غلظت 1 مولار حل کنید و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کنید. در روز درمان، این محلول را با PPA با غلظت 1 مولار تا 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار در محیط کشت بدون سرم (DMEM/F-12 با L-گلوتامین) رقیق کنید. غلظت‌های تیمار برای همه آزمایش‌ها شامل بدون PPA (0 میلی‌مولار، شاهد)، 3 میلی‌مولار و 5 میلی‌مولار PPA بود. آزمایش‌ها حداقل در سه تکرار بیولوژیکی انجام شد.
سلول‌های SH-SY5Y با سرعت 5.5 × 105 سلول در میلی‌لیتر در فلاسک‌های 25 سانتی‌متری کشت داده شدند و به مدت 24 ساعت رشد داده شدند. قبل از 24 ساعت انکوباسیون، تیمار PPA به فلاسک اضافه شد. پلت‌های سلولی را طبق پروتکل‌های کشت فرعی بافت پستانداران طبیعی (که در بالا توضیح داده شد) جمع‌آوری کنید. پلت سلولی را در 100 میکرولیتر 2.5٪ گلوتارآلدئید، 1 × PBS دوباره به حالت تعلیق درآورید و تا زمان پردازش در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کنید. سلول‌های SH-SY5Y به طور خلاصه سانتریفیوژ شدند تا سلول‌ها به حالت رسوب درآیند و محلول 2.5٪ گلوتارآلدئید، 1 × PBS از آنها جدا شود. رسوب را در ژل آگارز 4٪ تهیه شده در آب مقطر دوباره به حالت تعلیق درآورید (نسبت حجم آگارز به رسوب 1:1 است). قطعات آگارز روی صفحات مسطح روی شبکه‌ها قرار داده شدند و قبل از انجماد با فشار بالا با 1-هگزادسن پوشانده شدند. نمونه‌ها به مدت ۲۴ ساعت در استون ۱۰۰٪ خشک در دمای ۹۰- درجه سانتیگراد منجمد شدند. سپس دما تا ۸۰- درجه سانتیگراد افزایش داده شد و محلول ۱٪ تتراکسید اسمیوم و ۰.۱٪ گلوتارآلدئید اضافه شد. نمونه‌ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از این، دما به تدریج طی چند روز به دمای اتاق افزایش یافت: از ۸۰- درجه سانتیگراد به ۵۰- درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت، به ۳۰- درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت، به ۱۰- درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت و در نهایت به دمای اتاق.
پس از آماده‌سازی در شرایط برودتی، نمونه‌ها با رزین آغشته شدند و برش‌های بسیار نازک (حدود ۱۰۰ نانومتر) با استفاده از اولترا میکروتوم Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) تهیه شدند. برش‌ها با ۲٪ اورانیل استات و سیترات سرب رنگ‌آمیزی شدند. نمونه‌ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (که قبلاً FEI نام داشت)، آیندهوون، هلند) که با ولتاژ ۲۰۰ کیلوولت (فرستنده Lab6) کار می‌کند و یک دوربین Gatan CCD (Gatan، انگلستان) مجهز به فیلتر انرژی Tridiem مشاهده شدند.
در هر تکرار فنی، حداقل 24 تصویر تک سلولی، در مجموع 266 تصویر، به دست آمد. همه تصاویر با استفاده از ماکروی ناحیه مورد نظر (ROI) و ماکروی میتوکندری مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ماکروی میتوکندری بر اساس روش‌های منتشر شده17،31،32 است و امکان پردازش دسته‌ای نیمه خودکار تصاویر TEM در Fiji/ImageJ69 را فراهم می‌کند. به طور خلاصه: تصویر با استفاده از تفریق پس‌زمینه توپ چرخان (شعاع 60 پیکسل) و یک فیلتر میان‌گذر FFT (به ترتیب با استفاده از مرزهای بالا و پایین 60 و 8 پیکسل) و حذف خط عمودی با تلورانس جهت‌گیری 5٪، معکوس و وارونه می‌شود. تصویر پردازش شده به طور خودکار با استفاده از الگوریتم حداکثر آنتروپی آستانه‌گذاری می‌شود و یک ماسک دودویی تولید می‌شود. نواحی تصویر مرتبط با ROI های انتخاب شده دستی در تصاویر خام TEM استخراج شدند که میتوکندری را مشخص کرده و غشای پلاسما و سایر نواحی با کنتراست بالا را حذف می‌کنند. برای هر ROI استخراج‌شده، ذرات دوتایی بزرگتر از ۶۰۰ پیکسل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و مساحت ذرات، محیط، محورهای اصلی و فرعی، قطر Feret، گردی و دایره‌ای بودن با استفاده از توابع اندازه‌گیری داخلی Fiji/ImageJ اندازه‌گیری شدند. به پیروی از Merrill، Flippo و Strack (2017)، مساحت ۲، نسبت ابعاد ذرات (نسبت محور اصلی به فرعی) و ضریب شکل (FF) از این داده‌ها محاسبه شدند، که در آن FF = محیط ۲/۴pi x مساحت. تعریف فرمول پارامتری را می‌توان در Merrill، Flippo و Strack (2017) یافت. ماکروهای ذکر شده در GitHub موجود است (به بیانیه دسترسی به داده‌ها مراجعه کنید). به طور متوسط، تقریباً ۵۶۰۰ ذره در هر تیمار PPA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند، که در مجموع تقریباً ۱۷۰۰۰ ذره می‌شود (داده‌ها نشان داده نشده‌اند).
سلول‌های SH-SH5Y در ظروف کشت ۸ محفظه‌ای (ThermoFisher، شماره ۱۵۵۴۱۱) قرار داده شدند تا چسبندگی یک شبه ایجاد شود و سپس با رنگ‌آمیزی TMRE 1:1000 (ThermoFisher، شماره T669) و Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich، H6024) انکوبه شدند. رنگ‌آمیزی. تصاویر با استفاده از لیزرهای ۴۰۵ نانومتر و ۵۶۱ نانومتر در یک محیط ۱۰ دقیقه‌ای گرفته شدند و تصاویر خام به صورت z-stacks حاوی ۱۰ میکروگراف تصویری با گام az 0.2 میکرومتر بین فریم‌های تصویر در ۱۲ نقطه زمانی متوالی به دست آمدند. تصاویر با استفاده از یک پلتفرم فوق تفکیک‌پذیری Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss، Oberkochen، آلمان) با استفاده از یک لنز LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 جمع‌آوری شدند. تصاویر در ImageJ با استفاده از یک خط لوله که قبلاً توضیح داده شده و افزونه ImageJ برای اندازه‌گیری رویدادهای همجوشی و شکافت، میانگین تعداد ساختارهای میتوکندریایی و میانگین حجم میتوکندری در هر سلول33 تجزیه و تحلیل شدند. ماکروهای MEL در GitHub موجود هستند (به بیانیه دسترسی به داده‌ها مراجعه کنید).
سلول‌های SH-SY5Y به مدت 24 ساعت قبل از درمان در پلیت‌های شش چاهکی با تراکم 0.3 × 106 سلول در میلی‌لیتر کشت داده شدند. RNA با استفاده از پروتکل Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055، Zymo Research) با تغییرات جزئی استخراج شد: قبل از برداشتن هر چاهک، 300 میکرولیتر بافر لیز RNA به هر چاهک اضافه کنید و هر نمونه را به عنوان مرحله نهایی با 30 میکرولیتر آب بدون DNase/RNase elution لیز کنید. همه نمونه‌ها از نظر کمیت و کیفیت با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-Vis مدل NanoDrop ND-1000 بررسی شدند. پروتئین کل حاصل از لیزات سلولی با استفاده از 200 میکرولیتر بافر لیز RIPA به دست آمد و غلظت پروتئین با استفاده از روش سنجش پروتئین برادفورد 70 تعیین شد.
سنتز cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA Tetro™ (BIO-65043، Meridian Bioscience) طبق دستورالعمل سازنده با کمی تغییرات انجام شد. cDNA در واکنش‌های 20 میکرولیتری با استفاده از 0.7 تا 1 میکروگرم از RNA کل سنتز شد. آغازگرها از مقالات منتشر شده قبلی 42، 71، 72، 73، 74، 75، 76، 77، 78 (جدول S1) انتخاب شدند و پروب‌های همراه با استفاده از ابزار PrimerQuest از Integrated DNA Technologies طراحی شدند. تمام ژن‌های مورد نظر نسبت به ژن هسته‌ای B2M نرمال‌سازی شدند. بیان ژن STOML2، NRF1، NFE2L2، TFAM، cMYC و OPA1 با استفاده از RT-qPCR اندازه‌گیری شد. مخلوط اصلی شامل پلیمراز LUNA Taq (M3003L، New England Biolabs)، پرایمرهای رو به جلو و معکوس 10 میکرومولار، cDNA و آب مخصوص PCR بود تا حجم نهایی 10 میکرولیتر برای هر واکنش حاصل شود. بیان ژن‌های تقسیم و شکافت (DRP1، MFN1/2) با استفاده از سنجش‌های چندگانه TaqMan اندازه‌گیری شد. مخلوط اصلی Luna Universal Probe qPCR (M3004S، New England Biolabs) طبق دستورالعمل سازنده با تغییرات جزئی استفاده شد. مخلوط اصلی RT-qPCR چندگانه شامل 1X پلیمراز LUNA Taq، پرایمرهای رو به جلو و معکوس 10 میکرومولار، پروب 10 میکرومولار، cDNA و آب مخصوص PCR است که در نتیجه حجم نهایی 20 میکرولیتر برای هر واکنش حاصل می‌شود. RT-qPCR با استفاده از Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - شماره سریال: R0618110) انجام شد. شرایط چرخه در جدول S1 نشان داده شده است. تمام نمونه‌های cDNA در سه تکرار تکثیر شدند و یک منحنی استاندارد با استفاده از یک سری رقت‌های ده برابری ایجاد شد. موارد پرت در نمونه‌های سه تکرار با انحراف معیار آستانه چرخه (Ct) > 0.5 از تجزیه و تحلیل حذف شدند تا از تکرارپذیری داده‌ها اطمینان حاصل شود30،72. بیان نسبی ژن با استفاده از روش 2-ΔΔCt79 محاسبه شد.
نمونه‌های پروتئینی (60 میکروگرم) با بافر بارگیری Laemmli با نسبت 2:1 مخلوط شده و روی ژل پروتئین بی‌رنگ 12٪ (Bio-Rad #1610184) اجرا شدند. پروتئین‌ها با استفاده از سیستم Trans-Blot Turbo (#170-4155، Bio-Rad) به غشای PVDF (پلی‌وینیلیدین فلوراید) (#170-84156، Bio-Rad) منتقل شدند. غشا مسدود شده و با آنتی‌بادی‌های اولیه مناسب (OPA1، MFN1، MFN2 و DRP1) (رقیق شده با نسبت 1:1000) به مدت 48 ساعت انکوبه شد و پس از آن با آنتی‌بادی‌های ثانویه (1:10000) به مدت 1 ساعت انکوبه شد. سپس غشاها با استفاده از Clarity Western ECL Substrate (#170-5061، Bio-Rad) تصویربرداری شده و با استفاده از سیستم Bio-Rad ChemiDoc MP ثبت شدند. برای آنالیز وسترن بلات از نرم‌افزار ImageLab نسخه 6.1 استفاده شد. ژل و بلات اصلی در شکل S1 نشان داده شده‌اند. اطلاعات آنتی‌بادی در جدول S2 ارائه شده است.
مجموعه داده‌ها به صورت میانگین و خطای استاندارد میانگین (SEM) حداقل سه نمونه مستقل ارائه شده‌اند. مجموعه داده‌ها قبل از فرض توزیع گاوسی و انحراف معیار برابر و ادامه تحلیل‌ها، با استفاده از آزمون شاپیرو-ویلکس (مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد) از نظر نرمال بودن بررسی شدند. علاوه بر تجزیه و تحلیل مجموعه داده‌ها، از آزمون فیشر MEL LSD (p < 0.05)، آنالیز واریانس یک طرفه (میانگین تیمار در مقابل کنترل) و آزمون مقایسه چندگانه دانت برای تعیین معنی‌داری (p < 0.05) استفاده شد. مقادیر p معنی‌دار در نمودار به صورت *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001 نشان داده شده‌اند. تمام تحلیل‌های آماری و نمودارها با استفاده از GraphPad Prism 9.4.0 انجام و تولید شده‌اند.
ماکروهای Fiji/ImageJ برای تحلیل تصاویر TEM به صورت عمومی در GitHub به آدرس https://github.com/caaja/TEMMitoMacro و ماکروی Mitochondrial Event Locator (MEL) به صورت عمومی در GitHub به آدرس https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin در دسترس هستند.
میلیانا آ.، دوی ان ام و ویجایا آ. میتوکندری: تنظیم‌کننده‌های اصلی متابولیسم، هموستاز، استرس، پیری و اپی‌ژنتیک. اندونزیایی. علوم زیست‌پزشکی. مجله 13، 221–241 (2021).
بن-شاچار، دی. اختلال عملکرد چندوجهی میتوکندری در اسکیزوفرنی، کمپلکس I به عنوان یک هدف پاتولوژیک احتمالی. اسکیزوفرنی. منبع. 187، 3-10 (2017).
بوز، آ. و بیل، ام. اف. اختلال عملکرد میتوکندری در بیماری پارکینسون. مجله نوروشیمی. 139، 216–231 (2016).
شارما وی کی، سینگ تی جی و مهتا وی. میتوکندری تحت فشار: اهداف تهاجم در بیماری آلزایمر. میتوکندری 59، 48–57 (2021).
بلنگور پی.، دوآرته جی‌ام‌ان، شوک پی‌اف و فریرا جی‌کی. میتوکندری و مغز: انرژی زیستی و موارد دیگر. نوروتوکسین‌ها. منبع. 36، 219–238 (2019).
رانگاراجو، وی. و همکاران. میتوکندری پلیوتروپیک: تأثیر میتوکندری بر رشد عصبی و بیماری. مجله علوم اعصاب. 39، 8200–8208 (2019).
کاردانو-راموس، سی. و موریس، وی. ای. بیوژنز میتوکندری در نورون‌ها: چگونه و کجا. بین‌المللی بودن. مجله علوم مور. ۲۲، ۱۳۰۵۹ (۲۰۲۱).
یو، ر.، لندال، یو.، نیستر، م. و ژائو، ج. تنظیم دینامیک میتوکندری پستانداران: فرصت‌ها و چالش‌ها. فرانت. غدد درون‌ریز. (لوزان) 11، 374 (2020).
خاچو، م. و اسلک، آر. اس. دینامیک میتوکندری در تنظیم نوروژنز: از مغز در حال رشد تا بزرگسالی. رشد. دینامیک. 247، 47–53 (2018).