از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
نانوذرات انسولین (NPs) با محتوای بارگذاری بالا، کاربردهای مختلفی در اشکال دارویی مختلف پیدا کرده‌اند. هدف از این کار ارزیابی تأثیر فرآیندهای خشک کردن انجمادی و خشک کردن پاششی بر ساختار نانوذرات کیتوزان حاوی انسولین، با یا بدون مانیتول به عنوان محافظ انجمادی است. ما همچنین کیفیت این نانوذرات را با حل کردن مجدد آنها ارزیابی کردیم. قبل از آبگیری، اندازه ذرات نانوذرات متصل به هم کیتوزان/سدیم تری پلی فسفات/انسولین به 318 نانومتر بهینه شد، PDI برابر با 0.18، راندمان انکپسولاسیون 99.4٪ و بارگذاری 25.01٪ بود. پس از بازسازی، همه نانوذرات، به جز آنهایی که با روش خشک کردن انجمادی بدون استفاده از مانیتول تولید شدند، ساختار ذرات کروی خود را حفظ کردند. در مقایسه با نانوذرات حاوی مانیتول که توسط هر دو روش اسپری آبگیری شده بودند، نانوذرات خشک شده پاششی بدون مانیتول نیز کوچکترین اندازه متوسط ​​ذرات (376 نانومتر) و بالاترین محتوای بارگذاری (25.02٪) را با خواص مشابه نشان دادند. نرخ کپسوله‌سازی (۹۸.۷٪) و PDI (۰.۲۰) با روش‌های خشک کردن یا خشک کردن انجمادی. نانوذرات خشک شده با خشک کردن پاششی بدون مانیتول نیز منجر به سریع‌ترین آزادسازی انسولین و بالاترین راندمان جذب سلولی شدند. این کار نشان می‌دهد که خشک کردن پاششی می‌تواند نانوذرات انسولین را بدون نیاز به محافظ‌های انجمادی در مقایسه با روش‌های خشک کردن انجمادی مرسوم، آبگیری کند و ظرفیت بارگذاری بیشتر، نیاز به افزودنی کمتر و هزینه‌های عملیاتی کمتری ایجاد کند.
از زمان کشف آن در سال ۱۹۲۲، انسولین و فرآورده‌های دارویی آن جان بیماران مبتلا به دیابت نوع ۱ (T1DM) و دیابت نوع ۲ (T1DM) را نجات داده‌اند. با این حال، به دلیل خواص آن به عنوان یک پروتئین با وزن مولکولی بالا، انسولین به راحتی تجمع می‌یابد، توسط آنزیم‌های پروتئولیتیک تجزیه می‌شود و توسط اثر عبور اول از کبد حذف می‌شود. افرادی که به دیابت نوع ۱ مبتلا هستند، تا آخر عمر به تزریق انسولین نیاز دارند. بسیاری از بیمارانی که در ابتدا به دیابت نوع ۲ مبتلا شده‌اند، نیاز به تزریق طولانی مدت انسولین نیز دارند. تزریق روزانه انسولین منبع جدی درد و ناراحتی روزانه برای این افراد است و اثرات منفی بر سلامت روان دارد. در نتیجه، اشکال دیگر تجویز انسولین که ناراحتی کمتری ایجاد می‌کنند، مانند تجویز خوراکی انسولین، به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته‌اند، زیرا این روش‌ها پتانسیل بازیابی کیفیت زندگی تقریباً ۵ میلیارد فرد مبتلا به دیابت در سراسر جهان را دارند.
فناوری نانوذرات پیشرفت قابل توجهی در تلاش‌ها برای مصرف انسولین خوراکی ایجاد کرده است4،6،7. فناوری‌ای که انسولین را به طور مؤثر کپسوله کرده و از تخریب آن برای رساندن هدفمند به نقاط خاص بدن محافظت می‌کند. با این حال، استفاده از فرمولاسیون نانوذرات محدودیت‌های متعددی دارد که عمدتاً به دلیل مشکلات پایداری سوسپانسیون‌های ذرات است. ممکن است در طول ذخیره‌سازی مقداری تجمع رخ دهد که فراهمی زیستی نانوذرات حاوی انسولین را کاهش می‌دهد8. علاوه بر این، پایداری شیمیایی ماتریس پلیمری نانوذرات و انسولین نیز باید برای اطمینان از پایداری نانوذرات انسولین (NPs) در نظر گرفته شود. در حال حاضر، فناوری خشک کردن انجمادی استاندارد طلایی برای ایجاد نانوذرات پایدار و در عین حال جلوگیری از تغییرات ناخواسته در طول ذخیره‌سازی است9.
با این حال، خشک کردن انجمادی نیاز به افزودن مواد محافظ انجماد دارد تا از تأثیر فشار مکانیکی کریستال‌های یخ بر ساختار کروی نانوذرات جلوگیری شود. این امر به طور قابل توجهی بارگذاری نانوذرات انسولین را پس از لیوفیلیزاسیون کاهش می‌دهد، زیرا ماده محافظ انجماد بیشترین نسبت وزنی را اشغال می‌کند. بنابراین، نانوذرات انسولین تولید شده اغلب برای ساخت فرمولاسیون‌های پودر خشک، مانند قرص‌های خوراکی و فیلم‌های خوراکی، به دلیل نیاز به مقادیر زیادی نانوذرات خشک برای دستیابی به پنجره درمانی انسولین، نامناسب هستند.
خشک کردن پاششی یک فرآیند شناخته شده و ارزان در مقیاس صنعتی برای تولید پودرهای خشک از فازهای مایع در صنعت داروسازی است10،11. کنترل بر فرآیند تشکیل ذرات امکان کپسوله کردن مناسب چندین ترکیب زیست فعال را فراهم می‌کند12،13. علاوه بر این، به یک تکنیک موثر برای تهیه پروتئین‌های کپسوله شده برای مصرف خوراکی تبدیل شده است. در طول خشک کردن پاششی، آب خیلی سریع تبخیر می‌شود که به پایین نگه داشتن دمای هسته ذرات کمک می‌کند11،14 و امکان استفاده از آن را برای کپسوله کردن اجزای حساس به گرما فراهم می‌کند. قبل از خشک کردن پاششی، مواد پوشش دهنده باید کاملاً با محلول حاوی مواد کپسوله شده همگن شوند11،14. برخلاف خشک کردن انجمادی، همگن‌سازی قبل از کپسوله کردن در خشک کردن پاششی، راندمان کپسوله کردن را در طول آبگیری بهبود می‌بخشد. از آنجایی که فرآیند کپسوله کردن پاششی به مواد محافظ انجمادی نیاز ندارد، می‌توان از خشک کردن پاششی برای تولید نانوذرات خشک شده با محتوای بارگذاری بالا استفاده کرد.
این مطالعه تولید نانوذرات حاوی انسولین را با اتصال عرضی کیتوزان و سدیم تری‌پلی‌فسفات با استفاده از روش ژل یونی گزارش می‌دهد. ژلاسیون یونی روشی برای آماده‌سازی است که امکان تولید نانوذرات را از طریق برهمکنش‌های الکترواستاتیک بین دو یا چند گونه یونی تحت شرایط خاص فراهم می‌کند. از هر دو تکنیک خشک کردن انجمادی و خشک کردن پاششی برای آبگیری نانوذرات بهینه شده با اتصال عرضی کیتوزان/سدیم تری‌پلی‌فسفات/انسولین استفاده شد. پس از آبگیری، مورفولوژی آنها توسط SEM تجزیه و تحلیل شد. توانایی نوترکیبی آنها با اندازه‌گیری توزیع اندازه، بار سطحی، PDI، راندمان کپسوله‌سازی و محتوای بارگیری آنها ارزیابی شد. کیفیت نانوذرات حل‌شده تولید شده با روش‌های مختلف آبگیری نیز با مقایسه محافظت از انسولین، رفتار آزادسازی و اثربخشی جذب سلولی آنها ارزیابی شد.
pH محلول مخلوط و نسبت کیتوزان و انسولین دو عامل کلیدی هستند که بر اندازه ذرات و راندمان کپسوله‌سازی (EE) نانوذرات نهایی تأثیر می‌گذارند، زیرا آنها مستقیماً بر فرآیند ژل شدن یونوتروپیک تأثیر می‌گذارند. نشان داده شد که pH محلول مخلوط با اندازه ذرات و راندمان کپسوله‌سازی همبستگی بالایی دارد (شکل 1a). همانطور که در شکل 1a نشان داده شده است، با افزایش pH از 4.0 به 6.0، اندازه متوسط ​​ذرات (نانومتر) کاهش یافته و راندمان کپسوله‌سازی به طور قابل توجهی افزایش می‌یابد، در حالی که وقتی pH به 6.5 افزایش می‌یابد، اندازه متوسط ​​ذرات شروع به افزایش می‌کند و راندمان کپسوله‌سازی بدون تغییر باقی می‌ماند. با افزایش نسبت کیتوزان به انسولین، اندازه متوسط ​​ذرات نیز افزایش می‌یابد. علاوه بر این، هنگامی که نانوذرات با نسبت جرمی کیتوزان/انسولین بالاتر از 2.5:1 (وزنی/وزنی) تهیه شدند، هیچ تغییری در راندمان کپسوله‌سازی مشاهده نشد (شکل 1b). بنابراین، شرایط بهینه آماده‌سازی در این مطالعه (pH 6.0، نسبت جرمی کیتوزان/انسولین 2.5:1) برای نانوذرات حاوی انسولین را برای مطالعه بیشتر آماده کنید. تحت این شرایط آماده‌سازی، میانگین اندازه ذرات نانوذرات انسولین به 318 نانومتر (شکل 1c)، PDI برابر با 0.18، راندمان جاسازی 99.4٪، پتانسیل زتا 9.8 میلی‌ولت و بارگذاری انسولین 25.01٪ (m/m) بهینه شد. بر اساس نتایج میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، نانوذرات بهینه شده تقریباً کروی و گسسته با اندازه نسبتاً یکنواخت بودند (شکل 1d).
بهینه‌سازی پارامتر نانوذرات انسولین: (الف) تأثیر pH بر میانگین قطر و راندمان کپسوله‌سازی (EE) نانوذرات انسولین (تهیه‌شده با نسبت جرمی 5:1 کیتوزان و انسولین)؛ (ب) کیتوزان و تأثیر نسبت جرمی انسولین بر میانگین قطر و راندمان کپسوله‌سازی (EE) نانوذرات انسولین (تهیه‌شده در pH 6)؛ (ج) توزیع اندازه ذرات نانوذرات انسولین بهینه‌شده؛ (د) تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) از نانوذرات انسولین بهینه‌شده.
به خوبی شناخته شده است که کیتوزان یک پلی الکترولیت ضعیف با pKa برابر با 6.5 است. این ماده در محیط اسیدی دارای بار مثبت است زیرا گروه آمین اصلی آن توسط یون‌های هیدروژن پروتونه شده است15. بنابراین، اغلب به عنوان حامل برای کپسوله کردن ماکرومولکول‌های با بار منفی استفاده می‌شود. در این مطالعه، از کیتوزان برای کپسوله کردن انسولین با نقطه ایزوالکتریک 5.3 استفاده شد. از آنجایی که کیتوزان به عنوان ماده پوشش دهنده استفاده می‌شود، با افزایش نسبت آن، ضخامت لایه بیرونی نانوذرات به طور متناسب افزایش می‌یابد و در نتیجه اندازه متوسط ​​ذرات بزرگتر می‌شود. علاوه بر این، سطوح بالاتر کیتوزان می‌تواند انسولین بیشتری را کپسوله کند. در مورد ما، EE زمانی که نسبت کیتوزان و انسولین به 2.5:1 رسید، بالاترین بود و هنگامی که این نسبت به طور مداوم افزایش یافت، تغییر قابل توجهی در EE مشاهده نشد.
علاوه بر نسبت کیتوزان و انسولین، pH نیز نقش مهمی در تهیه نانوذرات ایفا کرد. گان و همکارانش 17 تأثیر pH را بر اندازه ذرات نانوذرات کیتوزان بررسی کردند. آنها کاهش مداوم اندازه ذرات را تا رسیدن pH به 6.0 مشاهده کردند و افزایش قابل توجهی در اندازه ذرات در pH > 6.0 مشاهده شد که با مشاهدات ما مطابقت دارد. این پدیده به این دلیل است که با افزایش pH، مولکول انسولین بار سطحی منفی پیدا می‌کند، بنابراین برهمکنش‌های الکترواستاتیک با کمپلکس کیتوزان/سدیم تری پلی فسفات (TPP) را ترجیح می‌دهد و در نتیجه اندازه ذرات کوچک و EE بالا ایجاد می‌شود. با این حال، هنگامی که pH به 6.5 تنظیم شد، گروه‌های آمینه روی کیتوزان پروتون‌زدایی شدند و در نتیجه تاخوردگی کیتوزان ایجاد شد. بنابراین، pH بالا منجر به قرار گرفتن کمتر یون‌های آمینه در معرض TPP و انسولین می‌شود که منجر به پیوند عرضی کمتر، اندازه متوسط ​​ذرات نهایی بزرگتر و EE کمتر می‌شود.
تجزیه و تحلیل خواص مورفولوژیکی نانوذرات خشک‌شده انجمادی و خشک‌شده پاششی می‌تواند در انتخاب تکنیک‌های بهتر آبگیری و تشکیل پودر راهنمایی کند. روش ترجیحی باید پایداری دارو، شکل ذرات یکنواخت، بارگذاری بالای دارو و حلالیت خوب در محلول اصلی را فراهم کند. در این مطالعه، برای مقایسه بهتر دو تکنیک، نانوذرات انسولین با یا بدون 1٪ مانیتول در طول آبگیری استفاده شدند. مانیتول به عنوان یک عامل حجم‌دهنده یا محافظ انجمادی در فرمولاسیون‌های مختلف پودر خشک برای خشک‌کردن انجمادی و خشک‌کردن پاششی استفاده می‌شود. برای نانوذرات انسولین لیوفیلیزه شده بدون مانیتول، همانطور که در شکل 2a نشان داده شده است، یک ساختار پودری بسیار متخلخل با سطوح بزرگ، نامنظم و خشن تحت میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) مشاهده شد. ذرات گسسته کمی پس از آبگیری در پودر شناسایی شدند (شکل 2e). این نتایج نشان داد که بیشتر نانوذرات در طول خشک‌کردن انجمادی بدون هیچ محافظ انجمادی تجزیه شدند. برای نانوذرات انسولین خشک‌شده انجمادی و خشک‌شده پاششی حاوی 1٪ مانیتول، نانوذرات کروی با سطوح صاف مشاهده شد (شکل 2b، d، f، h). نانوذرات انسولین نانوذرات خشک‌شده با اسپری خشک بدون مانیتول، کروی باقی ماندند اما روی سطح چروکیده شدند (شکل 2c). سطوح کروی و چروکیده در آزمایش‌های رفتار رهایش و جذب سلولی زیر بیشتر مورد بحث قرار گرفته‌اند. بر اساس ظاهر قابل مشاهده نانوذرات خشک‌شده، هم نانوذرات خشک‌شده با اسپری خشک بدون مانیتول و هم نانوذرات خشک‌شده با انجماد و اسپری خشک‌شده با مانیتول، پودرهای نانوذرات ریز تولید کردند (شکل 2f، g، h). هرچه مساحت سطح بین سطوح ذرات بیشتر باشد، حلالیت بیشتر و بنابراین سرعت رهایش بیشتر می‌شود.
ریخت‌شناسی نانوذرات انسولین دهیدراته مختلف: (الف) تصویر SEM نانوذرات انسولین لیوفیلیزه شده بدون مانیتول؛ (ب) تصویر SEM نانوذرات انسولین لیوفیلیزه شده با مانیتول؛ (ج) نانوذرات انسولین خشک شده به روش اسپری بدون مانیتول تصویر SEM از؛ (د) تصویر SEM نانوذرات انسولین خشک شده به روش اسپری با مانیتول؛ (ه) تصویر پودر نانوذرات انسولین لیوفیلیزه شده بدون مانیتول؛ (و) تصویر نانوذرات انسولین لیوفیلیزه شده با مانیتول؛ (ز) تصویر پودر نانوذرات انسولین خشک شده به روش اسپری بدون مانیتول؛ (ح) تصویر پودر نانوذرات انسولین خشک شده به روش اسپری با مانیتول.
در طول خشک کردن انجمادی، مانیتول به عنوان یک محافظ انجمادی عمل می‌کند و نانوذرات را به شکل آمورف نگه می‌دارد و از آسیب توسط کریستال‌های یخ جلوگیری می‌کند19. در مقابل، در طول خشک کردن پاششی هیچ مرحله انجمادی وجود ندارد. بنابراین در این روش نیازی به مانیتول نیست. در واقع، نانوذرات خشک شده با اسپری بدون مانیتول، نانوذرات ریزتری را همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تولید کردند. با این حال، مانیتول همچنان می‌تواند به عنوان یک پرکننده در فرآیند خشک کردن پاششی عمل کند تا به نانوذرات ساختار کروی‌تری بدهد20 (شکل 2d)، که به دستیابی به رفتار رهایش یکنواخت چنین نانوذرات کپسوله شده‌ای کمک می‌کند. علاوه بر این، واضح است که برخی ذرات بزرگ را می‌توان در نانوذرات انسولین خشک شده انجمادی و خشک شده با اسپری حاوی مانیتول تشخیص داد (شکل 2b،d)، که ممکن است به دلیل تجمع مانیتول در هسته ذرات همراه با انسولین کپسوله شده باشد. به.لایه کیتوزان. شایان ذکر است که در این مطالعه، برای اطمینان از اینکه ساختار کروی پس از آبگیری دست نخورده باقی می‌ماند، نسبت مانیتول و کیتوزان در 5:1 نگه داشته می‌شود، به طوری که مقدار زیادی پرکننده نیز می‌تواند اندازه ذرات نانوذرات خشک شده را بزرگتر کند.
طیف‌سنجی بازتاب کلی تضعیف‌شده مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR-ATR) مخلوط فیزیکی انسولین آزاد، کیتوزان، کیتوزان، TPP و انسولین را مشخص کرد. تمام نانوذرات دهیدراته با استفاده از طیف‌سنجی FTIR-ATR مشخص شدند. نکته قابل توجه این است که شدت باندهای 1641، 1543 و 1412 cm-1 در نانوذرات کپسوله شده خشک‌شده با مانیتول و در نانوذرات خشک‌شده با اسپری با و بدون مانیتول مشاهده شد (شکل 3). همانطور که قبلاً گزارش شد، این افزایش قدرت با پیوند عرضی بین کیتوزان، TPP و انسولین مرتبط بود. بررسی برهمکنش بین کیتوزان و انسولین نشان داد که در طیف‌های FTIR نانوذرات کیتوزان حاوی انسولین، باند کیتوزان با باند انسولین همپوشانی دارد و شدت کربونیل (1641 cm-1) و کمربند آمین (1543 cm-1) را افزایش می‌دهد. گروه‌های تری‌پلی‌فسفات TPP به گروه‌های آمونیوم در کیتوزان متصل می‌شوند و یک ... تشکیل می‌دهند. باند در ۱۴۱۲ سانتی‌متر-۱.
طیف‌های FTIR-ATR انسولین آزاد، کیتوزان، مخلوط‌های فیزیکی کیتوزان/TPP/انسولین و نانوذرات آبگیری شده با روش‌های مختلف.
علاوه بر این، این نتایج با نتایج نشان داده شده در SEM مطابقت دارد، که نشان داد نانوذرات کپسوله شده هم هنگام اسپری کردن و هم هنگام خشک کردن انجمادی با مانیتول دست نخورده باقی ماندند، اما در غیاب مانیتول، فقط خشک کردن پاششی ذرات کپسوله شده تولید کرد. در مقابل، نتایج طیفی FTIR-ATR نانوذرات خشک شده انجمادی بدون مانیتول بسیار شبیه به مخلوط فیزیکی کیتوزان، TPP و انسولین بود. این نتیجه نشان می‌دهد که پیوندهای عرضی بین کیتوزان، TPP و انسولین دیگر در نانوذرات خشک شده انجمادی بدون مانیتول وجود ندارند. ساختار نانوذرات در طول خشک کردن انجمادی بدون محافظ انجمادی تخریب شد، که در نتایج SEM قابل مشاهده است (شکل 2a). بر اساس مورفولوژی و نتایج FTIR نانوذرات انسولین دهیدراته، فقط نانوذرات لیوفیلیزه، اسپری خشک و بدون مانیتول برای آزمایش‌های بازسازی و نانوذرات بدون مانیتول به دلیل تجزیه نانوذرات بدون مانیتول در طول دهیدراته شدن استفاده شدند. بحث کردن.
آب‌زدایی برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت و بازفرآوری به فرمولاسیون‌های دیگر استفاده می‌شود. توانایی نانوذرات خشک برای بازسازی پس از ذخیره‌سازی برای استفاده از آنها در فرمولاسیون‌های مختلف مانند قرص‌ها و فیلم‌ها بسیار مهم است. ما متوجه شدیم که اندازه متوسط ​​ذرات نانوذرات انسولین خشک‌شده با اسپری در غیاب مانیتول، پس از بازسازی تنها اندکی افزایش یافت. از سوی دیگر، اندازه ذرات نانوذرات انسولین خشک‌شده با اسپری و خشک‌شده با انجماد با مانیتول به طور قابل توجهی افزایش یافت (جدول 1). PDI و EE پس از نوترکیبی همه نانوذرات در این مطالعه تغییر معنی‌داری نداشتند (0.05 > p). این نتیجه نشان می‌دهد که بیشتر ذرات پس از حل شدن مجدد دست‌نخورده باقی ماندند. با این حال، افزودن مانیتول منجر به کاهش قابل توجه بارگیری انسولین نانوذرات مانیتول لیوفیلیزه و خشک‌شده با اسپری شد (جدول 1). در مقابل، محتوای بار انسولین نانوذرات خشک‌شده با اسپری بدون مانیتول مانند قبل باقی ماند (جدول 1).
به خوبی شناخته شده است که بارگذاری نانوذرات هنگام استفاده برای اهداف دارورسانی بسیار مهم است. برای نانوذرات با بارگذاری کم، مقادیر بسیار زیادی از مواد برای رسیدن به آستانه درمانی مورد نیاز است. با این حال، ویسکوزیته بالای چنین غلظت‌های بالای نانوذرات منجر به ناراحتی و دشواری در تجویز خوراکی و فرمولاسیون‌های تزریقی، به ترتیب می‌شود.22. علاوه بر این، نانوذرات انسولین همچنین می‌توانند برای ساخت قرص‌ها و بیوفیلم‌های چسبناک استفاده شوند.23، 24، که نیاز به استفاده از مقادیر زیادی نانوذرات در سطوح بارگذاری کم دارد و منجر به قرص‌های بزرگ و بیوفیلم‌های ضخیمی می‌شود که برای کاربردهای خوراکی مناسب نیستند. بنابراین، نانوذرات دهیدراته با بار انسولین بالا بسیار مطلوب هستند. نتایج ما نشان می‌دهد که بار انسولین بالای نانوذرات اسپری درایر بدون مانیتول می‌تواند مزایای جذاب زیادی را برای این روش‌های جایگزین دارورسانی ارائه دهد.
تمام نانوذرات آبگیری شده به مدت سه ماه در یخچال نگهداری شدند. نتایج SEM نشان داد که مورفولوژی تمام نانوذرات آبگیری شده در طول مدت نگهداری سه ماهه تغییر قابل توجهی نکرد (شکل 4). پس از بازسازی در آب، تمام نانوذرات کاهش جزئی در EE نشان دادند و تقریباً مقدار کمی (~5%) انسولین را در طول دوره نگهداری سه ماهه آزاد کردند (جدول 2). با این حال، میانگین اندازه ذرات همه نانوذرات افزایش یافت. اندازه ذرات نانوذرات خشک شده با اسپری بدون مانیتول به 525 نانومتر افزایش یافت، در حالی که نانوذرات خشک شده با اسپری و خشک شده با انجماد با مانیتول به ترتیب به 872 و 921 نانومتر افزایش یافت (جدول 2).
ریخت‌شناسی نانوذرات انسولین دهیدراته مختلف که به مدت سه ماه نگهداری شده‌اند: (الف) تصویر SEM نانوذرات انسولین لیوفیلیزه شده با مانیتول؛ (ب) تصویر SEM نانوذرات انسولین خشک‌شده با اسپری بدون مانیتول؛ (ج) تصاویر SEM نانوذرات انسولین خشک‌شده با اسپری بدون مانیتول.
علاوه بر این، رسوباتی در نانوذرات انسولین بازسازی‌شده که با مانیتول اسپری خشک و سپس فریز شده بودند، مشاهده شد (شکل S2). این ممکن است ناشی از ذرات بزرگی باشد که به درستی در آب معلق نشده‌اند. تمام نتایج فوق نشان می‌دهد که تکنیک اسپری خشک می‌تواند نانوذرات انسولین را از کم‌آبی محافظت کند و می‌توان بدون هیچ پرکننده یا محافظ انجمادی، نانوذرات انسولین زیادی را با حجم بالا به دست آورد.
حفظ انسولین در محیط pH = 2.5 با پپسین، تریپسین و α-کیموتریپسین آزمایش شد تا توانایی محافظتی نانوذرات در برابر هضم آنزیمی پس از دهیدراسیون نشان داده شود. حفظ انسولین نانوذرات دهیدراته با نانوذرات تازه تهیه شده مقایسه شد و انسولین آزاد به عنوان کنترل منفی استفاده شد. در این مطالعه، انسولین آزاد حذف سریع انسولین را در عرض 4 ساعت در هر سه تیمار آنزیمی نشان داد (شکل 5a-c). در مقابل، آزمایش حذف انسولین نانوذرات خشک شده با مانیتول و نانوذرات خشک شده با اسپری با یا بدون مانیتول، محافظت قابل توجهی بالاتر از این نانوذرات در برابر هضم آنزیمی نشان داد که مشابه نانوذرات انسولین تازه تهیه شده بود (شکل 1).5a-c). با کمک نانوذرات در پپسین، تریپسین و α-کیموتریپسین، به ترتیب بیش از 50٪، 60٪ و 75٪ انسولین را می‌توان در عرض 4 ساعت محافظت کرد (شکل 5a-c). این توانایی محافظت از انسولین ممکن است احتمال جذب بیشتر انسولین در جریان خون را افزایش دهد25. این نتایج نشان می‌دهد که خشک کردن اسپری با یا بدون مانیتول و خشک کردن انجمادی با مانیتول می‌تواند توانایی محافظت از انسولین نانوذرات را پس از آبگیری حفظ کند.
رفتار محافظت و رهایش نانوذرات انسولین دهیدراته: (الف) محافظت از انسولین در محلول پپسین؛ (ب) محافظت از انسولین در محلول تریپسین؛ (ج) محافظت از انسولین توسط محلول α-کیموتریپسین؛ (د) رفتار رهایش نانوذرات دهیدراته در محلول pH = 2.5؛ (ه) رفتار رهایش نانوذرات دهیدراته در محلول pH = 6.6؛ (و) رفتار رهایش نانوذرات دهیدراته در محلول pH = 7.0.
نانوذرات انسولین خشک تازه تهیه و بازسازی‌شده در بافرهای مختلف (pH = 2.5، 6.6، 7.0) در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و محیط pH معده، دوازدهه و قسمت فوقانی روده کوچک را شبیه‌سازی کردند تا اثر انسولین بر مقاومت به انسولین بررسی شود. رفتار رهایش در محیط‌های مختلف. قطعه‌ای از دستگاه گوارش. در pH = 2.5، نانوذرات بارگیری شده با انسولین و نانوذرات انسولین خشک حل‌شده، رهایش اولیه انفجاری را در یک ساعت اول نشان دادند و به دنبال آن در 5 ساعت بعدی رهایش آهسته‌ای داشتند (شکل 5d). این رهایش سریع در ابتدا به احتمال زیاد نتیجه واجذب سطحی سریع مولکول‌های پروتئینی است که به طور کامل در ساختار داخلی ذره بی‌حرکت نشده‌اند. در pH = 6.5، نانوذرات بارگیری شده با انسولین و نانوذرات انسولین خشک بازسازی‌شده، رهایش نرم و آهسته‌ای را در طول 6 ساعت نشان دادند، زیرا pH محلول آزمایش مشابه محلول تهیه‌شده با نانوذرات بود (شکل 5e). در pH = 7، نانوذرات ناپایدار بودند و تقریباً در دو ساعت اول به طور کامل تجزیه شدند (شکل 5f). این به این دلیل است که پروتون‌زدایی کیتوزان در pH بالاتر رخ می‌دهد که منجر به شبکه پلیمری با فشردگی کمتر و رهایش انسولین بارگیری‌شده می‌شود.
علاوه بر این، نانوذرات انسولین خشک‌شده با روش اسپری و بدون مانیتول، نسبت به سایر نانوذرات دهیدراته، پروفایل رهایش سریع‌تری نشان دادند (شکل 5d-f). همانطور که قبلاً توضیح داده شد، نانوذرات انسولین بازسازی‌شده خشک‌شده بدون مانیتول، کوچکترین اندازه ذرات را نشان دادند. ذرات کوچک، سطح بزرگتری را فراهم می‌کنند، بنابراین بیشتر داروی مربوطه در سطح یا نزدیک سطح ذرات قرار می‌گیرد و منجر به رهایش سریع دارو می‌شود.26
سمیت سلولی نانوذرات با استفاده از روش MTT بررسی شد. همانطور که در شکل S4 نشان داده شده است، مشخص شد که تمام نانوذرات دهیدراته شده در غلظت‌های 50 تا 500 میکروگرم در میلی‌لیتر هیچ تأثیر معنی‌داری بر زیست‌پذیری سلول‌ها ندارند، که نشان می‌دهد می‌توان از تمام نانوذرات دهیدراته شده با خیال راحت برای رسیدن به پنجره درمانی استفاده کرد.
کبد اندام اصلی است که انسولین از طریق آن عملکردهای فیزیولوژیکی خود را اعمال می‌کند. سلول‌های HepG2 یک رده سلولی تومور کبدی انسان هستند که معمولاً به عنوان مدل جذب هپاتوسیت در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) استفاده می‌شوند. در اینجا، از سلول‌های HepG2 برای ارزیابی جذب سلولی نانوذرات دهیدراته شده با استفاده از روش‌های خشک کردن انجمادی و خشک کردن اسپری استفاده شد. جذب سلولی با استفاده از اسکن لیزر کانفوکال با استفاده از فلوسیتومتری و بینایی پس از چند ساعت انکوباسیون با انسولین آزاد FITC در غلظت 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر، نانوذرات تازه تهیه شده حاوی انسولین FITC و نانوذرات FITC حاوی انسولین دهیدراته شده در غلظت‌های مساوی انسولین انجام شد. مشاهدات میکروسکوپی کمی (CLSM) انجام شد. نانوذرات لیوفیلیزه شده بدون مانیتول در طول دهیدراته شدن از بین رفتند و در این آزمایش ارزیابی نشدند. شدت فلورسانس درون سلولی نانوذرات تازه تهیه شده حاوی انسولین، نانوذرات لیوفیلیزه شده با مانیتول و نانوذرات اسپری خشک شده با و بدون مانیتول (شکل 6a) به ترتیب ۴.۳، ۲.۶، ۲.۴ و ۴.۱ برابر بیشتر از نمونه‌های آزاد. گروه FITC-انسولین (شکل ۶b). این نتایج نشان می‌دهد که انسولین کپسوله شده در جذب سلولی قوی‌تر از انسولین آزاد است، که عمدتاً به دلیل اندازه کوچکتر نانوذرات حاوی انسولین تولید شده در این مطالعه است.
جذب سلول‌های HepG2 پس از 4 ساعت انکوباسیون با نانوذرات تازه تهیه شده و نانوذرات دهیدراته شده: (الف) توزیع جذب FITC-انسولین توسط سلول‌های HepG2. (ب) میانگین هندسی شدت‌های فلورسانس تجزیه و تحلیل شده توسط فلوسیتومتری (n = 3)، *P < 0.05 در مقایسه با انسولین آزاد.
به همین ترتیب، تصاویر CLSM نشان داد که شدت فلورسانس FITC نانوذرات تازه تهیه شده حاوی انسولین و نانوذرات خشک شده با اسپری حاوی انسولین (بدون مانیتول) بسیار قوی‌تر از نمونه‌های دیگر بود (شکل 6a). علاوه بر این، با افزودن مانیتول، ویسکوزیته بالاتر محلول، مقاومت در برابر جذب سلولی را افزایش داد و در نتیجه تکثیر انسولین کاهش یافت. این نتایج نشان می‌دهد که نانوذرات خشک شده با اسپری بدون مانیتول، بالاترین راندمان جذب سلولی را نشان می‌دهند، زیرا اندازه ذرات آنها پس از انحلال مجدد کوچکتر از نانوذرات خشک شده با انجماد بود.
کیتوزان (با وزن مولکولی متوسط ​​۱۰۰ کیلو دالتون، ۷۵ تا ۸۵ درصد داستیله) از شرکت سیگما-آلدریچ (اوکویل، انتاریو، کانادا) خریداری شد. سدیم تری‌پلی‌فسفات (TPP) از شرکت VWR (رادنور، پنسیلوانیا، ایالات متحده) خریداری شد. انسولین نوترکیب انسانی مورد استفاده در این مطالعه از شرکت فیشر ساینتیفیک (والتام، ماساچوست، ایالات متحده) بود. انسولین انسانی نشاندار شده با فلورسین ایزوتیوسیانات (FITC) و ۴′،۶-دی‌آمیدینو-۲-فنیل‌ایندول دی‌هیدروکلراید (DAPI) از شرکت سیگما-آلدریچ (اوکویل، انتاریو، کانادا) خریداری شدند. رده سلولی HepG2 از شرکت ATCC (ماناساس، ویرجینیا، ایالات متحده) تهیه شد. سایر معرف‌ها از نوع تحلیلی یا کروماتوگرافی بودند.
محلول CS با غلظت 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر را با حل کردن آن در آب مقطر دوبار تقطیر شده (آب DD) حاوی 0.1٪ اسید استیک تهیه کنید. محلول‌های 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر از TPP و انسولین را به ترتیب با حل کردن آنها در آب DD و 0.1٪ اسید استیک تهیه کنید. پیش‌امولسیون با استفاده از هموژنایزر پرسرعت Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA) تهیه شد. فرآیند تهیه به شرح زیر است: ابتدا 2 میلی‌لیتر محلول TPP به 4 میلی‌لیتر محلول انسولین اضافه می‌شود و مخلوط به مدت 30 دقیقه هم زده شده و کاملاً مخلوط می‌شود. سپس، محلول مخلوط شده به صورت قطره‌ای از طریق سرنگ تحت هم زدن با سرعت بالا (10000 دور در دقیقه) به محلول CS اضافه می‌شود. مخلوط‌ها به مدت 30 دقیقه تحت هم زدن با سرعت بالا (15000 دور در دقیقه) در حمام یخ نگهداری شدند و برای به دست آوردن نانوذرات انسولین با پیوند متقاطع، pH آنها تنظیم شد. برای همگن‌سازی بیشتر و کاهش اندازه ذرات نانوذرات انسولین، به مدت 30 دقیقه دیگر در حمام یخ با استفاده از دستگاه سونیکاتور پروب مانند (UP 200ST، Hielscher Ultrasonics، Teltow، آلمان) تحت امواج فراصوت قرار گرفت.
نانوذرات انسولین (NPS) از نظر قطر متوسط ​​Z، شاخص پراکندگی (PDI) و پتانسیل زتا با استفاده از اندازه‌گیری‌های پراکندگی نور پویا (DLS) با استفاده از Litesizer 500 (آنتون پار، گراتس، اتریش) با رقیق کردن آنها در آب DD در دمای 25 درجه سانتیگراد آزمایش شدند. مورفولوژی و توزیع اندازه با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) Hitachi H7600 (هیتاچی، توکیو، ژاپن) مشخص شد و تصاویر متعاقباً با استفاده از نرم‌افزار تصویربرداری Hitachi (هیتاچی، توکیو، ژاپن) تجزیه و تحلیل شدند. برای ارزیابی راندمان کپسوله‌سازی (EE) و ظرفیت بارگذاری (LC) نانوذرات انسولین، نانوذرات به لوله‌های اولترافیلتراسیون با وزن مولکولی 100 کیلو دالتون منتقل شده و به مدت 30 دقیقه با سرعت 500 xg سانتریفیوژ شدند. انسولین کپسوله نشده در محلول فیلتر شده با استفاده از سیستم HPLC سری Agilent 1100 (Agilent، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) متشکل از یک پمپ چهارتایی، تعیین مقدار شد. نمونه بردار خودکار، گرمکن ستون و آشکارساز DAD. انسولین توسط ستون C18 (Zorbax، 3.5 میکرومتر، 4.6 میلی متر × 150 میلی متر، Agilent، ایالات متحده) تجزیه و تحلیل شد و در طول موج 214 نانومتر شناسایی شد. فاز متحرک استونیتریل و آب بود که حاوی 0.1٪ TFA، نسبت‌های گرادیان از 10/90 تا 100/0 بود و به مدت 10 دقیقه کار کرد. فاز متحرک با سرعت جریان 1.0 میلی لیتر در دقیقه پمپ شد. دمای ستون روی 20 درجه سانتیگراد تنظیم شد. درصد EE و LC را با استفاده از معادلات (1) و معادله (2) محاسبه کنید.
نسبت‌های مختلف CS/انسولین از 2.0 تا 4.0 برای بهینه‌سازی NP انسولین آزمایش شدند. مقادیر مختلفی از محلول CS در طول آماده‌سازی اضافه شد، در حالی که مخلوط انسولین/TPP ثابت نگه داشته شد. نانوذرات انسولین در محدوده pH 4.0 تا 6.5 با کنترل دقیق pH مخلوط پس از افزودن همه محلول‌ها (انسولین، TPP و CS) تهیه شدند. EE و اندازه ذرات نانوذرات انسولین در مقادیر pH مختلف و نسبت‌های جرمی CS/انسولین برای بهینه‌سازی تشکیل نانوذرات انسولین ارزیابی شدند.
نانوذرات انسولین بهینه‌شده روی ظرف آلومینیومی قرار داده شدند و با پارچه‌ای که با نوار چسب محکم شده بود، پوشانده شدند. متعاقباً، ظروف پیچ‌دار در یک خشک‌کن انجمادی Labconco FreeZone (Labconco، کانزاس سیتی، میسوری، ایالات متحده آمریکا) مجهز به خشک‌کن سینی‌دار قرار داده شدند. دما و فشار خلاء برای 2 ساعت اول روی 10- درجه سانتیگراد، 0.350 تور و برای 22 ساعت باقی‌مانده از 24 ساعت روی 0 درجه سانتیگراد و 0.120 تور تنظیم شدند تا نانوذرات انسولین خشک به دست آیند.
برای تولید انسولین کپسوله شده از دستگاه خشک کن اسپری کوچک Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI، فلاویل، سوئیس) استفاده شد. پارامترهای خشک کردن انتخاب شده عبارتند از: دمای 100 درجه سانتیگراد، جریان خوراک 3 لیتر در دقیقه و جریان گاز 4 لیتر در دقیقه.
نانوذرات انسولین قبل و بعد از آبگیری با استفاده از طیف‌سنجی FTIR-ATR مشخص شدند. نانوذرات آبگیری شده و همچنین انسولین آزاد و کیتوزان با استفاده از یک اسپکتروفتومتر FTIR مدل Spectrum 100 (PerkinElmer، Waltham، Massachusetts، USA) مجهز به یک وسیله جانبی نمونه‌برداری ATR جهانی (PerkinElmer، Waltham، Massachusetts، USA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. میانگین سیگنال‌ها از 16 اسکن با وضوح 4 سانتی‌متر مربع در محدوده فرکانس 4000-600 سانتی‌متر مربع به دست آمد.
مورفولوژی نانوذرات انسولین خشک با استفاده از تصاویر SEM نانوذرات انسولین خشک‌شده انجمادی و خشک‌شده پاششی که توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی پرتو یونی متمرکز Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI، هیلزبورو، اورگان، ایالات متحده) گرفته شده بود، ارزیابی شد. پارامتر اصلی مورد استفاده ولتاژ 5 کیلوالکترون ولت و جریان 30 میلی‌آمپر بود.
تمام نانوذرات انسولین دهیدراته شده در آب دی‌هیدراته دوباره حل شدند. اندازه ذرات، PDI، EE و LC دوباره با استفاده از همان روشی که قبلاً ذکر شد، برای ارزیابی کیفیت آنها پس از دهیدراته شدن آزمایش شدند. پایداری نانوذرات انیدروانسولین نیز با آزمایش خواص نانوذرات پس از نگهداری طولانی مدت اندازه‌گیری شد. در این مطالعه، تمام نانوذرات پس از دهیدراته شدن به مدت سه ماه در یخچال نگهداری شدند. پس از سه ماه نگهداری، نانوذرات از نظر اندازه مورفولوژیکی ذرات، PDI، EE و LC آزمایش شدند.
۵ میلی‌لیتر از نانوذرات بازسازی‌شده را در ۴۵ میلی‌لیتر حاوی مایع شبیه‌سازی‌شده معده (pH 1.2، حاوی ۱٪ پپسین)، مایع روده (pH 6.8، حاوی ۱٪ تریپسین) یا محلول کیموتریپسین (۱۰۰ گرم در میلی‌لیتر، در بافر فسفات، pH 7.8) حل کنید تا اثربخشی انسولین در محافظت از نانوذرات پس از آبگیری ارزیابی شود. نانوذرات در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد با سرعت همزن ۱۰۰ دور در دقیقه انکوبه شدند. ۵۰۰ میکرولیتر از محلول در زمان‌های مختلف جمع‌آوری و غلظت انسولین با HPLC تعیین شد.
رفتار آزادسازی درون‌کشتگاهی نانوذرات انسولین تازه تهیه‌شده و آبگیری‌شده با روش کیسه دیالیز (وزن مولکولی حد آستانه ۱۰۰ کیلودالتون، Spectra Por Inc.) آزمایش شد. نانوذرات خشک تازه تهیه‌شده و بازسازی‌شده به ترتیب در مایعات با pH 2.5، pH 6.6 و pH 7.0 (0.1 M فسفات بافر نمکی، PBS) دیالیز شدند تا محیط pH معده، دوازدهه و قسمت فوقانی روده کوچک شبیه‌سازی شود. همه نمونه‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد با تکان دادن مداوم با سرعت ۲۰۰ دور در دقیقه انکوبه شدند. مایع را در زمان‌های زیر از کیسه دیالیز ۵ میلی‌لیتری خارج کنید: ۰.۵، ۱، ۲، ۳، ۴ و ۶ ساعت، و بلافاصله حجم آن را با محلول دیالیز تازه پر کنید. آلودگی انسولین در مایع با HPLC تجزیه و تحلیل شد و میزان آزادسازی انسولین از نانوذرات از نسبت انسولین آزاد آزاد شده به کل انسولین محصور شده در نانوذرات محاسبه شد (معادله ۳).
سلول‌های HepG2 رده سلولی کارسینوم هپاتوسلولار انسانی در ظروف با قطر 60 میلی‌متر با استفاده از محیط کشت اصلاح‌شده عقاب دولبکو (DMEM) حاوی 10٪ سرم جنین گاوی، 100 واحد بین‌المللی در میلی‌لیتر پنی‌سیلین و 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین29 کشت داده شدند. کشت‌ها در دمای 37 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 95٪ و 5٪ CO2 نگهداری شدند. برای سنجش جذب، سلول‌های HepG2 با تراکم 1 × 105 سلول در میلی‌لیتر بر روی سیستم اسلاید محفظه‌ای 8 چاهکی Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) کشت داده شدند. برای سنجش سمیت سلولی، آنها با تراکم 5 × 104 سلول در میلی‌لیتر در صفحات 96 چاهکی (Corning، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) کشت داده شدند.
از روش MTT برای ارزیابی سمیت سلولی نانوذرات انسولین تازه تهیه شده و دهیدراته شده استفاده شد. سلول‌های HepG2 در پلیت‌های 96 خانه‌ای با تراکم 5 × 104 سلول در میلی‌لیتر کشت داده شدند و به مدت 7 روز قبل از آزمایش کشت داده شدند. نانوذرات انسولین در محیط کشت تا غلظت‌های مختلف (50 تا 500 میکروگرم در میلی‌لیتر) رقیق شده و سپس به سلول‌ها تزریق شدند. پس از 24 ساعت انکوباسیون، سلول‌ها 3 بار با PBS شسته شده و به مدت 4 ساعت دیگر با محیط حاوی 0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر MTT انکوبه شدند. سمیت سلولی با اندازه‌گیری کاهش آنزیمی تترازولیوم زرد MTT به فورمازان بنفش در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر Tecan infinite M200 pro (Tecan، Männedorf، سوئیس) ارزیابی شد.
راندمان جذب سلولی نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال و آنالیز فلوسیتومتری مورد آزمایش قرار گرفت. هر چاهک از سیستم اسلاید محفظه Nunc Lab-Tek با FITC-انسولین آزاد، نانوذرات بارگذاری شده با FITC-انسولین و 25 میکروگرم در میلی‌لیتر نانوذرات FITC-انسولین دهیدراته شده با غلظت مشابه تیمار شد و به مدت 4 ساعت انکوبه شد. سلول‌ها 3 بار با PBS شسته و با 4٪ پارافرمالدهید تثبیت شدند. هسته‌ها با 4'،6-دی‌آمیدینو-2-فنیل‌ایندول (DAPI) رنگ‌آمیزی شدند. محلی‌سازی انسولین با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال دو فوتونی/اسکن لیزری Olympus FV1000 (الیمپوس، شهر شینجوکو، توکیو، ژاپن) مشاهده شد. برای آنالیز فلوسیتومتری، غلظت‌های مشابه 10 میکروگرم در میلی‌لیتر FITC-انسولین آزاد، نانوذرات بارگذاری شده با FITC-انسولین و محلول‌سازی مجدد نانوذرات FITC-انسولین دهیدراته شده به پلیت‌های ۹۶ خانه‌ای حاوی سلول‌های HepG2 اضافه و به مدت ۴ ساعت انکوبه شدند. پس از ۴ ساعت انکوباسیون، سلول‌ها برداشته شده و ۳ بار با FBS شسته شدند. ۵ × ۱۰۴ سلول در هر نمونه توسط دستگاه فلوسایتومتر BD LSR II (BD، Franklin Lakes، نیوجرسی، ایالات متحده) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
تمام مقادیر به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده‌اند. مقایسه بین همه گروه‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه یا آزمون t توسط IBM SPSS Statistics 26 برای مک (IBM، Endicott، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) ارزیابی شد و p < 0.05 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.
این مطالعه انعطاف‌پذیری و توانایی خشک کردن پاششی را برای آبگیری نانوذرات کیتوزان/TPP/انسولین با پیوندهای متقاطع نشان می‌دهد که در مقایسه با روش‌های استاندارد خشک کردن انجمادی با استفاده از عوامل حجم‌دهنده یا محافظ‌های انجمادی و ظرفیت بار بالاتر، بازسازی بهتری دارد. نانوذرات انسولین بهینه‌شده، اندازه ذرات متوسط ​​318 نانومتر و راندمان کپسوله‌سازی 99.4٪ را نشان دادند. نتایج SEM و FTIR پس از آبگیری نشان داد که ساختار کروی فقط در نانوذرات خشک شده با اسپری و بدون مانیتول و لیوفیلیزه شده با مانیتول حفظ می‌شود، اما نانوذرات لیوفیلیزه شده بدون مانیتول در طول آبگیری تجزیه می‌شوند. در آزمایش توانایی بازسازی، نانوذرات انسولین خشک شده با اسپری و بدون مانیتول، کوچکترین اندازه متوسط ​​ذرات و بالاترین بارگذاری را پس از بازسازی نشان دادند. رفتارهای آزادسازی همه این نانوذرات آبگیری شده نشان داد که آنها به سرعت در محلول‌های pH = 2.5 و pH = 7 آزاد می‌شوند و در محلول pH = 6.5 بسیار پایدار هستند. در مقایسه با سایر نانوذرات آبگیری شده دوباره حل شده، نانوذرات خشک‌شده با اسپری بدون مانیتول، سریع‌ترین آزادسازی را نشان دادند. این نتیجه با نتایج مشاهده‌شده در سنجش جذب سلولی مطابقت دارد، زیرا نانوذرات خشک‌شده با اسپری در غیاب مانیتول تقریباً به‌طور کامل راندمان جذب سلولی نانوذرات تازه تهیه‌شده را حفظ کردند. این نتایج نشان می‌دهد که نانوذرات خشک انسولین تهیه‌شده با اسپری خشک بدون مانیتول، برای پردازش بیشتر به سایر اشکال دارویی بی‌آب، مانند قرص‌های خوراکی یا فیلم‌های زیست‌چسب، مناسب‌ترین هستند.
با توجه به مسائل مربوط به مالکیت معنوی، مجموعه داده‌های تولید شده و/یا تحلیل شده در طول مطالعه حاضر در دسترس عموم نیستند، اما بنا به درخواست معقول، از نویسندگان مربوطه در دسترس هستند.
کاگان، آ. دیابت نوع ۲: ریشه‌های اجتماعی و علمی، عوارض پزشکی و پیامدهای آن برای بیماران و دیگران. (مک‌فارلین، ۲۰۰۹).
سینگ، ای. پی.، گوئو، وای.، سینگ، ای.، شیه، دبلیو. و جیانگ، پی. توسعه کپسوله‌سازی انسولین: آیا مصرف خوراکی اکنون امکان‌پذیر است؟ مجله داروسازی.بیوفارماسی.مخزن.1، 74–92 (2019).
وانگ، سی. وای، السالمی، اچ. و داس، سی. آر. پیشرفت‌های اخیر در سیستم‌های دارورسانی لیپوزوم حاوی انسولین خوراکی برای درمان دیابت. تفسیر. مجله داروسازی. 549، 201–217 (2018).