این مقاله بخشی از موضوع تحقیقاتی «بهبود مقاومت حبوبات در برابر عوامل بیماری‌زا و آفات» است، مشاهده هر 5 مقاله
عامل بیماری قارچی نکروز گیاهی Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary از یک استراتژی چند مرحله‌ای برای آلوده کردن گیاهان میزبان مختلف استفاده می‌کند. این مطالعه استفاده از دی‌آمین L-اورنیتین، یک اسید آمینه غیرپروتئینی که سنتز سایر اسیدهای آمینه ضروری را تحریک می‌کند، را به عنوان یک استراتژی مدیریتی جایگزین برای افزایش پاسخ‌های مولکولی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی Phaseolus vulgaris L. به کپک سفید ناشی از Pseudomonas sclerotiorum پیشنهاد می‌کند. آزمایش‌های آزمایشگاهی نشان داد که L-اورنیتین به طور قابل توجهی رشد میسلیومی S. pyrenoidosa را به صورت وابسته به دوز مهار می‌کند. علاوه بر این، می‌تواند شدت کپک سفید را در شرایط گلخانه به طور قابل توجهی کاهش دهد. علاوه بر این، L-اورنیتین رشد گیاهان تیمار شده را تحریک کرد، که نشان می‌دهد غلظت‌های آزمایش شده L-اورنیتین برای گیاهان تیمار شده فیتوتوکسیک نبودند. علاوه بر این، ال-اورنیتین بیان آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی (فنول‌ها و فلاونوئیدهای محلول کل) و آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی (کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POX) و پلی‌فنول اکسیداز (PPO)) را افزایش داد و بیان سه ژن مرتبط با آنتی‌اکسیدان (PvCAT1، PvSOD و PvGR) را افزایش داد. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل in silico وجود یک پروتئین اگزالواستات استیل هیدرولاز (SsOAH) احتمالی را در ژنوم S. sclerotiorum نشان داد که از نظر تجزیه و تحلیل عملکردی، دامنه‌های حفاظت شده و توپولوژی بسیار شبیه به پروتئین‌های اگزالواستات استیل هیدرولاز (SsOAH) آسپرژیلوس فیجیانسیس (AfOAH) و پنیسیلیوم گونه (PlOAH) بود. جالب توجه است که افزودن ال-اورنیتین به محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز براث (PDB) به طور قابل توجهی بیان ژن SsOAH را در میسلیوم S. sclerotiorum کاهش داد. به طور مشابه، کاربرد خارجی ال-اورنیتین به طور قابل توجهی بیان ژن SsOAH را در میسلیوم‌های قارچی جمع‌آوری‌شده از گیاهان تیمار شده کاهش داد. در نهایت، کاربرد ال-اورنیتین به طور قابل توجهی ترشح اسید اگزالیک را در هر دو محیط کشت PDB و برگ‌های آلوده کاهش داد. در نتیجه، ال-اورنیتین نقش کلیدی در حفظ وضعیت اکسایش-کاهش و همچنین افزایش پاسخ دفاعی گیاهان آلوده ایفا می‌کند. نتایج این مطالعه ممکن است به توسعه روش‌های نوآورانه و سازگار با محیط زیست برای کنترل کپک سفید و کاهش تأثیر آن بر تولید لوبیا و سایر محصولات کشاورزی کمک کند.
کپک سفید، که توسط قارچ نکروتروف Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ایجاد می‌شود، یک بیماری مخرب و کاهش‌دهنده عملکرد است که تهدیدی جدی برای تولید جهانی لوبیا (Phaseolus vulgaris L.) محسوب می‌شود (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum یکی از دشوارترین عوامل بیماری‌زای گیاهی قارچی خاک‌زاد برای کنترل است که طیف وسیعی از میزبان‌ها شامل بیش از 600 گونه گیاهی و توانایی له کردن سریع بافت‌های میزبان را به روشی غیر اختصاصی دارد (Liang and Rollins, 2018). در شرایط نامساعد، این قارچ یک مرحله بحرانی از چرخه زندگی خود را طی می‌کند و برای مدت طولانی به صورت ساختارهای سیاه، سخت و دانه‌مانند به نام «اسکلروتیا» در خاک یا به صورت رشدهای سفید و کرکی در میسلیوم یا مغز ساقه گیاهان آلوده، خفته باقی می‌ماند (Schwartz et al., 2005). قارچ S. sclerotiorum قادر به تشکیل اسکلروت است که به آن اجازه می‌دهد برای مدت طولانی در مزارع آلوده زنده بماند و در طول بیماری دوام بیاورد (Schwartz et al., 2005). اسکلروت‌ها غنی از مواد مغذی هستند، می‌توانند برای مدت طولانی در خاک باقی بمانند و به عنوان مایه تلقیح اولیه برای عفونت‌های بعدی عمل کنند (Schwartz et al., 2005). در شرایط مساعد، اسکلروت‌ها جوانه می‌زنند و اسپورهای هوابرد تولید می‌کنند که می‌توانند تمام قسمت‌های بالای زمین گیاه، از جمله گل‌ها، ساقه‌ها یا غلاف‌ها را آلوده کنند (Schwartz et al., 2005).
قارچ Sclerotinia sclerotiorum از یک استراتژی چند مرحله‌ای برای آلوده کردن گیاهان میزبان خود استفاده می‌کند که شامل مجموعه‌ای از رویدادهای هماهنگ از جوانه‌زنی اسکلروتیوم تا بروز علائم است. در ابتدا، S. sclerotiorum هاگ‌های معلق (به نام آسکوسپور) را از ساختارهای قارچ‌مانند به نام آپوتسیوم تولید می‌کند که در هوا پخش می‌شوند و روی بقایای گیاهی آلوده به اسکلروتیوم‌های غیرمتحرک تبدیل می‌شوند (Bolton et al., 2006). سپس قارچ اسید اگزالیک، یک عامل بیماری‌زایی، را ترشح می‌کند تا pH دیواره سلولی گیاه را کنترل کند، تخریب آنزیمی و تهاجم بافتی را افزایش دهد (Hegedus and Rimmer, 2005) و انفجار اکسیداتیو گیاه میزبان را سرکوب کند. این فرآیند اسیدی شدن، دیواره سلولی گیاه را تضعیف می‌کند و محیط مناسبی را برای عملکرد طبیعی و کارآمد آنزیم‌های تجزیه‌کننده دیواره سلولی قارچی (CWDEs) فراهم می‌کند و به پاتوژن اجازه می‌دهد تا بر سد فیزیکی غلبه کرده و به بافت‌های میزبان نفوذ کند (Marciano et al., 1983). پس از نفوذ، S. sclerotiorum تعدادی از CWDEها، مانند پلی‌گالاکتوروناز و سلولاز، ترشح می‌کند که انتشار آن را در بافت‌های آلوده تسهیل کرده و باعث نکروز بافت می‌شود. پیشرفت ضایعات و تشکیل هیف‌ها منجر به علائم مشخصه کپک سفید می‌شود (Hegedus and Rimmer, 2005). در همین حال، گیاهان میزبان الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPs) را از طریق گیرنده‌های تشخیص الگو (PRRs) تشخیص می‌دهند و مجموعه‌ای از رویدادهای سیگنالینگ را آغاز می‌کنند که در نهایت پاسخ‌های دفاعی را فعال می‌کنند.
علیرغم دهه‌ها تلاش برای کنترل بیماری، کمبود ژرم‌پلاسم مقاوم کافی در لوبیا، مانند سایر محصولات تجاری، به دلیل مقاومت، بقا و سازگاری پاتوژن همچنان وجود دارد. بنابراین، مدیریت بیماری بسیار چالش برانگیز است و نیاز به یک استراتژی یکپارچه و چندوجهی دارد که شامل ترکیبی از شیوه‌های زراعی، کنترل بیولوژیکی و قارچ‌کش‌های شیمیایی است (O'Sullivan و همکاران، 2021). کنترل شیمیایی کپک سفید موثرترین روش است زیرا قارچ‌کش‌ها، در صورت استفاده صحیح و در زمان مناسب، می‌توانند به طور مؤثر شیوع بیماری را کنترل کنند، شدت عفونت را کاهش دهند و تلفات محصول را به حداقل برسانند. با این حال، استفاده بیش از حد و اتکای بیش از حد به قارچ‌کش‌ها می‌تواند منجر به ظهور گونه‌های مقاوم S. sclerotiorum شود و بر موجودات غیرهدف، سلامت خاک و کیفیت آب تأثیر منفی بگذارد (Le Cointe و همکاران، 2016؛ Ceresini و همکاران، 2024). بنابراین، یافتن جایگزین‌های سازگار با محیط زیست به اولویت اصلی تبدیل شده است.
پلی‌آمین‌ها (PAها)، مانند پوترسین، اسپرمیدین، اسپرمین و کاداورین، می‌توانند به عنوان جایگزین‌های امیدوارکننده‌ای در برابر عوامل بیماری‌زای گیاهی خاک‌زاد عمل کنند و از این طریق استفاده از قارچ‌کش‌های شیمیایی خطرناک را به طور کامل یا جزئی کاهش دهند (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). در گیاهان عالی، PAها در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی از جمله تقسیم سلولی، تمایز و پاسخ به تنش‌های غیرزیستی و زیستی نقش دارند (Killiny and Nehela, 2020). آنها می‌توانند به عنوان آنتی‌اکسیدان عمل کنند، به جمع‌آوری گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) کمک کنند، هموستاز ردوکس را حفظ کنند (Nehela and Killiny, 2023)، ژن‌های مرتبط با دفاع را القا کنند (Romero et al., 2018)، مسیرهای متابولیکی مختلف را تنظیم کنند (Nehela and Killiny, 2023)، فیتوهورمون‌های درون‌زا را تعدیل کنند (Nehela and Killiny, 2019)، مقاومت اکتسابی سیستمیک (SAR) ایجاد کنند و تعاملات گیاه-پاتوژن را تنظیم کنند (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). شایان ذکر است که مکانیسم‌ها و نقش‌های خاص PAها در دفاع گیاه بسته به گونه‌های گیاهی، پاتوژن‌ها و شرایط محیطی متفاوت است. فراوان‌ترین PA در گیاهان از پلی‌آمین ضروری L-اورنیتین بیوسنتز می‌شود (Killiny and Nehela, 2020).
ال-اورنیتین نقش‌های متعددی در رشد و نمو گیاه ایفا می‌کند. به عنوان مثال، مطالعات قبلی نشان داده‌اند که در برنج (Oryza sativa)، اورنیتین ممکن است با بازیافت نیتروژن (Liu و همکاران، ۲۰۱۸)، عملکرد، کیفیت و عطر برنج (Lu و همکاران، ۲۰۲۰) و پاسخ به تنش آبی (Yang و همکاران، ۲۰۰۰) مرتبط باشد. علاوه بر این، کاربرد خارجی ال-اورنیتین به طور قابل توجهی تحمل به خشکی را در چغندر قند (Beta vulgaris) (Hussin و همکاران، ۲۰۱۹) افزایش داده و تنش شوری را در گیاهان پیاز (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu و Çavuşoǧlu، ۲۰۲۱) و بادام هندی (Anacardium occidentale) کاهش داده است (da Rocha و همکاران، ۲۰۱۲). نقش بالقوه ال-اورنیتین در دفاع از تنش‌های غیرزیستی ممکن است به دلیل دخالت آن در تجمع پرولین در گیاهان تیمار شده باشد. برای مثال، پیش از این گزارش شده بود که ژن‌های مرتبط با متابولیسم پرولین، مانند ژن‌های اورنیتین دلتا آمینوترانسفراز (delta-OAT) و پرولین دهیدروژناز (ProDH1 و ProDH2)، در دفاع از نیکوتیانا بنتامیانا و آرابیدوپسیس تالیانا در برابر سویه‌های غیرمیزبانی سودوموناس سیرینگه نقش دارند (Senthil-Kumar and Mysore, 2012). از سوی دیگر، اورنیتین دکربوکسیلاز قارچی (ODC) برای رشد پاتوژن مورد نیاز است (Singh et al., 2020). هدف قرار دادن ODC قارچ Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici از طریق خاموش کردن ژن القا شده توسط میزبان (HIGS) به طور قابل توجهی مقاومت گیاهان گوجه فرنگی را در برابر پژمردگی فوزاریومی افزایش داد (Singh et al., 2020). با این حال، نقش بالقوه کاربرد اورنیتین خارجی در برابر تنش‌های زیستی مانند پاتوژن‌های گیاهی به خوبی مورد مطالعه قرار نگرفته است. مهمتر از همه، اثرات اورنیتین بر مقاومت در برابر بیماری و پدیده‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی مرتبط با آن تا حد زیادی ناشناخته مانده است.
درک پیچیدگی آلودگی حبوبات به قارچ S. sclerotiorum برای توسعه استراتژی‌های کنترل مؤثر مهم است. در این مطالعه، هدف ما شناسایی نقش بالقوه دی‌آمین ال-اورنیتین به عنوان یک عامل کلیدی در افزایش مکانیسم‌های دفاعی و مقاومت گیاهان حبوبات در برابر عفونت Sclerotinia sclerotiorum بود. ما فرض می‌کنیم که ال-اورنیتین علاوه بر افزایش پاسخ‌های دفاعی گیاهان آلوده، نقش کلیدی در حفظ وضعیت اکسایش-کاهش نیز ایفا می‌کند. ما پیشنهاد می‌کنیم که اثرات بالقوه ال-اورنیتین مربوط به تنظیم مکانیسم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی و تداخل با عوامل بیماری‌زایی/حدت قارچی و پروتئین‌های مرتبط است. این عملکرد دوگانه ال-اورنیتین، آن را به یک کاندیدای امیدوارکننده برای یک استراتژی پایدار برای کاهش تأثیر کپک سفید و افزایش مقاومت محصولات حبوبات رایج در برابر این پاتوژن قارچی قوی تبدیل می‌کند. نتایج مطالعه حاضر ممکن است به توسعه روش‌های نوآورانه و سازگار با محیط زیست برای کنترل کپک سفید و کاهش تأثیر آن بر تولید حبوبات کمک کند.
در این مطالعه، از یک گونه تجاری حساس لوبیا معمولی، جیزه ۳ (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3)، به عنوان ماده آزمایشی استفاده شد. بذرهای سالم با لطف از بخش تحقیقات حبوبات، موسسه تحقیقات محصولات زراعی (FCRI)، مرکز تحقیقات کشاورزی (ARC)، مصر تهیه شدند. پنج بذر در گلدان‌های پلاستیکی (با قطر داخلی ۳۵ سانتی‌متر، عمق ۵۰ سانتی‌متر) پر از خاک آلوده به S. sclerotiorum در شرایط گلخانه‌ای (دمای ۲۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی ۷۵ ± ۱٪، ۸ ساعت روشنایی/۱۶ ساعت تاریکی) کاشته شدند. ۷ تا ۱۰ روز پس از کاشت (DPS)، نهال‌ها تنک شدند تا فقط دو نهال با رشد یکنواخت و سه برگ کاملاً توسعه‌یافته در هر گلدان باقی بماند. همه گیاهان گلدانی هر دو هفته یک بار آبیاری و ماهانه با میزان توصیه شده برای گونه مورد نظر کوددهی شدند.
برای تهیه غلظت ۵۰۰ میلی‌گرم در لیتر از L-اورنیتین‌دی‌آمین (همچنین با نام (+)-(S)-2،۵-دی‌آمینوپنتانویک اسید شناخته می‌شود؛ سیگما-آلدریچ، دارمشتات، آلمان)، ابتدا ۵۰ میلی‌گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر استریل حل شد. سپس محلول ذخیره رقیق شده و در آزمایش‌های بعدی استفاده شد. به طور خلاصه، شش سری از غلظت‌های L-اورنیتین (۱۲.۵، ۲۵، ۵۰، ۷۵، ۱۰۰ و ۱۲۵ میلی‌گرم در لیتر) در شرایط آزمایشگاهی آزمایش شدند. علاوه بر این، از آب مقطر استریل به عنوان کنترل منفی (Mock) و از قارچ‌کش تجاری «Rizolex-T» ۵۰٪ پودر قابل خیس شدن (toclofos-methyl 20٪ + thiram 30٪؛ KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company، Kafr El Zayat، استان غربیه، مصر) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. قارچ‌کش تجاری «Rizolex-T» در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) در پنج غلظت (2، 4، 6، 8 و 10 میلی‌گرم در لیتر) آزمایش شد.
نمونه‌هایی از ساقه‌ها و غلاف‌های لوبیا معمولی که علائم معمول کپک سفید را نشان می‌دادند (میزان آلودگی: 10 تا 30 درصد) از مزارع تجاری جمع‌آوری شدند. اگرچه بیشتر مواد گیاهی آلوده بر اساس گونه/رقم (رقم تجاری حساس Giza 3) شناسایی شدند، اما برخی دیگر، به ویژه آنهایی که از بازارهای محلی تهیه شده بودند، از گونه‌های ناشناخته بودند. مواد آلوده جمع‌آوری‌شده ابتدا به مدت 3 دقیقه با محلول هیپوکلریت سدیم 0.5٪ ضدعفونی سطحی شدند، سپس چندین بار با آب مقطر استریل شسته و با کاغذ صافی استریل خشک شدند تا آب اضافی آنها گرفته شود. سپس اندام‌های آلوده از بافت میانی (بین بافت‌های سالم و آلوده) به قطعات کوچک بریده شدند، روی محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز آگار (PDA) کشت داده شدند و به مدت 5 روز در دمای 25 ± 2 درجه سانتیگراد با چرخه 12 ساعت روشنایی/12 ساعت تاریکی انکوبه شدند تا تشکیل اسکلروت تحریک شود. روش نوک میسلیومی نیز برای خالص‌سازی جدایه‌های قارچی از کشت‌های مخلوط یا آلوده استفاده شد. جدایه قارچی خالص‌سازی شده ابتدا بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی کشت آن شناسایی شد و سپس بر اساس ویژگی‌های میکروسکوپی، S. sclerotiorum بودن آن تأیید شد. در نهایت، تمام جدایه‌های خالص‌سازی شده برای بررسی بیماری‌زایی روی رقم حساس لوبیا Giza 3 مورد آزمایش قرار گرفتند تا با اصول کخ مطابقت داشته باشند.
علاوه بر این، تهاجمی‌ترین جدایه S. sclerotiorum (جدا شده شماره ۳) بر اساس توالی‌یابی فاصله‌دهنده رونویسی داخلی (ITS) همانطور که توسط White و همکاران، ۱۹۹۰؛ Baturo-Ciesniewska و همکاران، ۲۰۱۷ شرح داده شده است، بیشتر تأیید شد. به طور خلاصه، جدایه‌ها در محیط کشت دکستروز سیب‌زمینی (PDB) کشت داده شدند و به مدت ۵ تا ۷ روز در دمای ۲۵ ± ۲ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس میسلیوم قارچی جمع‌آوری، از طریق پارچه توری فیلتر شد، دو بار با آب استریل شسته و با کاغذ صافی استریل خشک شد. DNA ژنومی با استفاده از کیت Miniprep قارچی/باکتریایی Quick-DNA™ (Kuramae-Izioka، ۱۹۹۷؛ Atallah و همکاران، ۲۰۲۲، ۲۰۲۴) جدا شد. سپس ناحیه rDNA مربوط به ITS با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC؛ اندازه مورد انتظار: 540 جفت باز) (Baturo-Ciesniewska و همکاران، 2017) تکثیر شد. محصولات PCR خالص‌سازی شده برای تعیین توالی ارسال شدند (شرکت بیوتکنولوژی پکن آوکه دینگشنگ، با مسئولیت محدود). توالی‌های rDNA مربوط به ITS با استفاده از روش تعیین توالی سنگر به صورت دو طرفه تعیین توالی شدند. سپس توالی‌های کوئری جمع‌آوری‌شده با آخرین داده‌های موجود در GenBank و مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) با استفاده از نرم‌افزار BLASTn مقایسه شدند. توالی مورد جستجو با 20 سویه/جدوله دیگر S. sclerotiorum که از آخرین داده‌های NCBI GenBank (جدول تکمیلی S1) بازیابی شده بودند، با استفاده از ClustalW در بسته تحلیل ژنتیک تکاملی مولکولی (MEGA-11؛ نسخه 11) مقایسه شد (Kumar و همکاران، 2024). تجزیه و تحلیل تکاملی با استفاده از روش حداکثر درستنمایی و مدل جایگزینی نوکلئوتید برگشت‌پذیر زمانی عمومی (Nei و Kumar، 2000) انجام شد. درخت با بالاترین احتمال لگاریتمی نشان داده شده است. درخت اولیه برای جستجوی اکتشافی با انتخاب درختی با احتمال لگاریتمی بالاتر بین درخت اتصال همسایه (NJ) (Kumar و همکاران، 2024) و درخت حداکثر پارسیمونی (MP) انتخاب می‌شود. درخت NJ با استفاده از یک ماتریس فاصله جفتی محاسبه شده با استفاده از مدل برگشت‌پذیر زمانی عمومی (Nei و Kumar، 2000) ساخته شد.
فعالیت ضد باکتریایی ال-اورنیتین و باکتری‌کش «ریزولکس-تی» به صورت آزمایشگاهی (in vitro) با روش انتشار در آگار تعیین شد. روش: مقدار مناسبی از محلول ذخیره ال-اورنیتین (500 میلی‌گرم در لیتر) را برداشته و آن را کاملاً با 10 میلی‌لیتر محیط کشت PDA مخلوط کنید تا محلول‌هایی با غلظت‌های نهایی به ترتیب 12.5، 25، 50، 75، 100 و 125 میلی‌گرم در لیتر تهیه شود. پنج غلظت قارچ‌کش «ریزولکس-تی» (2، 4، 6، 8 و 10 میلی‌گرم در لیتر) و آب مقطر استریل به عنوان شاهد استفاده شد. پس از جامد شدن محیط کشت، یک توده میسلیومی تازه تهیه شده از کشت قارچ Sclerotinia sclerotiorum به قطر 4 میلی‌متر به مرکز پتری منتقل و در دمای 25±2 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد تا میسلیوم کل پتری شاهد را بپوشاند، پس از آن رشد قارچ ثبت شد. درصد بازدارندگی رشد شعاعی S. sclerotiorum را با استفاده از معادله 1 محاسبه کنید:
این آزمایش دو بار تکرار شد، با شش تکرار بیولوژیکی برای هر گروه کنترل/آزمایش و پنج گلدان (دو گیاه در هر گلدان) برای هر تکرار بیولوژیکی. هر تکرار بیولوژیکی دو بار (دو تکرار فنی) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت تا از دقت، قابلیت اطمینان و تکرارپذیری نتایج آزمایش اطمینان حاصل شود. علاوه بر این، از تجزیه و تحلیل رگرسیون پروبیت برای محاسبه غلظت بازدارنده نیمه حداکثر (IC50) و IC99 استفاده شد (Prentice, 1976).
برای ارزیابی پتانسیل ال-اورنیتین در شرایط گلخانه، دو آزمایش گلدانی متوالی انجام شد. به طور خلاصه، گلدان‌ها با خاک رس-ماسه استریل شده (3:1) پر شدند و با کشت تازه تهیه شده S. sclerotiorum تلقیح شدند. ابتدا، تهاجمی‌ترین جدایه S. sclerotiorum (جدا شده شماره 3) با برش یک اسکلروتیوم به دو نیم، قرار دادن آن به صورت رو به پایین روی PDA و انکوبه کردن آن در دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی مداوم (24 ساعت) به مدت 4 روز برای تحریک رشد میسلیومی کشت داده شد. سپس چهار شاخه آگار به قطر 5 میلی‌متر از لبه جلویی گرفته شده و با 100 گرم مخلوط استریل سبوس گندم و برنج (1:1، حجمی/حجمی) تلقیح شدند و همه فلاسک‌ها به مدت 5 روز در دمای 25 ± 2 درجه سانتیگراد تحت چرخه 12 ساعت روشنایی/12 ساعت تاریکی انکوبه شدند تا تشکیل اسکلروتیوم تحریک شود. محتویات تمام ارلن‌ها قبل از اضافه کردن خاک کاملاً مخلوط شدند تا از همگنی آنها اطمینان حاصل شود. سپس، ۱۰۰ گرم از مخلوط سبوس کلونیزه کننده به هر گلدان اضافه شد تا غلظت ثابتی از عوامل بیماری‌زا حفظ شود. گلدان‌های تلقیح شده برای فعال شدن رشد قارچ آبیاری شدند و به مدت ۷ روز در شرایط گلخانه قرار گرفتند.
سپس پنج بذر از گونه Giza 3 در هر گلدان کاشته شد. برای گلدان‌های تیمار شده با L-ornithine و قارچ‌کش Rizolex-T، بذرهای استریل شده ابتدا به مدت دو ساعت در محلول آبی این دو ترکیب با غلظت نهایی IC99 به ترتیب حدود ۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر و ۵۰ میلی‌گرم در لیتر خیسانده شدند و سپس قبل از کاشت به مدت یک ساعت در هوا خشک شدند. از سوی دیگر، بذرها به عنوان کنترل منفی در آب مقطر استریل خیسانده شدند. پس از ۱۰ روز، قبل از اولین آبیاری، نهال‌ها تنک شدند و فقط دو نهال مرتب در هر گلدان باقی ماند. علاوه بر این، برای اطمینان از آلودگی به S. sclerotiorum، ساقه‌های گیاه لوبیا در همان مرحله رشدی (۱۰ روزه) با استفاده از یک چاقوی جراحی استریل شده در دو محل مختلف بریده شدند و تقریباً ۰.۵ گرم از مخلوط سبوس کلونیزه کننده در هر زخم قرار داده شد و پس از آن رطوبت بالا برای تحریک عفونت و توسعه بیماری در تمام گیاهان تلقیح شده اعمال شد. گیاهان کنترل نیز به طور مشابه زخمی شدند و مقدار مساوی (0.5 گرم) از مخلوط سبوس استریل و بدون کلونیزاسیون در محل زخم قرار داده شد و تحت رطوبت بالا نگهداری شد تا محیط برای توسعه بیماری شبیه‌سازی شود و از ثبات بین گروه‌های درمانی اطمینان حاصل شود.
روش تیمار: نهال‌های لوبیا با ۵۰۰ میلی‌لیتر محلول آبی ال-اورنیتین (۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر) یا قارچ‌کش ریزولکس-تی (۵۰ میلی‌گرم در لیتر) آبیاری شدند و خاک آبیاری شد، سپس تیمار سه بار با فاصله ۱۰ روز تکرار شد. نمونه‌های کنترل تیمار شده با دارونما با ۵۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر استریل آبیاری شدند. تمام تیمارها در شرایط گلخانه (دمای ۲۵ ± ۲ درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی ۷۵ ± ۱٪ و دوره نوری ۸ ساعت روشنایی/۱۶ ساعت تاریکی) انجام شد. تمام گلدان‌ها هر دو هفته یکبار آبیاری و ماهانه با کود NPK متعادل (۲۰-۲۰-۲۰، با ۳.۶٪ گوگرد و عناصر ریزمغذی TE؛ زین سیدز، مصر) با غلظت ۳-۴ گرم در لیتر از طریق محلول‌پاشی برگی طبق توصیه‌های مربوط به گونه خاص و دستورالعمل‌های سازنده تیمار شدند. مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد، برگ‌های بالغ کاملاً توسعه‌یافته (برگ‌های دوم و سوم از بالا) از هر تکرار بیولوژیکی در ۷۲ ساعت پس از تیمار (hpt) جمع‌آوری، همگن‌سازی، جمع‌آوری و در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد برای تجزیه و تحلیل‌های بیشتر از جمله، اما نه محدود به، تعیین محل هیستوشیمیایی درجا شاخص‌های استرس اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپید، آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیرآنزیمی و بیان ژن ذخیره شدند.
شدت آلودگی کپک سفید به صورت هفتگی، ۲۱ روز پس از مایه‌زنی (dpi) با استفاده از مقیاس ۱ تا ۹ (جدول تکمیلی S2) بر اساس مقیاس پتزولدت و دیکسون (۱۹۹۶) که توسط تران و همکاران (۲۰۰۶) اصلاح شده بود، ارزیابی شد. به طور خلاصه، ساقه‌ها و شاخه‌های گیاهان لوبیا از نقطه مایه‌زنی برای دنبال کردن پیشرفت ضایعات در امتداد میانگره‌ها و گره‌ها بررسی شدند. سپس فاصله ضایعه از نقطه مایه‌زنی تا دورترین نقطه در امتداد ساقه یا شاخه اندازه‌گیری شد و بر اساس محل ضایعه، امتیاز ۱ تا ۹ اختصاص داده شد، که در آن (۱) نشان‌دهنده عدم وجود آلودگی قابل مشاهده در نزدیکی نقطه مایه‌زنی و (۲ تا ۹) نشان‌دهنده افزایش تدریجی اندازه و پیشرفت ضایعات در امتداد گره‌ها/میانگره‌ها بود (جدول تکمیلی S2). سپس شدت آلودگی کپک سفید با استفاده از فرمول ۲ به درصد تبدیل شد:
علاوه بر این، سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) با استفاده از فرمول (Shaner and Finney, 1977) محاسبه شد که اخیراً برای پوسیدگی سفید لوبیا (Chauhan et al., 2020) با استفاده از معادله 3 تطبیق داده شده است:
که در آن Yi = شدت بیماری در زمان ti، Yi+1 = شدت بیماری در زمان بعدی ti+1، ti = زمان اولین اندازه‌گیری (به روز)، ti+1 = زمان اندازه‌گیری بعدی (به روز)، n = تعداد کل نقاط زمانی یا نقاط مشاهده. پارامترهای رشد گیاه لوبیا شامل ارتفاع گیاه (سانتی‌متر)، تعداد شاخه در هر گیاه و تعداد برگ در هر گیاه به مدت ۲۱ روز در تمام تکرارهای بیولوژیکی به صورت هفتگی ثبت شدند.
در هر تکرار بیولوژیکی، نمونه‌های برگ (دومین و سومین برگ کاملاً توسعه‌یافته از بالا) در روز 45 پس از تیمار (15 روز پس از آخرین تیمار) جمع‌آوری شدند. هر تکرار بیولوژیکی شامل پنج گلدان (دو گیاه در هر گلدان) بود. حدود 500 میلی‌گرم از بافت خرد شده برای استخراج رنگدانه‌های فتوسنتزی (کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئیدها) با استفاده از استون 80٪ در دمای 4 درجه سانتیگراد در تاریکی استفاده شد. پس از 24 ساعت، نمونه‌ها سانتریفیوژ شدند و محلول رویی برای تعیین محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید به روش رنگ‌سنجی با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160A (شرکت Shimadzu، ژاپن) طبق روش (Lichtenthaler، 1987) با اندازه‌گیری جذب در سه طول موج مختلف (A470، A646 و A663 نانومتر) جمع‌آوری شد. در نهایت، محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی با استفاده از فرمول‌های 4 تا 6 زیر که توسط لیختنتالر (1987) شرح داده شده است، محاسبه شد.
72 ساعت پس از تیمار (hpt)، برگ‌ها (دومین و سومین برگ کاملاً توسعه‌یافته از بالا) از هر تکرار بیولوژیکی برای تعیین محل هیستوشیمیایی پراکسید هیدروژن (H2O2) و آنیون سوپراکسید (O2•−) در محل جمع‌آوری شدند. هر تکرار بیولوژیکی شامل پنج گلدان (دو گیاه در هر گلدان) بود. هر تکرار بیولوژیکی به صورت تکراری (دو تکرار فنی) تجزیه و تحلیل شد تا از دقت، قابلیت اطمینان و تکرارپذیری روش اطمینان حاصل شود. H2O2 و O2•− به ترتیب با استفاده از 0.1٪ 3،3′-دی‌آمینوبنزیدین (DAB؛ سیگما-آلدریچ، دارمشتات، آلمان) یا نیتروبلو تترازولیوم (NBT؛ سیگما-آلدریچ، دارمشتات، آلمان) و با پیروی از روش‌های شرح داده شده توسط رومرو-پورتاس و همکاران (2004) و آدام و همکاران (1989) با تغییرات جزئی تعیین شدند. برای مکان‌یابی هیستوشیمیایی H2O2 در محل، برگچه‌ها با 0.1٪ DAB در بافر Tris 10 میلی‌مولار (pH 7.8) به صورت خلأ نفوذ داده شدند و سپس به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق و در معرض نور انکوبه شدند. برگچه‌ها در TCA 0.15٪ (v/v) در نسبت 4:1 (v/v) اتانول:کلروفرم (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) سفید شدند و سپس تا زمانی که تیره شوند در معرض نور قرار گرفتند. به طور مشابه، دریچه‌ها برای مکان‌یابی هیستوشیمیایی O2•− در محل، با بافر فسفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (pH 7.8) حاوی 0.1 w/v٪ HBT به صورت خلأ نفوذ داده شدند. برگچه‌ها به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق و در معرض نور انکوبه شدند، سپس مطابق روش بالا سفید شدند و سپس تا زمانی که لکه‌های آبی/بنفش تیره ظاهر شوند، روشن شدند. شدت رنگ قهوه‌ای (به عنوان شاخص H2O2) یا آبی-بنفش (به عنوان شاخص O2•−) حاصل با استفاده از نسخه فیجی بسته پردازش تصویر ImageJ (http://fiji.sc؛ دسترسی در ۷ مارس ۲۰۲۴) ارزیابی شد.
مالون دی آلدئید (MDA؛ به عنوان نشانگر پراکسیداسیون لیپید) طبق روش Du و Bramlage (1992) با اندکی تغییرات تعیین شد. برگ‌های هر تکرار بیولوژیکی (برگ‌های دوم و سوم کاملاً توسعه‌یافته از بالا) 72 ساعت پس از تیمار (hpt) جمع‌آوری شدند. هر تکرار بیولوژیکی شامل پنج گلدان (دو گیاه در هر گلدان) بود. هر تکرار بیولوژیکی به صورت تکراری (دو تکرار فنی) تجزیه و تحلیل شد تا از دقت، قابلیت اطمینان و تکرارپذیری روش اطمینان حاصل شود. به طور خلاصه، 0.5 گرم از بافت برگ آسیاب شده برای استخراج MDA با 20٪ اسید تری کلرواستیک (TCA؛ MilliporeSigma، برلینگتون، MA، ایالات متحده آمریکا) حاوی 0.01٪ هیدروکسی تولوئن بوتیله شده (BHT؛ Sigma-Aldrich، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) استفاده شد. سپس محتوای MDA در محلول رویی با اندازه‌گیری جذب در طول موج‌های 532 و 600 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160A (شرکت Shimadzu، ژاپن) به روش رنگ‌سنجی تعیین و سپس بر حسب nmol g−1 FW بیان شد.
برای ارزیابی آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی و آنزیمی، برگ‌ها (دومین و سومین برگ کاملاً توسعه‌یافته از بالا) از هر تکرار بیولوژیکی در ۷۲ ساعت پس از تیمار (hpt) جمع‌آوری شدند. هر تکرار بیولوژیکی شامل پنج گلدان (دو گیاه در هر گلدان) بود. هر نمونه بیولوژیکی به صورت تکراری (دو نمونه فنی) تجزیه و تحلیل شد. دو برگ با نیتروژن مایع آسیاب شده و مستقیماً برای تعیین آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیرآنزیمی، کل اسیدهای آمینه، محتوای پرولین، بیان ژن و تعیین مقدار اگزالات استفاده شدند.
فنول‌های محلول کل با استفاده از معرف فولین-سیوکالتیو (سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده) با اندکی تغییر در روش شرح داده شده توسط کاهونن و همکاران (1999) تعیین شدند. به طور خلاصه، تقریباً 0.1 گرم از بافت برگ همگن شده با 20 میلی‌لیتر متانول 80٪ در تاریکی به مدت 24 ساعت استخراج شد و محلول رویی پس از سانتریفیوژ جمع‌آوری شد. 0.1 میلی‌لیتر از عصاره نمونه با 0.5 میلی‌لیتر معرف فولین-سیوکالتیو (10٪) مخلوط شد، به مدت 30 ثانیه تکان داده شد و به مدت 5 دقیقه در تاریکی قرار گرفت. سپس 0.5 میلی‌لیتر محلول کربنات سدیم 20٪ (Na2CO3؛ شرکت داروسازی و لوازم پزشکی الجمهوریه، قاهره، مصر) به هر لوله اضافه شد، کاملاً مخلوط شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق و تاریکی انکوبه شد. پس از انکوباسیون، جذب مخلوط واکنش در طول موج 765 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160A (شرکت Shimadzu، ژاپن) اندازه‌گیری شد. غلظت فنل‌های محلول کل در عصاره‌های نمونه با استفاده از منحنی کالیبراسیون اسید گالیک (Fisher Scientific، Hampton، NH، ایالات متحده آمریکا) تعیین و بر حسب میلی‌گرم معادل اسید گالیک در هر گرم وزن تازه (میلی‌گرم GAE g-1 وزن تازه) بیان شد.
محتوای کل فلاونوئید محلول طبق روش Djeridane و همکاران (2006) با اندکی تغییر تعیین شد. به طور خلاصه، 0.3 میلی‌لیتر از عصاره متانولی فوق با 0.3 میلی‌لیتر محلول 5٪ کلرید آلومینیوم (AlCl3؛ Fisher Scientific، Hampton، NH، USA) مخلوط شد، به شدت هم زده شد و سپس به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد، و پس از آن 0.3 میلی‌لیتر محلول 10٪ استات پتاسیم (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies، قاهره، مصر) اضافه شد، کاملاً مخلوط شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از انکوباسیون، جذب مخلوط واکنش در طول موج 430 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160A (شرکت Shimadzu، ژاپن) اندازه‌گیری شد. غلظت کل فلاونوئیدهای محلول در عصاره‌های نمونه با استفاده از منحنی کالیبراسیون روتین (TCI America, Portland, OR, USA) تعیین و سپس به صورت میلی‌گرم معادل روتین در هر گرم وزن تازه (mg RE g-1 fresh weight) بیان شد.
محتوای کل اسید آمینه آزاد برگ‌های لوبیا با استفاده از یک معرف نینهیدرین اصلاح‌شده (Thermo Scientific Chemicals، Waltham، MA، USA) بر اساس روش پیشنهادی Yokoyama و Hiramatsu (2003) و اصلاح‌شده توسط Sun و همکاران (2006) تعیین شد. به طور خلاصه، 0.1 گرم از بافت آسیاب‌شده با بافر pH 5.4 استخراج شد و 200 میکرولیتر از محلول رویی با 200 میکرولیتر نینهیدرین (2٪) و 200 میکرولیتر پیریدین (10٪؛ Spectrum Chemical، New Brunswick، NJ، USA) واکنش داده شد، به مدت 30 دقیقه در حمام آب جوش انکوبه شد، سپس خنک شد و با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160A (شرکت Shimadzu، ژاپن) در طول موج 580 نانومتر اندازه‌گیری شد. از سوی دیگر، پرولین با روش Bates (Bates و همکاران، 1973) تعیین شد. پرولین با اسید سولفوسالیسیلیک 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) استخراج شد و پس از سانتریفیوژ، 0.5 میلی‌لیتر از محلول رویی با 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) و معرف نین‌هیدرین مخلوط شد، به مدت 45 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد انکوبه شد، خنک شد و با استفاده از همان اسپکتروفتومتر فوق در طول موج 520 نانومتر اندازه‌گیری شد. کل اسیدهای آمینه آزاد و پرولین موجود در عصاره‌های برگ به ترتیب با استفاده از منحنی‌های کالیبراسیون گلیسین و پرولین (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) تعیین و به صورت میلی‌گرم بر گرم وزن تازه بیان شدند.
برای تعیین فعالیت آنزیمی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، تقریباً 500 میلی‌گرم از بافت همگن‌شده با 3 میلی‌لیتر بافر تریس 50 میلی‌مولار (pH 7.8) حاوی 1 میلی‌مولار EDTA-Na2 (سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده) و 7.5٪ پلی‌وینیل‌پیرولیدون (PVP؛ سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده) استخراج شد، به مدت 20 دقیقه در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) با سرعت 10000 × g سانتریفیوژ شد و مایع رویی (عصاره خام آنزیم) جمع‌آوری شد (ال-ناگار و همکاران، 2023؛ عثمان و همکاران، 2023). سپس کاتالاز (CAT) با 2 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 0.1 مولار (pH 6.5؛ سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده) و 100 میکرولیتر محلول 269 میلی‌مولار H2O2 واکنش داده شد تا فعالیت آنزیمی آن طبق روش Aebi (1984) با اندکی تغییرات تعیین شود (El-Nagar و همکاران، 2023؛ Osman و همکاران، 2023). فعالیت آنزیمی پراکسیداز وابسته به گایاکول (POX) با استفاده از روش Harrach و همکاران (2009) تعیین شد. (2008) با تغییرات جزئی (El-Nagar و همکاران، 2023؛ Osman و همکاران، 2023) و فعالیت آنزیمی پلی فنل اکسیداز (PPO) پس از واکنش با 2.2 میلی لیتر بافر فسفات سدیم 100 میلی مولار (pH 6.0)، 100 میکرولیتر گایاکول (TCI chemicals، پورتلند، اورگان، ایالات متحده آمریکا) و 100 میکرولیتر H2O2 12 میلی مولار تعیین شد. این روش کمی از (El-Nagar و همکاران، 2023؛ Osman و همکاران، 2023) اصلاح شده است. این سنجش پس از واکنش با 3 میلی لیتر محلول کاتکول (Thermo Scientific Chemicals، والتهام، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا) (0.01 مولار) که تازه در بافر فسفات 0.1 مولار (pH 6.0) تهیه شده بود، انجام شد. فعالیت CAT با پایش تجزیه H2O2 در طول موج 240 نانومتر (A240)، فعالیت POX با پایش افزایش جذب در طول موج 436 نانومتر (A436) و فعالیت PPO با ثبت نوسانات جذب در طول موج 495 نانومتر (A495) هر 30 ثانیه به مدت 3 دقیقه با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160A (Shimadzu، ژاپن) اندازه‌گیری شد.
از RT-PCR در زمان واقعی برای تشخیص سطح رونوشت سه ژن مرتبط با آنتی‌اکسیدان، شامل کاتالاز پراکسیزومی (PvCAT1؛ شماره دسترسی GenBank KF033307.1)، سوپراکسید دیسموتاز (PvSOD؛ شماره دسترسی GenBank XM_068639556.1) و گلوتاتیون ردوکتاز (PvGR؛ شماره دسترسی GenBank KY195009.1)، در برگ‌های لوبیا (دومین و سومین برگ کاملاً توسعه‌یافته از بالا) 72 ساعت پس از آخرین تیمار استفاده شد. به طور خلاصه، RNA با استفاده از کیت استخراج RNA Total Simply P (شماره دسترسی Cat. BSC52S1؛ BioFlux، Biori Technology، چین) طبق پروتکل سازنده جدا شد. سپس، cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA TOP script™ طبق دستورالعمل سازنده سنتز شد. توالی آغازگر سه ژن فوق در جدول تکمیلی S3 فهرست شده است. ژن PvActin-3 (شماره دسترسی GenBank: XM_068616709.1) به عنوان ژن خانه‌دار مورد استفاده قرار گرفت و بیان نسبی ژن با استفاده از روش 2-ΔΔCT محاسبه شد (Livak and Schmittgen, 2001). پایداری اکتین تحت تنش زیستی (تعامل ناسازگار بین حبوبات رایج و قارچ آنتراکنوز Colletotrichum lindemuthianum) و تنش غیرزیستی (خشکسالی، شوری، دمای پایین) نشان داده شد (Borges et al., 2012).
ما در ابتدا یک آنالیز in silico در سطح ژنوم از پروتئین‌های اگزالواستات استیل هیدرولاز (OAH) در S. sclerotiorum با استفاده از ابزار BLAST پروتئین-پروتئین (BLASTp 2.15.0+) انجام دادیم (Altschul و همکاران، 1997، 2005). به طور خلاصه، ما از OAH از Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH؛ تاکسید: 1191702؛ شماره دسترسی GenBank XP_040799428.1؛ 342 اسید آمینه) و Penicillium lagena (PlOAH؛ تاکسید: 94218؛ شماره دسترسی GenBank XP_056833920.1؛ 316 اسید آمینه) به عنوان توالی‌های جستجو برای نقشه‌برداری پروتئین همولوگ در S. sclerotiorum (تاکسید: 5180) استفاده کردیم. BLASTp بر روی جدیدترین داده‌های ژنوم S. sclerotiorum موجود در GenBank در وب‌سایت مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI)، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/، انجام شد.
علاوه بر این، ژن OAH پیش‌بینی‌شده از S. sclerotiorum (SsOAH) و تجزیه و تحلیل تکاملی و درخت فیلوژنتیک AfOAH از A. fijiensis CBS 313.89 و PlOAH از P. lagena با استفاده از روش حداکثر درستنمایی در MEGA11 (Tamura و همکاران، 2021) و مدل مبتنی بر ماتریس JTT (Jones و همکاران، 1992) استنباط شدند. درخت فیلوژنتیک با تجزیه و تحلیل هم‌ترازی چندگانه توالی‌های پروتئینی تمام ژن‌های OAH پیش‌بینی‌شده (SsOAH) از S. sclerotiorum و توالی مورد جستجو با استفاده از ابزار هم‌ترازی مبتنی بر محدودیت (COBALT؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos و Agarwala، 2007) ترکیب شد. علاوه بر این، بهترین توالی‌های اسید آمینه منطبق SsOAH از S. sclerotiorum با توالی‌های مورد جستجو (AfOAH و PlOAH) (Larkin و همکاران، ۲۰۰۷) با استفاده از ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) هم‌تراز شدند و نواحی حفاظت‌شده در هم‌ترازی با استفاده از ابزار ESPript (نسخه ۳.۰؛ https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) به تصویر کشیده شدند.
علاوه بر این، دامنه‌های عملکردی نماینده پیش‌بینی‌شده و مکان‌های حفاظت‌شده S. sclerotiorum SsOAH به صورت تعاملی با استفاده از ابزار InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) در خانواده‌های مختلف طبقه‌بندی شدند (Blum و همکاران، 2021). در نهایت، مدل‌سازی ساختار سه‌بعدی (3D) S. sclerotiorum SsOAH پیش‌بینی‌شده با استفاده از موتور تشخیص پروتئین همولوژی/آنالوژی (سرور Phyre2 نسخه 2.0؛ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley و همکاران، 2015) انجام شد و با استفاده از سرور SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) اعتبارسنجی شد (Biasini و همکاران، 2014). ساختارهای سه‌بعدی پیش‌بینی‌شده (با فرمت PDB) با استفاده از بسته UCSF-Chimera (نسخه 1.15؛ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) به صورت تعاملی تجسم شدند (Pettersen و همکاران، 2004).
از PCR فلورسانس کمی در زمان واقعی برای تعیین سطح رونویسی اگزالواستات استیل هیدرولاز (SsOAH؛ شماره دسترسی GenBank: XM_001590428.1) در میسلیوم‌های قارچ Sclerotinia sclerotiorum استفاده شد. به طور خلاصه، S. sclerotiorum به یک فلاسک حاوی PDB تلقیح شد و در یک انکوباتور شیکردار (مدل: I2400، شرکت علمی نیوبرانزویک، ادیسون، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) در دمای 25 ± 2 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت با سرعت 150 دور در دقیقه و در تاریکی مداوم (24 ساعت) قرار داده شد تا رشد میسلیوم تحریک شود. پس از آن، سلول‌ها با غلظت‌های نهایی IC50 (به ترتیب تقریباً 40 و 3.2 میلی‌گرم در لیتر) با L-ornithine و قارچ‌کش Rizolex-T تیمار شدند و سپس به مدت 24 ساعت دیگر تحت همان شرایط کشت داده شدند. پس از انکوباسیون، کشت‌ها به مدت 5 دقیقه با سرعت 2500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی (میسلیوم قارچی) برای تجزیه و تحلیل بیان ژن جمع‌آوری شد. به طور مشابه، میسلیوم قارچی در زمان‌های 0، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت پس از عفونت از گیاهان آلوده‌ای که کپک سفید و میسلیوم پنبه‌ای روی سطح بافت‌های آلوده تشکیل داده بودند، جمع‌آوری شد. RNA از میسلیوم قارچی استخراج و سپس cDNA همانطور که در بالا توضیح داده شد، سنتز شد. توالی آغازگر برای SsOAH در جدول تکمیلی S3 فهرست شده است. SsActin (شماره دسترسی GenBank: XM_001589919.1) به عنوان ژن خانه‌دار استفاده شد و بیان نسبی ژن با استفاده از روش 2-ΔΔCT محاسبه شد (Livak and Schmittgen, 2001).
اسید اگزالیک در محیط کشت مایع سیب‌زمینی دکستروز (PDB) و نمونه‌های گیاهی حاوی قارچ بیماری‌زای Sclerotinia sclerotiorum طبق روش Xu و Zhang (2000) با اندکی تغییر تعیین شد. به طور خلاصه، جدایه‌های S. sclerotiorum در فلاسک‌های حاوی PDB تلقیح شدند و سپس در یک انکوباتور شیکردار (مدل I2400، شرکت علمی نیوبرانزویک، ادیسون، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) با سرعت 150 دور در دقیقه در دمای 25 ± 2 درجه سانتیگراد به مدت 3 تا 5 روز در تاریکی مداوم (24 ساعت) کشت داده شدند تا رشد میسلیوم تحریک شود. پس از انکوباسیون، کشت قارچی ابتدا از طریق کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر شد و سپس به مدت 5 دقیقه با سرعت 2500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد تا میسلیوم باقیمانده حذف شود. محلول رویی جمع‌آوری و برای تعیین کمی بیشتر اگزالات در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای تهیه نمونه‌های گیاهی، تقریباً 0.1 گرم از قطعات بافت گیاهی سه بار با آب مقطر (هر بار 2 میلی‌لیتر) استخراج شد. سپس نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه با سرعت 2500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند، محلول رویی از کاغذ صافی واتمن شماره 1 عبور داده شد و برای تجزیه و تحلیل بیشتر جمع‌آوری شد.
برای آنالیز کمی اسید اگزالیک، مخلوط واکنش در یک لوله شیشه‌ای با درپوش به ترتیب زیر تهیه شد: 0.2 میلی‌لیتر نمونه (یا محلول فیلتر شده کشت PDB یا محلول استاندارد اسید اگزالیک)، 0.11 میلی‌لیتر بروموفنول بلو (BPB، 1 میلی‌مولار؛ فیشر کمیکال، پیتسبورگ، پنسیلوانیا، ایالات متحده آمریکا)، 0.198 میلی‌لیتر اسید سولفوریک 1 مولار (H2SO4؛ شرکت داروسازی و لوازم پزشکی آل-گومهوریا، قاهره، مصر) و 0.176 میلی‌لیتر دی‌کرومات پتاسیم 100 میلی‌مولار (K2Cr2O7؛ مواد شیمیایی TCI، پورتلند، اورگان، ایالات متحده آمریکا)، و سپس محلول با آب مقطر تا 4.8 میلی‌لیتر رقیق شد، به شدت مخلوط شد و بلافاصله در حمام آب 60 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از 10 دقیقه، واکنش با اضافه کردن 0.5 میلی‌لیتر محلول هیدروکسید سدیم (NaOH؛ 0.75 مولار) متوقف شد. جذب (A600) مخلوط واکنش در طول موج 600 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-160 (شرکت Shimadzu، ژاپن) اندازه‌گیری شد. PDB و آب مقطر به ترتیب به عنوان کنترل برای تعیین مقدار مواد فیلتر شده کشت و نمونه‌های گیاهی استفاده شدند. غلظت اسید اگزالیک در مواد فیلتر شده کشت، که به صورت میکروگرم اسید اگزالیک در هر میلی‌لیتر محیط PDB (μg.mL-1) بیان می‌شود، و در عصاره‌های برگ، که به صورت میکروگرم اسید اگزالیک در هر گرم وزن تازه (μg.g-1 FW) بیان می‌شود، با استفاده از منحنی کالیبراسیون اسید اگزالیک (شرکت Thermo Fisher Scientific Chemicals، Waltham، MA، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد.
در طول مطالعه، تمام آزمایش‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی (CRD) با شش تکرار بیولوژیکی در هر تیمار و پنج گلدان در هر تکرار بیولوژیکی (دو گیاه در هر گلدان) طراحی شدند، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد. تکرارهای بیولوژیکی به صورت تکراری (دو تکرار فنی) تجزیه و تحلیل شدند. تکرارهای فنی برای بررسی تکرارپذیری همان آزمایش استفاده شدند، اما برای جلوگیری از تکرارهای کاذب در تجزیه و تحلیل آماری استفاده نشدند. داده‌ها با استفاده از تجزیه و تحلیل واریانس (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تفاوت معنادار صادقانه توکی-کرامر (HSD) (p ≤ 0.05) از نظر آماری تجزیه و تحلیل شدند. برای آزمایش‌های آزمایشگاهی، مقادیر IC50 و IC99 با استفاده از مدل پروبیت محاسبه و فواصل اطمینان 95٪ محاسبه شد.
در مجموع چهار جدایه از مزارع مختلف سویا در استان الغابیه مصر جمع‌آوری شدند. در محیط کشت PDA، همه جدایه‌ها میسلیوم سفید خامه‌ای تولید کردند که به سرعت به سفید پنبه‌ای تبدیل شد (شکل 1A) و سپس در مرحله اسکلروتیوم به رنگ بژ یا قهوه‌ای درآمد. اسکلروت‌ها معمولاً متراکم، سیاه، کروی یا نامنظم هستند، 5.2 تا 7.7 میلی‌متر طول و 3.4 تا 5.3 میلی‌متر قطر دارند (شکل 1B). اگرچه چهار جدایه پس از 10 تا 12 روز انکوباسیون در دمای 2 ± 25 درجه سانتیگراد، الگوی حاشیه‌ای اسکلروت‌ها را در لبه محیط کشت ایجاد کردند (شکل 1A)، تعداد اسکلروت‌ها در هر پلیت به طور قابل توجهی بین آنها متفاوت بود (P < 0.001)، و جدایه 3 بیشترین تعداد اسکلروت را داشت (32.33 ± 1.53 اسکلروت در هر پلیت؛ شکل 1C). به طور مشابه، جدایه شماره ۳ در PDB اسید اگزالیک بیشتری نسبت به سایر جدایه‌ها تولید کرد (۳.۳۳ ± ۰.۴۹ میکروگرم در میلی‌لیتر؛ شکل ۱D). جدایه شماره ۳ ویژگی‌های مورفولوژیکی و میکروسکوپی معمول قارچ بیماری‌زای گیاهی Sclerotinia sclerotiorum را نشان داد. به عنوان مثال، در PDA، کلنی‌های جدایه شماره ۳ به سرعت رشد کردند، سفید کرمی (شکل ۱A)، بژ معکوس یا زرد-قهوه‌ای روشن بودند و برای پوشاندن کامل سطح یک پلیت با قطر ۹ سانتی‌متر، به ۶-۷ روز در دمای ۲۵ ± ۲ درجه سانتی‌گراد نیاز داشتند. بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی و میکروسکوپی فوق، جدایه شماره ۳ به عنوان Sclerotinia sclerotiorum شناسایی شد.
شکل 1. ویژگی‌ها و بیماری‌زایی جدایه‌های S. sclerotiorum از محصولات حبوبات رایج. (الف) رشد میسلیومی چهار جدایه S. sclerotiorum روی محیط کشت PDA، (ب) اسکلروت‌های چهار جدایه S. sclerotiorum، (ج) تعداد اسکلروت‌ها (در هر پلیت)، (د) ترشح اسید اگزالیک روی محیط کشت PDB (میکروگرم در میلی‌لیتر) و (ه) شدت بیماری (%) چهار جدایه S. sclerotiorum روی رقم حساس حبوبات تجاری Giza 3 در شرایط گلخانه. مقادیر نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار پنج تکرار بیولوژیکی (n = 5) است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت آماری معنی‌دار بین تیمارها هستند (p < 0.05). (F-H) علائم معمول کپک سفید به ترتیب روی ساقه‌ها و خورجین‌های بالای سطح زمین، 10 روز پس از مایه‌زنی با جدایه شماره 3 (dpi) ظاهر شدند. (I) تجزیه و تحلیل تکاملی ناحیه فاصله‌گذار رونویسی داخلی (ITS) جدایه شماره 3 S. sclerotiorum با استفاده از روش حداکثر درستنمایی انجام شد و با 20 جدایه/سویه مرجع به‌دست‌آمده از پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) مقایسه شد. اعداد بالای خطوط خوشه‌بندی نشان‌دهنده پوشش ناحیه (%) و اعداد زیر خطوط خوشه‌بندی نشان‌دهنده طول شاخه هستند.
علاوه بر این، برای تأیید بیماری‌زایی، از چهار جدایه S. sclerotiorum به‌دست‌آمده برای تلقیح رقم حساس تجاری لوبیا Giza 3 در شرایط گلخانه استفاده شد که با اصول کخ مطابقت دارد (شکل 1E). اگرچه همه جدایه‌های قارچی به‌دست‌آمده بیماری‌زا بودند و می‌توانستند لوبیا سبز (رقم Giza 3) را آلوده کنند و باعث ایجاد علائم معمول کپک سفید در تمام قسمت‌های هوایی (شکل 1F)، به‌ویژه در ساقه‌ها (شکل 1G) و غلاف‌ها (شکل 1H) در 10 روز پس از تلقیح (dpi) شوند، جدایه 3 در دو آزمایش مستقل، تهاجمی‌ترین جدایه بود. جدایه 3 بیشترین شدت بیماری (%) را روی گیاهان لوبیا داشت (به ترتیب 24.0 ± 4.0، 58.0 ± 2.0 و 76.7 ± 3.1 در 7، 14 و 21 روز پس از آلودگی؛ شکل 1F).
شناسایی تهاجمی‌ترین جدایه S. sclerotiorum شماره ۳ بر اساس توالی‌یابی فاصله‌گذار رونویسی داخلی (ITS) بیشتر تأیید شد (شکل ۱I). تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی بین جدایه شماره ۳ و ۲۰ جدایه/سویه مرجع، شباهت بالایی (بیش از ۹۹٪) بین آنها نشان داد. شایان ذکر است که جدایه S. sclerotiorum شماره ۳ (۵۳۳ جفت باز) شباهت زیادی به جدایه S. sclerotiorum آمریکایی LPM36 جدا شده از دانه‌های نخود فرنگی خشک (شماره دسترسی GenBank MK896659.1؛ ۵۴۰ جفت باز) و جدایه S. sclerotiorum چینی YKY211 (شماره دسترسی GenBank OR206374.1؛ ۵۴۸ جفت باز) که باعث پوسیدگی ساقه بنفشه (Matthiola incana) می‌شود، دارد که همه آنها به طور جداگانه در بالای دندروگرام گروه‌بندی شده‌اند (شکل ۱I). توالی جدید در پایگاه داده NCBI ثبت شده و با نام «Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25» (شماره دسترسی GenBank PV202792) نامگذاری شده است. همانطور که مشاهده می‌شود، ایزوله ۳ تهاجمی‌ترین ایزوله است؛ بنابراین، این ایزوله برای مطالعه در تمام آزمایش‌های بعدی انتخاب شد.
فعالیت ضد باکتریایی دی‌آمین ال-اورنیتین (سیگما-آلدریچ، دارمشتات، آلمان) در غلظت‌های مختلف (12.5، 25، 50، 75، 100 و 125 میلی‌گرم در لیتر) علیه جدایه 3 قارچ S. sclerotiorum در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد. قابل توجه است که ال-اورنیتین اثر ضد باکتریایی اعمال کرد و به تدریج رشد شعاعی هیف‌های S. sclerotiorum را به صورت وابسته به دوز مهار کرد (شکل 2A، B). در بالاترین غلظت آزمایش شده (125 میلی‌گرم در لیتر)، ال-اورنیتین بالاترین میزان مهار رشد میسلیومی (99.62 ± 0.27٪؛ شکل 2B) را نشان داد که معادل قارچ‌کش تجاری Rizolex-T (میزان مهار 99.45 ± 0.39٪؛ شکل 2C) در بالاترین غلظت آزمایش شده (10 میلی‌گرم در لیتر) بود که نشان‌دهنده اثربخشی مشابه است.
شکل 2. فعالیت ضد باکتریایی ال-اورنیتین علیه قارچ Sclerotinia sclerotiorum در شرایط آزمایشگاهی. (الف) مقایسه فعالیت ضد باکتریایی غلظت‌های مختلف ال-اورنیتین علیه S. sclerotiorum با قارچ‌کش تجاری Rizolex-T (10 میلی‌گرم در لیتر). (ب، ج) میزان بازدارندگی (%) از رشد میسلیومی S. sclerotiorum پس از تیمار با غلظت‌های مختلف ال-اورنیتین (12.5، 25، 50، 75، 100 و 125 میلی‌گرم در لیتر) یا Rizolex-T (2، 4، 6، 8 و 10 میلی‌گرم در لیتر). مقادیر نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار پنج تکرار بیولوژیکی (n = 5) است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت‌های آماری بین تیمارها هستند (p < 0.05). (د، ه) تجزیه و تحلیل رگرسیون مدل پروبیت به ترتیب ال-اورنیتین و قارچ‌کش تجاری Rizolex-T. خط رگرسیون مدل پروبیت به صورت خط آبی پررنگ و فاصله اطمینان (95%) به صورت خط قرمز چین‌دار نشان داده شده است.
علاوه بر این، تجزیه و تحلیل رگرسیون پروبیت انجام شد و نمودارهای مربوطه در جدول 1 و شکل‌های 2D و 2E نشان داده شده است. به طور خلاصه، مقدار شیب قابل قبول (y = 2.92x - 4.67) و آماره‌های معنی‌دار مرتبط (Cox & Snell R2 = 0.3709، Nagelkerke R2 = 0.4998 و p < 0.0001؛ شکل 2D) مربوط به L-ornithine، فعالیت ضد قارچی افزایش یافته‌ای را علیه S. sclerotiorum در مقایسه با قارچ‌کش تجاری Rizolex-T (y = 1.96x - 0.99، Cox & Snell R2 = 0.1242، Nagelkerke R2 = 0.1708 و p < 0.0001) نشان داد (جدول 1).
جدول 1. مقادیر غلظت بازدارنده نصف حداکثر (IC50) و IC99 (میلی‌گرم در لیتر) ال-اورنیتین و قارچ‌کش تجاری "Rizolex-T" علیه S. sclerotiorum.
به طور کلی، ال-اورنیتین (250 میلی‌گرم در لیتر) به طور قابل توجهی توسعه و شدت کپک سفید را روی گیاهان لوبیای معمولی تیمار شده در مقایسه با گیاهان آلوده به S. sclerotiorum تیمار نشده (کنترل؛ شکل 3A) کاهش داد. به طور خلاصه، اگرچه شدت بیماری گیاهان کنترل آلوده تیمار نشده به تدریج افزایش یافت (1.53 ± 52.67، 2.61 ± 83.21 و 3.06 ± 92.33٪)، ال-اورنیتین به طور قابل توجهی شدت بیماری (%) را در طول آزمایش (0.15 ± 8.97، 1.00 ± 18.00 و 3.07 ± 26.36) به ترتیب در 7، 14 و 21 روز پس از تیمار (dpt) کاهش داد (شکل 3A). به طور مشابه، هنگامی که گیاهان لوبیای آلوده به S. sclerotiorum با 250 میلی‌گرم در لیتر ال-اورنیتین تیمار شدند، سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) از 1274.33 ± 33.13 در شاهد تیمار نشده به 281.03 ± 7.95 کاهش یافت که کمی کمتر از سطح زیر منحنی کنترل مثبت 50 میلی‌گرم در لیتر قارچ‌کش Rizolex-T بود (183.61 ± 7.71؛ شکل 3B). همین روند در آزمایش دوم نیز مشاهده شد.
شکل 3. تأثیر کاربرد خارجی ال-اورنیتین بر توسعه پوسیدگی سفید لوبیا ناشی از قارچ Sclerotinia sclerotiorum در شرایط گلخانه. (الف) منحنی پیشرفت بیماری کپک سفید لوبیا پس از تیمار با 250 میلی‌گرم در لیتر ال-اورنیتین. (ب) سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) کپک سفید لوبیا پس از تیمار با ال-اورنیتین. مقادیر نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار پنج تکرار بیولوژیکی (n = 5) است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت آماری معنی‌دار بین تیمارها هستند (p < 0.05).
کاربرد خارجی ۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر ال-اورنیتین به تدریج ارتفاع گیاه (شکل ۴A)، تعداد شاخه در هر گیاه (شکل ۴B) و تعداد برگ در هر گیاه (شکل ۴C) را پس از ۴۲ روز افزایش داد. در حالی که قارچ‌کش تجاری Rizolex-T (50 میلی‌گرم در لیتر) بیشترین تأثیر را بر تمام پارامترهای تغذیه‌ای مورد مطالعه داشت، کاربرد خارجی ۲۵۰ میلی‌گرم در لیتر ال-اورنیتین در مقایسه با شاهدهای تیمار نشده، دومین تأثیر بزرگ را داشت (شکل‌های ۴A-C). از سوی دیگر، تیمار با ال-اورنیتین هیچ تأثیر معنی‌داری بر محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی کلروفیل a (شکل 4D) و کلروفیل b (شکل 4E) نداشت، اما محتوای کل کاروتنوئید (0.56 ± 0.03 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک) را در مقایسه با کنترل منفی (0.44 ± 0.02 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک) و کنترل مثبت (0.46 ± 0.02 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک؛ شکل 4F) اندکی افزایش داد. به طور کلی، این نتایج نشان می‌دهد که ال-اورنیتین برای حبوبات تیمار شده فیتوتوکسیک نیست و حتی ممکن است رشد آنها را تحریک کند.
شکل 4. تأثیر کاربرد ال-اورنیتین برون‌زا بر ویژگی‌های رشدی و رنگدانه‌های فتوسنتزی برگ‌های لوبیای آلوده به قارچ Sclerotinia sclerotiorum در شرایط گلخانه. (الف) ارتفاع گیاه (سانتی‌متر)، (ب) تعداد شاخه در هر بوته، (ج) تعداد برگ در هر بوته، (د) میزان کلروفیل a (میلی‌گرم در گرم وزن خشک)، (ه) میزان کلروفیل b (میلی‌گرم در گرم وزن خشک)، (و) میزان کل کاروتنوئید (میلی‌گرم در گرم وزن خشک). مقادیر، میانگین ± انحراف معیار پنج تکرار بیولوژیکی (n = 5) هستند. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت آماری معنی‌دار بین تیمارها هستند (p < 0.05).
مکان‌یابی هیستوشیمیایی درجا گونه‌های فعال اکسیژن (ROS؛ بیان‌شده به صورت پراکسید هیدروژن [H2O2]) و رادیکال‌های آزاد (بیان‌شده به صورت آنیون‌های سوپراکسید [O2•−]) نشان داد که کاربرد خارجی L-اورنیتین (250 میلی‌گرم در لیتر) به طور قابل توجهی تجمع H2O2 (96.05 ± 5.33 نانومول در گرم وزن تر؛ شکل 5A) و O2•− (32.69 ± 8.56 نانومول در گرم وزن تر؛ شکل 5B) را در مقایسه با تجمع گیاهان آلوده تیمار نشده (به ترتیب 173.31 ± 12.06 و 149.35 ± 7.94 نانومول در گرم وزن تر) و گیاهان تیمار شده با 50 میلی‌گرم در لیتر قارچ‌کش تجاری Rizolex-T (170.12 ± 9.50 و 157.00) کاهش داد. (به ترتیب 7.81 ± نانومول در گرم وزن خشک در 72 ساعت). سطوح بالای H2O2 و O2•− تحت شرایط HPT تجمع یافتند (شکل 5A، B). به طور مشابه، سنجش مالون دی آلدئید (MDA) مبتنی بر TCA نشان داد که گیاهان لوبیای آلوده به S. sclerotiorum سطوح بالاتری از MDA (113.48 ± 10.02 نانومول در گرم وزن خشک) را در برگ‌های خود تجمع دادند (شکل 5C). با این حال، کاربرد خارجی L-اورنیتین به طور قابل توجهی پراکسیداسیون لیپید را کاهش داد، همانطور که با کاهش محتوای MDA در گیاهان تیمار شده (33.08 ± 4.00 نانومول در گرم وزن خشک) مشهود است.
شکل 5. تأثیر کاربرد خارجی ال-اورنیتین بر نشانگرهای اصلی استرس اکسیداتیو و مکانیسم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدانی غیرآنزیمی در برگ‌های لوبیای آلوده به S. sclerotiorum در 72 ساعت پس از عفونت در شرایط گلخانه. (الف) پراکسید هیدروژن (H2O2؛ nmol g-1 FW) در 72 hpt، (ب) آنیون سوپراکسید (O2•−؛ nmol g-1 FW) در 72 hpt، (ج) مالون دی آلدئید (MDA؛ nmol g-1 FW) در 72 hpt، (د) کل فنل‌های محلول (میلی‌گرم GAE g-1 FW) در 72 hpt، (ه) کل فلاونوئیدهای محلول (میلی‌گرم RE g-1 FW) در 72 hpt، (و) کل اسیدهای آمینه آزاد (میلی‌گرم g-1 FW) در 72 hpt، و (ز) محتوای پرولین (میلی‌گرم g-1 FW) در 72 hpt. مقادیر نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) 5 تکرار بیولوژیکی (n = 5) است. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت آماری معنی‌دار بین تیمارها هستند (p < 0.05).