نظریه‌های مختلف دفاع گیاهی، راهنمایی‌های نظری مهمی را برای توضیح الگوهای متابولیسم تخصصی گیاه ارائه می‌دهند، اما پیش‌بینی‌های کلیدی آنها هنوز نیاز به آزمایش دارد. در اینجا، ما از تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (MS/MS) برای بررسی سیستماتیک متابولوم سویه‌های تضعیف‌شده تنباکو از گیاهان منفرد تا جمعیت‌ها و گونه‌های نزدیک به هم استفاده کردیم و تعداد زیادی از نظریه‌های ویژگی طیف‌سنجی جرمی را بر اساس طیف‌های ترکیبی موجود در اطلاعات پردازش کردیم. چارچوبی برای آزمایش پیش‌بینی‌های کلیدی نظریه‌های دفاع بهینه (OD) و هدف متحرک (MT). مؤلفه اطلاعات متابولومیکس گیاهی با نظریه OD سازگار است، اما با پیش‌بینی اصلی نظریه MT در مورد پویایی متابولومیکس ناشی از گیاهخواران در تضاد است. از مقیاس تکاملی خرد تا کلان، سیگنال جاسمونات به عنوان عامل اصلی تعیین‌کننده OD شناسایی شد، در حالی که سیگنال اتیلن تنظیم دقیق پاسخ ویژه گیاهخواران را که توسط شبکه مولکولی MS/MS شرح داده شده بود، فراهم کرد.
متابولیت‌های ویژه با ساختارهای متنوع، شرکت‌کنندگان اصلی در سازگاری گیاه با محیط، به ویژه در دفاع از دشمنان هستند (1). تنوع شگفت‌انگیز متابولیسم ویژه موجود در گیاهان، دهه‌ها تحقیق عمیق در مورد جنبه‌های مختلف عملکردهای اکولوژیکی آن را برانگیخته و فهرستی طولانی از نظریه‌های دفاع گیاهی را تشکیل داده است که توسعه تکاملی و اکولوژیکی تعاملات گیاه و حشره هستند. تحقیقات تجربی راهنمایی‌های مهمی ارائه می‌دهند (2). با این حال، این نظریه‌های دفاع گیاهی از مسیر هنجاری استدلال قیاسی فرضی پیروی نکردند، که در آن پیش‌بینی‌های کلیدی در همان سطح تجزیه و تحلیل بودند (3) و به صورت تجربی برای پیشبرد چرخه بعدی توسعه نظری آزمایش شدند (4). محدودیت‌های فنی، جمع‌آوری داده‌ها را به دسته‌های متابولیکی خاص محدود می‌کند و تجزیه و تحلیل جامع متابولیت‌های تخصصی را حذف می‌کند، بنابراین از مقایسه‌های بین دسته‌ای که برای توسعه نظری ضروری هستند، جلوگیری می‌کند (5). فقدان داده‌های جامع متابولومیکس و یک واحد پول مشترک برای مقایسه گردش کار پردازش فضای متابولیکی بین گروه‌های مختلف گیاهی، مانع بلوغ علمی این حوزه می‌شود.
آخرین پیشرفت‌ها در زمینه متابولومیکس طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (MS/MS) می‌تواند به طور جامع تغییرات متابولیکی درون و بین گونه‌های یک کلاد سیستمی مشخص را توصیف کند و می‌تواند با روش‌های محاسباتی برای محاسبه شباهت ساختاری بین این مخلوط‌های پیچیده ترکیب شود. دانش قبلی از شیمی (5). ترکیب فناوری‌های پیشرفته در تجزیه و تحلیل و محاسبات، چارچوبی ضروری برای آزمایش طولانی مدت بسیاری از پیش‌بینی‌های انجام شده توسط نظریه‌های اکولوژیکی و تکاملی تنوع متابولیکی فراهم می‌کند. شانون (6) برای اولین بار در مقاله اصلی خود در سال 1948، نظریه اطلاعات را معرفی کرد و پایه و اساس تجزیه و تحلیل ریاضی اطلاعات را بنا نهاد که در بسیاری از زمینه‌ها غیر از کاربرد اصلی آن استفاده شده است. در ژنومیک، نظریه اطلاعات با موفقیت برای کمی‌سازی اطلاعات محافظه‌کار توالی به کار گرفته شده است (7). در تحقیقات ترانسکریپتومیکس، نظریه اطلاعات تغییرات کلی در ترانسکریپتوم را تجزیه و تحلیل می‌کند (8). در تحقیقات قبلی، ما چارچوب آماری نظریه اطلاعات را در متابولومیکس به کار بردیم تا تخصص متابولیکی سطح بافت در گیاهان را توصیف کنیم (9). در اینجا، ما گردش کار مبتنی بر MS/MS را با چارچوب آماری نظریه اطلاعات، که با تنوع متابولیکی در واحد پول رایج مشخص می‌شود، ترکیب می‌کنیم تا پیش‌بینی‌های کلیدی نظریه دفاع گیاهی از متابولوم القا شده توسط گیاهخواران را مقایسه کنیم.
چارچوب‌های نظری دفاع گیاهی معمولاً فراگیر هستند و می‌توان آنها را به دو دسته تقسیم کرد: آن‌هایی که سعی می‌کنند توزیع متابولیت‌های خاص گیاه را بر اساس عملکردهای دفاعی توضیح دهند، مانند دفاع بهینه (OD) (10)، هدف متحرک (MT) (11) و نظریه ظاهر (12)، در حالی که برخی دیگر به دنبال توضیحات مکانیکی در مورد چگونگی تأثیر تغییرات در دسترسی به منابع بر رشد گیاه و تجمع متابولیت‌های تخصصی هستند، مانند فرضیه تعادل کربن: مواد مغذی (13)، فرضیه سرعت رشد (14) و فرضیه تعادل رشد و تمایز (15). این دو مجموعه نظریه در سطوح مختلف تحلیل قرار دارند (4). با این حال، دو نظریه که شامل عملکردهای دفاعی در سطح عملکردی هستند، بر گفتگو در مورد دفاع‌های ساختاری و القایی گیاه تسلط دارند: نظریه OD، که فرض می‌کند گیاهان فقط در مواقع نیاز، مثلاً زمانی که بلعیده می‌شوند، در دفاع‌های شیمیایی گران‌قیمت خود سرمایه‌گذاری می‌کنند. هنگامی که یک حیوان علف‌خوار حمله می‌کند، بنابراین، با توجه به احتمال حمله آینده، ترکیبی با عملکرد دفاعی اختصاص داده می‌شود (10)؛ فرضیه MT پیشنهاد می‌کند که هیچ محور تغییر متابولیت جهت‌داری وجود ندارد، اما متابولیت به صورت تصادفی تغییر می‌کند، بنابراین احتمال مسدود کردن "هدف حرکت" متابولیک گیاهخواران مهاجم را ایجاد می‌کند. به عبارت دیگر، این دو نظریه پیش‌بینی‌های متضادی در مورد بازسازی متابولیکی که پس از حمله گیاهخواران رخ می‌دهد، ارائه می‌دهند: رابطه بین تجمع یک‌طرفه متابولیت‌ها با عملکرد دفاعی (OD) و تغییرات متابولیکی غیر جهت‌دار (MT) (11).
فرضیه‌های OD و MT نه تنها شامل تغییرات القایی در متابولوم، بلکه پیامدهای اکولوژیکی و تکاملی تجمع این متابولیت‌ها، مانند هزینه‌ها و مزایای تطبیقی ​​این تغییرات متابولیکی در یک محیط اکولوژیکی خاص را نیز شامل می‌شوند (16). اگرچه هر دو فرضیه عملکرد دفاعی متابولیت‌های تخصصی را تشخیص می‌دهند، که ممکن است گران یا بی‌هزینه باشند، پیش‌بینی کلیدی که فرضیه‌های OD و MT را متمایز می‌کند، در جهت‌گیری تغییرات متابولیکی القایی نهفته است. پیش‌بینی نظریه OD تاکنون بیشترین توجه تجربی را به خود جلب کرده است. این آزمایش‌ها شامل مطالعه عملکردهای دفاعی مستقیم یا غیرمستقیم بافت‌های مختلف ترکیبات خاص در گلخانه‌ها و شرایط طبیعی و همچنین تغییرات در مرحله رشد گیاه است (17-19). با این حال، تاکنون، به دلیل عدم وجود یک گردش کار و چارچوب آماری برای تجزیه و تحلیل جامع جهانی از تنوع متابولیکی هر موجود زنده، پیش‌بینی تفاوت اصلی بین این دو نظریه (یعنی جهت تغییرات متابولیکی) هنوز مورد آزمایش قرار نگرفته است. در اینجا، چنین تحلیلی را ارائه می‌دهیم.
یکی از مهم‌ترین ویژگی‌های متابولیت‌های ویژه گیاه، تنوع ساختاری شدید آن‌ها در تمام سطوح از گیاهان منفرد، جمعیت‌ها تا گونه‌های مشابه است (20). بسیاری از تغییرات کمی در متابولیت‌های تخصصی را می‌توان در مقیاس جمعیت مشاهده کرد، در حالی که تفاوت‌های کیفی قوی معمولاً در سطح گونه حفظ می‌شوند (20). بنابراین، تنوع متابولیکی گیاه جنبه اصلی تنوع عملکردی است که نشان‌دهنده سازگاری با جایگاه‌های مختلف، به ویژه جایگاه‌هایی با امکان تهاجم متفاوت توسط حشرات خاص و گیاهخواران معمولی است (21). از زمان مقاله پیشگامانه فرنکل (22) در مورد دلایل وجود متابولیت‌های ویژه گیاه، تعاملات با حشرات مختلف به عنوان فشارهای انتخابی مهم در نظر گرفته شده است و اعتقاد بر این است که این تعاملات در طول تکامل، گیاهان را شکل داده‌اند. مسیر متابولیکی (23). تفاوت‌های بین گونه‌ای در تنوع متابولیت‌های تخصصی همچنین ممکن است منعکس کننده تعادل فیزیولوژیکی مرتبط با دفاع گیاهی ساختاری و القایی در برابر استراتژی‌های گیاهخواری باشد، زیرا این دو گونه اغلب با یکدیگر همبستگی منفی دارند (24). اگرچه حفظ یک دفاع خوب در همه زمان‌ها می‌تواند مفید باشد، تغییرات متابولیکی به موقع مرتبط با دفاع، مزایای آشکاری را در اختیار گیاهان قرار می‌دهد تا منابع ارزشمند را به سایر سرمایه‌گذاری‌های فیزیولوژیکی اختصاص دهند (19، 24) و از نیاز به همزیستی جلوگیری کنند. آسیب جانبی (25). علاوه بر این، این سازماندهی مجدد متابولیت‌های تخصصی ناشی از حشرات گیاهخوار ممکن است منجر به توزیع مخرب در جمعیت شود (26) و ممکن است بازتاب مستقیمی از تغییرات طبیعی قابل توجه در سیگنال اسید جاسمونیک (JA) باشد که ممکن است در جمعیت حفظ شود. سیگنال‌های JA بالا و پایین، بده بستان‌هایی بین دفاع در برابر گیاهخواران و رقابت با گونه‌های خاص هستند (27). علاوه بر این، مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های تخصصی در طول تکامل دچار از دست رفتن و تغییر شکل سریع می‌شوند و در نتیجه توزیع متابولیکی تکه‌تکه در بین گونه‌های نزدیک به هم ایجاد می‌شود (28). این چندشکلی‌ها می‌توانند به سرعت در پاسخ به تغییر الگوهای گیاهخواران ایجاد شوند (29)، به این معنی که نوسان جوامع گیاهخواران عامل کلیدی در ایجاد ناهمگونی متابولیکی است.
در اینجا، ما به طور خاص مشکلات زیر را حل کردیم. (I) حشره گیاهخوار چگونه متابولوم گیاه را تغییر پیکربندی می‌دهد؟ (Ii) اجزای اصلی اطلاعات انعطاف‌پذیری متابولیکی که می‌توانند برای آزمایش پیش‌بینی‌های نظریه دفاع بلندمدت کمی‌سازی شوند، کدامند؟ (Iii) آیا باید متابولوم گیاه را به روشی منحصر به فرد برای مهاجم برنامه‌ریزی مجدد کرد، اگر چنین است، هورمون گیاهی چه نقشی در تنظیم یک پاسخ متابولیکی خاص ایفا می‌کند و کدام متابولیت‌ها در اختصاصی بودن گونه در دفاع نقش دارند؟ (Iv) از آنجایی که پیش‌بینی‌های انجام شده توسط بسیاری از نظریه‌های دفاعی را می‌توان در تمام سطوح بافت‌های بیولوژیکی تعمیم داد، ما این سوال را مطرح کردیم که پاسخ متابولیکی ایجاد شده از مقایسه داخلی تا مقایسه بین گونه‌ای چقدر سازگار است؟ برای این منظور، ما به طور سیستماتیک متابولوم برگ نیکوتین تنباکو را مطالعه کرده‌ایم، که یک گیاه مدل اکولوژیکی با متابولیسم تخصصی غنی است و در برابر لارو دو گیاه‌خوار بومی، Lepidoptera Datura (Ms) (بسیار تهاجمی، عمدتاً خورده شده) مؤثر است. کرم‌های برگ پنبه روی Solanaceae و Spodoptera littoralis (Sl)، نوعی "جنس" هستند که گیاهان میزبان آن Solanaceae و سایر میزبان‌های جنس‌ها و خانواده‌های دیگر غذای گیاهی هستند. ما طیف متابولومیکس MS/MS را تجزیه و تحلیل کردیم و توصیفگرهای آماری نظریه اطلاعات را برای مقایسه نظریه‌های OD و MT استخراج کردیم. نقشه‌های اختصاصیت را برای آشکار کردن هویت متابولیت‌های کلیدی ایجاد کردیم. این تجزیه و تحلیل به جمعیت بومی N. nasi و گونه‌های تنباکوی نزدیک به آن گسترش یافت تا کوواریانس بین سیگنالینگ هورمون گیاهی و القای OD بیشتر تجزیه و تحلیل شود.
به منظور دستیابی به یک نقشه کلی در مورد انعطاف‌پذیری و ساختار متابولوم برگ تنباکوی گیاه‌خوار، ما از یک گردش کار تجزیه و تحلیل و محاسبه که قبلاً توسعه داده شده بود، برای جمع‌آوری و تجزیه طیف‌های MS/MS مستقل از داده‌های با وضوح بالا از عصاره‌های گیاهی استفاده کردیم (9). این روش تمایز نیافته (به نام MS/MS) می‌تواند طیف‌های ترکیبی غیر تکراری ایجاد کند که سپس می‌تواند برای همه تجزیه و تحلیل‌های سطح ترکیبی که در اینجا شرح داده شده است، استفاده شود. این متابولیت‌های گیاهی تجزیه شده انواع مختلفی دارند و شامل صدها تا هزاران متابولیت هستند (حدود 500 تا 1000-s/MS/MS در اینجا). در اینجا، ما انعطاف‌پذیری متابولیکی را در چارچوب نظریه اطلاعات در نظر می‌گیریم و تنوع و حرفه‌ای بودن متابولوم را بر اساس آنتروپی شانون توزیع فراوانی متابولیکی، کمی می‌کنیم. با استفاده از فرمول قبلاً پیاده‌سازی شده (8)، مجموعه‌ای از شاخص‌ها را محاسبه کردیم که می‌توانند برای کمی‌سازی تنوع متابولوم (شاخص Hj)، تخصص پروفایل متابولیک (شاخص δj) و ویژگی متابولیکی یک متابولیت واحد (شاخص Si) استفاده شوند. علاوه بر این، ما از شاخص پلاستیسیته فاصله نسبی (RDPI) برای تعیین کمیت القاپذیری متابولوم گیاهخواران استفاده کردیم (شکل 1A) (30). در این چارچوب آماری، ما طیف MS/MS را به عنوان واحد اطلاعات پایه در نظر می‌گیریم و فراوانی نسبی MS/MS را به یک نقشه توزیع فراوانی پردازش می‌کنیم و سپس از آنتروپی شانون برای تخمین تنوع متابولوم از آن استفاده می‌کنیم. تخصص متابولوم با میانگین ویژگی یک طیف MS/MS واحد اندازه‌گیری می‌شود. بنابراین، افزایش فراوانی برخی از کلاس‌های MS/MS پس از القاپذیری گیاهخواری به القاپذیری طیفی، RDPI و تخصص تبدیل می‌شود، یعنی افزایش شاخص δj، زیرا متابولیت‌های تخصصی‌تری تولید می‌شوند و شاخص Si بالایی تولید می‌شود. کاهش شاخص تنوع Hj نشان می‌دهد که یا تعداد MS/MS تولید شده کاهش می‌یابد، یا توزیع فراوانی پروفایل در جهتی کمتر یکنواخت تغییر می‌کند، در حالی که عدم قطعیت کلی آن کاهش می‌یابد. از طریق محاسبه شاخص Si، می‌توان مشخص کرد که کدام MS/MS توسط گیاهخواران خاصی القا می‌شود، و برعکس، کدام MS/MS به القا پاسخ نمی‌دهد، که یک شاخص کلیدی برای تمایز پیش‌بینی MT و OD است.
(الف) توصیفگرهای آماری مورد استفاده برای گیاه‌خواران (H1 تا Hx) MS/MS القاپذیری داده‌ها (RDPI)، تنوع (شاخص Hj)، تخصص (شاخص δj) و اختصاصیت متابولیت (شاخص Si). افزایش درجه تخصص (δj) نشان می‌دهد که به طور متوسط، متابولیت‌های خاص گیاه‌خواران بیشتری تولید خواهد شد، در حالی که کاهش تنوع (Hj) نشان دهنده کاهش تولید متابولیت‌ها یا توزیع ناهموار متابولیت‌ها در نقشه توزیع است. مقدار Si ارزیابی می‌کند که آیا متابولیت مختص یک شرایط خاص (در اینجا، گیاه‌خواران) است یا برعکس در همان سطح حفظ می‌شود. (ب) نمودار مفهومی پیش‌بینی نظریه دفاع با استفاده از محور نظریه اطلاعات. نظریه OD پیش‌بینی می‌کند که حمله گیاه‌خواران متابولیت‌های دفاعی را افزایش می‌دهد و در نتیجه δj را افزایش می‌دهد. در عین حال، Hj کاهش می‌یابد زیرا نمایه به سمت کاهش عدم قطعیت اطلاعات متابولیکی سازماندهی مجدد می‌شود. نظریه MT پیش‌بینی می‌کند که حمله گیاهخواران باعث تغییرات غیر جهت‌دار در متابولوم می‌شود و در نتیجه Hj را به عنوان شاخصی از افزایش عدم قطعیت اطلاعات متابولیکی افزایش می‌دهد و باعث توزیع تصادفی Si می‌شود. ما همچنین یک مدل ترکیبی، بهترین MT، را پیشنهاد کردیم که در آن برخی از متابولیت‌ها با مقادیر دفاعی بالاتر به طور خاص افزایش می‌یابند (مقدار Si بالا)، در حالی که برخی دیگر پاسخ‌های تصادفی (مقدار Si پایین‌تر) نشان می‌دهند.
با استفاده از توصیف‌گرهای نظریه اطلاعات، ما نظریه OD را تفسیر می‌کنیم تا پیش‌بینی کنیم که تغییرات متابولیت‌های ویژه القا شده توسط گیاهخواران در یک حالت ساختاری القا نشده منجر به (i) افزایش اختصاصیت متابولیکی (شاخص Si) که اختصاصیت متابونومی (شاخص δj) را افزایش می‌دهد، و (ii) کاهش تنوع متابولوم (شاخص Hj) به دلیل تغییر توزیع فراوانی متابولیک به توزیع بیشتر لپتین در بدن می‌شود. در سطح یک متابولیت واحد، انتظار می‌رود توزیع Si منظمی وجود داشته باشد، که در آن متابولیت مقدار Si را مطابق با مقدار دفاعی خود افزایش می‌دهد (شکل 1B). در همین راستا، ما نظریه MT را توضیح می‌دهیم تا پیش‌بینی کنیم که تحریک منجر به (i) تغییرات غیر جهت‌دار در متابولیت‌ها می‌شود که منجر به کاهش شاخص δj می‌شود، و (ii) افزایش شاخص Hj به دلیل افزایش عدم قطعیت متابولیک یا تصادفی بودن، که می‌تواند توسط آنتروپی شانون به شکل تنوع تعمیم‌یافته اندازه‌گیری شود. در مورد ترکیب متابولیکی، نظریه MT توزیع تصادفی Si را پیش‌بینی می‌کند. با توجه به اینکه متابولیت‌های خاص تحت شرایط خاص هستند و سایر شرایط تحت شرایط خاص نیستند و ارزش دفاعی آنها به محیط بستگی دارد، ما همچنین یک مدل دفاعی مختلط را پیشنهاد کردیم که در آن δj و Hj به صورت دو به دو در امتداد Si توزیع شده‌اند. افزایش Si در همه جهات، تنها گروه‌های متابولیت خاصی که مقادیر دفاعی بالاتری دارند، Si را به طور خاص افزایش می‌دهند، در حالی که برخی دیگر توزیع تصادفی خواهند داشت (شکل 1B).
به منظور آزمایش پیش‌بینی نظریه دفاع بازتعریف‌شده بر اساس محور توصیفگر نظریه اطلاعات، لاروهای گیاهخوار متخصص (Ms) یا عمومی (Sl) را روی برگ‌های Nepenthes pallens پرورش دادیم (شکل 2A). با استفاده از تجزیه و تحلیل MS/MS، 599 طیف MS/MS غیر تکراری (فایل داده S1) را از عصاره‌های متانولی بافت برگ جمع‌آوری‌شده پس از تغذیه کرم ابریشم بازیابی کردیم. استفاده از شاخص‌های RDPI، Hj و δj برای تجسم پیکربندی مجدد محتوای اطلاعات در فایل‌های پیکربندی MS/MS الگوهای جالبی را نشان می‌دهد (شکل 2B). روند کلی این است که، همانطور که توسط توصیفگر اطلاعات توضیح داده شده است، با ادامه خوردن برگ‌ها توسط کرم ابریشم، درجه سازماندهی مجدد متابولیکی در طول زمان افزایش می‌یابد: 72 ساعت پس از خوردن گیاه‌خوار، RDPI به طور قابل توجهی افزایش می‌یابد. در مقایسه با گروه کنترل آسیب ندیده، Hj به طور قابل توجهی کاهش یافت، که به دلیل افزایش درجه تخصصی شدن پروفایل متابولیک بود که توسط شاخص δj کمی‌سازی شد. این روند آشکار با پیش‌بینی‌های نظریه OD سازگار است، اما با پیش‌بینی‌های اصلی نظریه MT که معتقد است تغییرات تصادفی (غیرجهت‌دار) در سطح متابولیت‌ها به عنوان یک استتار دفاعی استفاده می‌شود، مغایرت دارد (شکل 1B). اگرچه محتوای الیسیتور ترشح دهانی (OS) و رفتار تغذیه‌ای این دو گیاهخوار متفاوت است، تغذیه مستقیم آنها منجر به تغییرات مشابهی در جهت Hj و δj در طول دوره‌های برداشت 24 ساعته و 72 ساعته شد. تنها تفاوت در 72 ساعت RDPI رخ داد. در مقایسه با آنچه که توسط تغذیه Ms ایجاد شده بود، متابولیسم کلی ناشی از تغذیه Sl بیشتر بود.
(الف) طرح آزمایش: خوک معمولی (S1) یا گیاهخواران متخصص (Ms) با برگ‌های نمک‌زدایی شده گیاهان کوزه‌ای تغذیه می‌شوند، در حالی که برای گیاهخواری شبیه‌سازی شده، از OS (W + OSMs) برای مدیریت سوراخ کردن موقعیت‌های استاندارد برگ زخم استفاده می‌شود. لارو S1 (W + OSSl) یا آب (W + W). کنترل (C) یک برگ آسیب ندیده است. (ب) شاخص القایی (RDPI در مقایسه با نمودار کنترل)، تنوع (شاخص Hj) و تخصص (شاخص δj) که برای نقشه متابولیت ویژه (599 MS/MS؛ فایل داده S1) محاسبه شده است. ستاره‌ها نشان دهنده تفاوت‌های معنی‌دار بین تغذیه مستقیم گیاهخواران و گروه کنترل هستند (آزمون t دانشجویی با آزمون t زوجی، *P<0.05 و ***P<0.001). ns، مهم نیست. (ج) شاخص تفکیک زمانی طیف متابولیت اصلی (کادر آبی، اسید آمینه، اسید آلی و قند؛ فایل داده S2) و طیف متابولیت ویژه (کادر قرمز 443 MS/MS؛ فایل داده S1) پس از تیمار شبیه‌سازی شده گیاهخواری. باند رنگی به فاصله اطمینان 95٪ اشاره دارد. ستاره نشان دهنده تفاوت معنی‌دار بین تیمار و کنترل است [آنالیز واریانس درجه دوم (ANOVA)، و به دنبال آن تفاوت معنی‌دار صادقانه توکی (HSD) برای مقایسه‌های چندگانه پس از عمل، *P<0.05، **P<0.01 و ***P <0.001]. (د) تخصصی شدن نمودارهای پراکندگی و پروفایل‌های متابولیت ویژه (نمونه‌های تکرار شده با تیمارهای مختلف).
برای بررسی اینکه آیا بازسازی القا شده توسط گیاهخواران در سطح متابولوم در تغییرات سطح متابولیت‌های منفرد منعکس می‌شود، ابتدا بر متابولیت‌هایی که قبلاً در برگ‌های Nepenthes pallens با مقاومت اثبات شده در برابر گیاهخواران مورد مطالعه قرار گرفته بودند، تمرکز کردیم. آمیدهای فنلی، ترکیبات هیدروکسی سینامامید-پلی‌آمین هستند که در طول فرآیند گیاهخواری حشرات تجمع می‌یابند و مشخص شده است که عملکرد حشرات را کاهش می‌دهند (32). ما پیش‌سازهای MS/MS مربوطه را جستجو کردیم و منحنی‌های سینتیکی تجمعی آنها را رسم کردیم (شکل S1). جای تعجب نیست که مشتقات فنلی که مستقیماً در دفاع در برابر گیاهخواران دخیل نیستند، مانند اسید کلروژنیک (CGA) و روتین، پس از گیاهخواری کاهش می‌یابند. در مقابل، گیاهخواران می‌توانند فنول آمیدها را بسیار قوی کنند. تغذیه مداوم دو گیاهخوار منجر به تقریباً همان طیف تحریک فنول آمیدها شد و این الگو به ویژه برای سنتز de novo فنول آمیدها آشکار بود. همین پدیده هنگام بررسی مسیر گلیکوزیدهای دی‌ترپن 17-هیدروکسی‌ژرانیل غیرآندیول (17-HGL-DTGs) مشاهده خواهد شد، که تعداد زیادی دی‌ترپن غیرحلقوی با عملکردهای ضد گیاهخواری مؤثر تولید می‌کند (33)، که از بین آنها Ms Feeding با Sl پروفایل بیان مشابهی را ایجاد می‌کند (شکل S1)).
عیب احتمالی آزمایش‌های تغذیه مستقیم گیاه‌خواران، تفاوت در میزان مصرف برگ و زمان تغذیه گیاه‌خواران است که حذف اثرات خاص گیاه‌خواران ناشی از زخم‌ها و گیاه‌خواران را دشوار می‌کند. به منظور حل بهتر ویژگی گونه گیاه‌خوار در پاسخ متابولیکی القا شده برگ، ما تغذیه لاروهای Ms و Sl را با اعمال فوری OS تازه جمع‌آوری شده (OSM و OSS1) به سوراخ استاندارد W در موقعیت‌های ثابت برگ شبیه‌سازی کردیم. این روش، تیمار W + OS نامیده می‌شود و با زمان‌بندی دقیق شروع پاسخ ایجاد شده توسط گیاه‌خواران، بدون ایجاد اثرات مخدوش‌کننده تفاوت در میزان یا مقدار از دست دادن بافت، القا را استاندارد می‌کند (شکل 2A) (34). با استفاده از خط لوله تجزیه و تحلیل و محاسبه MS/MS، 443 طیف MS/MS (فایل داده S1) را بازیابی کردیم که با طیف‌های قبلاً جمع‌آوری شده از آزمایش‌های تغذیه مستقیم همپوشانی داشتند. تحلیل نظریه اطلاعات از این مجموعه داده‌های MS/MS نشان داد که برنامه‌ریزی مجدد متابولوم‌های تخصصی برگ با شبیه‌سازی گیاهخواران، القائات مختص OS را نشان می‌دهد (شکل 2C). به طور خاص، در مقایسه با تیمار OSS1، OSM باعث افزایش تخصص متابولوم در 4 ساعت شد. شایان ذکر است که در مقایسه با مجموعه داده‌های تجربی تغذیه مستقیم گیاهخوار، سینتیک متابولیکی که در فضای دو بعدی با استفاده از Hj و δj به عنوان مختصات تجسم شده و جهت‌گیری تخصص متابولوم در پاسخ به تیمار شبیه‌سازی شده گیاهخواران در طول زمان افزایش می‌یابد، سازگار است (شکل 2D). در همان زمان، ما محتوای اسیدهای آمینه، اسیدهای آلی و قندها (فایل داده S2) را کمی‌سازی کردیم تا بررسی کنیم که آیا این افزایش هدفمند در تخصص متابولوم به دلیل پیکربندی مجدد متابولیسم کربن مرکزی در پاسخ به گیاهخواران شبیه‌سازی شده است یا خیر (شکل S2). برای توضیح بهتر این الگو، سینتیک تجمع متابولیکی مسیرهای فنول‌آمید و 17-HGL-DTG که قبلاً مورد بحث قرار گرفتند را بیشتر بررسی کردیم. القای اختصاصی OS در گیاهخواران به یک الگوی بازآرایی افتراقی در متابولیسم فنول‌آمید تبدیل می‌شود (شکل S3). آمیدهای فنولیک حاوی بخش‌های کومارین و کافئوئیل ترجیحاً توسط OSS1 القا می‌شوند، در حالی که OSMها القای اختصاصی کونژوگه‌های فرولیل را آغاز می‌کنند. برای مسیر 17-HGL-DTG، القای افتراقی OS توسط محصولات مالونیلاسیون و دی‌مالونیلاسیون در پایین‌دست شناسایی شد (شکل S3).
در مرحله بعد، ما انعطاف‌پذیری رونویسی القا شده توسط OS را با استفاده از مجموعه داده‌های ریزآرایه دوره زمانی بررسی کردیم، که استفاده از OSMها را برای درمان برگ‌های گیاه رزت در گیاهخواران شبیه‌سازی می‌کند. سینتیک نمونه‌برداری اساساً با سینتیک مورد استفاده در این مطالعه متابولومیکس همپوشانی دارد (35). در مقایسه با پیکربندی مجدد متابولوم که در آن انعطاف‌پذیری متابولیکی به طور خاص با گذشت زمان افزایش می‌یابد، ما انفجارهای رونویسی گذرا را در برگ‌های القا شده توسط Ms مشاهده می‌کنیم، که در آن القاپذیری رونویسی (RDPI) و تخصص (δj) در 1 هستند. افزایش قابل توجهی در ساعت‌ها و تنوع (Hj) در این نقطه زمانی وجود داشت، بیان BMP1 به طور قابل توجهی کاهش یافت و به دنبال آن آرامش تخصص رونویسی (شکل S4) رخ داد. خانواده‌های ژن متابولیک (مانند P450، گلیکوزیل ترانسفراز و آسیل ترانسفراز BAHD) در فرآیند مونتاژ متابولیت‌های ویژه از واحدهای ساختاری مشتق شده از متابولیسم اولیه، طبق مدل تخصص بالای اولیه ذکر شده، شرکت می‌کنند. به عنوان یک مطالعه موردی، مسیر فنیل‌آلانین مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تجزیه و تحلیل تأیید کرد که ژن‌های اصلی در متابولیسم فنول‌آمید در گیاهخواران در مقایسه با گیاهان غیرجذب‌شده، به شدت تحت تأثیر OS هستند و الگوهای بیان آنها با هم بسیار هماهنگ است. فاکتور رونویسی MYB8 و ژن‌های ساختاری PAL1، PAL2، C4H و 4CL در بالادست این مسیر، شروع زودهنگام رونویسی را نشان دادند. آسیل‌ترانسفرازهایی که در مونتاژ نهایی فنول‌آمید نقش دارند، مانند AT1، DH29 و CV86، الگوی افزایش بیان طولانی‌مدتی را نشان می‌دهند (شکل S4). مشاهدات فوق نشان می‌دهد که شروع زودهنگام تخصص رونویسی و افزایش بعدی تخصص متابولومیکس، یک حالت جفت‌شده هستند که ممکن است به دلیل سیستم تنظیمی همزمان باشد که یک پاسخ دفاعی قدرتمند را آغاز می‌کند.
پیکربندی مجدد در سیگنالینگ هورمون‌های گیاهی به عنوان یک لایه تنظیمی عمل می‌کند که اطلاعات گیاه‌خواری را برای برنامه‌ریزی مجدد فیزیولوژی گیاهان ادغام می‌کند. پس از شبیه‌سازی گیاه‌خواری، ما دینامیک تجمعی دسته‌های کلیدی هورمون‌های گیاهی را اندازه‌گیری کردیم و بیان همزمان زمانی بین آنها را تجسم کردیم [ضریب همبستگی پیرسون (PCC)> 0.4] (شکل 3A). همانطور که انتظار می‌رفت، هورمون‌های گیاهی مرتبط با بیوسنتز در شبکه بیان همزمان هورمون‌های گیاهی مرتبط هستند. علاوه بر این، ویژگی متابولیکی (شاخص Si) در این شبکه ترسیم شده است تا هورمون‌های گیاهی القا شده توسط تیمارهای مختلف را برجسته کند. دو ناحیه اصلی پاسخ ویژه گیاه‌خواری ترسیم شده است: یکی در خوشه JA است، جایی که JA (شکل بیولوژیکی فعال آن JA-Ile) و سایر مشتقات JA بالاترین امتیاز Si را نشان می‌دهند. دیگری اتیلن (ET) است. جیبرلین تنها افزایش متوسطی در ویژگی گیاه‌خواری نشان داد، در حالی که سایر هورمون‌های گیاهی، مانند سیتوکینین، اکسین و اسید آبسیزیک، ویژگی القایی پایینی برای گیاه‌خواران داشتند. در مقایسه با استفاده از W + W به تنهایی، تقویت مقدار پیک مشتقات JA از طریق کاربرد OS (W + OS) اساساً می‌تواند به یک شاخص اختصاصی قوی برای JAها تبدیل شود. به طور غیرمنتظره‌ای، OSM و OSS1 با محتوای الیسیتور متفاوت، باعث تجمع مشابه JA و JA-Ile می‌شوند. برخلاف OSS1، OSM به طور خاص و قوی توسط OSMها القا می‌شود، در حالی که OSS1 پاسخ زخم‌های پایه را تقویت نمی‌کند (شکل 3B).
(الف) تحلیل شبکه بیان همزمان بر اساس محاسبه PCC شبیه‌سازی سینتیک تجمع هورمون گیاهی القا شده توسط گیاهخوار. گره نشان دهنده یک هورمون گیاهی واحد است و اندازه گره نشان دهنده شاخص Si مختص هورمون گیاهی بین تیمارها است. (ب) تجمع JA، JA-Ile و ET در برگ‌ها ناشی از تیمارهای مختلف که با رنگ‌های مختلف نشان داده شده‌اند: زردآلویی، W + OSM؛ آبی، W + OSSl؛ سیاه، W + W؛ خاکستری، C (کنترل). ستاره‌ها تفاوت‌های معنی‌دار بین تیمار و کنترل را نشان می‌دهند (ANOVA دو طرفه و به دنبال آن مقایسه چندگانه Tukey HSD post hoc، *** P <0.001). تحلیل نظریه اطلاعات (C)697 MS/MS (فایل داده S1) در بیوسنتز JA و طیف ادراک مختل شده (irAOC و irCOI1) و (D)585 MS/MS (فایل داده S1) در ETR1 با سیگنال ET مختل شده. دو تیمار گیاهخوار شبیه‌سازی شده باعث تحریک خطوط گیاهی و گیاهان کنترل وسیله نقلیه خالی (EV) شدند. ستاره‌ها نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار بین تیمار W+OS و کنترل سالم هستند (ANOVA دوطرفه و به دنبال آن مقایسه چندگانه Tukey HSD post hoc، *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001). (E) نمودارهای پراکنده از مخالفت پراکنده با تخصصی شدن. رنگ‌ها نشان‌دهنده سویه‌های مختلف اصلاح‌شده ژنتیکی هستند؛ نمادها نشان‌دهنده روش‌های مختلف تیمار هستند: مثلث، W + OSS1؛ مستطیل، W + OSM؛ دایره C
در مرحله بعد، ما از یک سویه اصلاح‌شده ژنتیکی از نپنتس‌های ضعیف‌شده (irCOI1 و sSETR1) در مراحل کلیدی بیوسنتز JA و ET (irAOC و irACO) و ادراک (irCOI1 و sSETR1) برای تجزیه و تحلیل متابولیسم این دو هورمون گیاهی بر روی گیاهخواران استفاده می‌کنیم. سهم نسبی برنامه‌ریزی مجدد. مطابق با آزمایش‌های قبلی، ما القای OS گیاهخواری را در گیاهان حامل خالی (EV) (شکل 3، C تا D) و کاهش کلی شاخص Hj ناشی از OSM را تأیید کردیم، در حالی که شاخص δj افزایش یافت. پاسخ برجسته‌تر از پاسخ ایجاد شده توسط OSS1 است. یک نمودار دو خطی با استفاده از Hj و δj به عنوان مختصات، تنظیم‌زدایی خاص را نشان می‌دهد (شکل 3E). بارزترین روند این است که در سویه‌های فاقد سیگنال JA، تنوع متابولوم و تغییرات تخصصی ناشی از گیاهخواران تقریباً به طور کامل از بین می‌رود (شکل 3C). در مقابل، درک خاموش ET در گیاهان sSETR1، اگرچه تأثیر کلی آن بر تغییرات متابولیسم گیاهخواران بسیار کمتر از سیگنالینگ JA است، اما تفاوت در شاخص‌های Hj و δj بین تحریکات OSM و OSS1 را کاهش می‌دهد (شکل 3D و شکل S5). این نشان می‌دهد که علاوه بر عملکرد اصلی انتقال سیگنال JA، انتقال سیگنال ET همچنین به عنوان تنظیم دقیق پاسخ متابولیکی خاص گونه گیاهخواران عمل می‌کند. مطابق با این عملکرد تنظیم دقیق، هیچ تغییری در القاپذیری کلی متابولوم در گیاهان sSETR1 وجود نداشت. از سوی دیگر، در مقایسه با گیاهان sSETR1، گیاهان irACO دامنه کلی مشابهی از تغییرات متابولیکی ناشی از گیاهخواران را القا کردند، اما نمرات Hj و δj به طور قابل توجهی بین چالش‌های OSM و OSS1 متفاوت نشان دادند (شکل S5).
به منظور شناسایی متابولیت‌های تخصصی که سهم مهمی در پاسخ ویژه گونه‌های گیاهخواران دارند و تنظیم دقیق تولید آنها از طریق سیگنال‌های ET، ما از روش ساختاری MS/MS که قبلاً توسعه داده شده بود، استفاده کردیم. این روش برای استنتاج مجدد خانواده متابولیک از قطعات MS/MS [حاصلضرب نقطه‌ای نرمال شده (NDP)] و امتیاز شباهت بر اساس اتلاف خنثی (NL) به روش خوشه‌بندی دوگانه متکی است. مجموعه داده‌های MS/MS که از طریق تجزیه و تحلیل لاین‌های تراریخته ET ساخته شده است، 585 MS/MS (فایل داده S1) تولید کرد که با خوشه‌بندی آنها در هفت ماژول اصلی MS/MS (M) (شکل 4A) حل شد. برخی از این ماژول‌ها به طور متراکم با متابولیت‌های ویژه‌ای که قبلاً مشخص شده‌اند، پر شده‌اند: به عنوان مثال، M1، M2، M3، M4 و M7 سرشار از مشتقات مختلف فنل (M1)، گلیکوزیدهای فلاونوئید (M2)، قندهای آسیل (M3 و M4) و 17-HGL-DTG (M7) هستند. علاوه بر این، اطلاعات ویژه متابولیکی (شاخص Si) یک متابولیت واحد در هر ماژول محاسبه می‌شود و توزیع Si آن به صورت شهودی قابل مشاهده است. به طور خلاصه، طیف‌های MS/MS که گیاهخواری و ویژگی ژنوتیپی بالایی را نشان می‌دهند، با مقادیر بالای Si مشخص می‌شوند و آماره‌های کشیدگی، توزیع خز را در گوشه دم سمت راست نشان می‌دهند. یکی از این توزیع‌های کلوئیدی لاغر در M1 شناسایی شد که در آن فنل آمید بالاترین بخش Si را نشان داد (شکل 4B). 17-HGL-DTG القایی گیاهخوار که قبلاً ذکر شد در M7 امتیاز Si متوسطی را نشان داد که نشان‌دهنده درجه متوسطی از تنظیم افتراقی بین دو نوع OS است. در مقابل، اکثر متابولیت‌های تخصصی تولید شده به صورت ساختاری، مانند روتین، CGA و قندهای آسیل، از پایین‌ترین امتیازهای Si هستند. به منظور بررسی بهتر پیچیدگی ساختاری و توزیع Si بین متابولیت‌های ویژه، یک شبکه مولکولی برای هر ماژول ساخته شد (شکل 4B). یک پیش‌بینی مهم نظریه OD (خلاصه شده در شکل 1B) این است که سازماندهی مجدد متابولیت‌های ویژه پس از گیاهخواری باید منجر به تغییرات یک طرفه در متابولیت‌هایی با ارزش دفاعی بالا شود، به ویژه با افزایش اختصاصیت آنها (برخلاف توزیع تصادفی). حالت) متابولیت دفاعی پیش‌بینی شده توسط نظریه MT. بیشتر مشتقات فنلی انباشته شده در M1 از نظر عملکردی با کاهش عملکرد حشرات مرتبط هستند (32). هنگام مقایسه مقادیر Si در متابولیت‌های M1 بین برگ‌های القا شده و برگ‌های تشکیل دهنده گیاهان کنترل EV در 24 ساعت، مشاهده کردیم که اختصاصیت متابولیکی بسیاری از متابولیت‌ها پس از حشرات گیاهخوار روند افزایشی قابل توجهی دارد (شکل 4C). افزایش اختصاصیت در مقدار Si فقط در فنولامیدهای دفاعی مشاهده شد، اما هیچ افزایشی در مقدار Si در سایر فنول‌ها و متابولیت‌های ناشناخته موجود در این ماژول مشاهده نشد. این یک مدل تخصصی است که با نظریه OD مرتبط است. پیش‌بینی‌های اصلی تغییرات متابولیکی ناشی از گیاهخواران سازگار است. برای آزمایش اینکه آیا این ویژگی طیف فنول‌آمید توسط ET اختصاصی OS القا شده است یا خیر، شاخص متابولیت Si را رسم کردیم و یک مقدار بیان متفاوت بین OSM و OSS1 در ژنوتیپ‌های EV و sSETR1 ایجاد کردیم (شکل 4D). در sSETR1، تفاوت القا شده توسط فنول‌آمید بین OSM و OSS1 تا حد زیادی کاهش یافت. روش خوشه‌بندی دوگانه همچنین بر روی داده‌های MS/MS جمع‌آوری‌شده در سویه‌هایی با JA ناکافی برای استنباط ماژول‌های اصلی MS/MS مربوط به تخصص متابولیکی تنظیم‌شده توسط JA اعمال شد (شکل S6).
(الف) نتایج خوشه‌بندی 585 MS/MS بر اساس قطعه مشترک (شباهت NDP) و از دست دادن خنثی مشترک (شباهت NL) منجر به سازگاری ماژول (M) با خانواده ترکیبات شناخته شده یا با ترکیب متابولیت ناشناخته یا متابولیزه نشده ضعیف می‌شود. در کنار هر ماژول، توزیع اختصاصی متابولیت (MS/MS) (Si) نشان داده شده است. (ب) شبکه مولکولی مدولار: گره‌ها نشان‌دهنده MS/MS و لبه‌ها، NDP (قرمز) و NL (آبی) نمرات MS/MS (حد آستانه، > 0.6) هستند. شاخص اختصاصی متابولیت درجه‌بندی شده (Si) بر اساس ماژول (چپ) رنگ‌آمیزی شده و به شبکه مولکولی (راست) نگاشت شده است. (ج) ماژول M1 گیاه EV در حالت پایدار (کنترل) و القایی (گیاهخوار شبیه‌سازی شده) در 24 ساعت: نمودار شبکه مولکولی (مقدار Si اندازه گره است، فنول آمید دفاعی با رنگ آبی برجسته شده است). (د) نمودار شبکه مولکولی M1 از خط طیف sSETR1 با اختلال در درک EV و ET: ترکیب فنلی که توسط گره دایره سبز نشان داده شده است، و تفاوت معنی‌دار (مقدار P) بین تیمارهای W + OSM و W + OSS1 به عنوان اندازه گره. CP، N-کافئوئیل-تیروزین؛ CS، N-کافئوئیل-اسپرمیدین؛ FP، N-فرولیک اسید استر-اوریک اسید؛ FS، N-فرولیل-اسپرمیدین؛ CoP، N'، N "-کومارولیل-تیروزین؛ DCS، N'، N"-دی کافئوئیل-اسپرمیدین؛ CFS، N'، N"-کافئوئیل، فرولوئیل-اسپرمیدین؛ Lycium barbarum در wolfberry Son؛ Nick. O-AS، O-acyl sugar.
ما تجزیه و تحلیل را از یک ژنوتیپ ضعیف شده نپنتس به جمعیت‌های طبیعی گسترش دادیم، جایی که تغییرات درون گونه‌ای قوی در سطوح JA گیاهخواران و سطوح متابولیت‌های خاص قبلاً در جمعیت‌های طبیعی توصیف شده است (26). از این مجموعه داده‌ها برای پوشش 43 ژرم پلاسم استفاده کنید. این ژرم پلاسم‌ها شامل 123 گونه گیاهی از N. pallens هستند. این گیاهان از بذرهای جمع‌آوری شده در زیستگاه‌های بومی مختلف در یوتا، نوادا، آریزونا و کالیفرنیا گرفته شده‌اند (شکل S7)، ما تنوع متابولوم (که در اینجا سطح جمعیت نامیده می‌شود) (تنوع β) و تخصص ناشی از OSM را محاسبه کردیم. مطابق با مطالعات قبلی، ما طیف گسترده‌ای از تغییرات متابولیکی را در امتداد محورهای Hj و δj مشاهده کردیم، که نشان می‌دهد ژرم پلاسم‌ها تفاوت‌های قابل توجهی در انعطاف‌پذیری پاسخ‌های متابولیکی خود به گیاهخواران دارند (شکل S7). این سازماندهی یادآور مشاهدات قبلی در مورد دامنه پویای تغییرات JA ناشی از گیاهخواران است و مقدار بسیار بالایی را در یک جمعیت واحد حفظ کرده است (26، 36). با استفاده از JA و JA-Ile برای آزمایش همبستگی کلی سطح بین Hj و δj، دریافتیم که همبستگی مثبت معنی‌داری بین JA و شاخص تنوع و تخصص متابولوم β وجود دارد (شکل S7). این نشان می‌دهد که ناهمگونی ناشی از گیاهخواری در القای JAهای شناسایی شده در سطح جمعیت ممکن است به دلیل پلی‌مورفیسم‌های متابولیکی کلیدی ناشی از انتخاب از بین گیاهخواران حشره باشد.
مطالعات قبلی نشان داده‌اند که انواع تنباکو از نظر نوع و وابستگی نسبی به دفاع‌های متابولیکی القایی و ساختاری تفاوت زیادی دارند. اعتقاد بر این است که این تغییرات در انتقال سیگنال ضد گیاهخواری و قابلیت‌های دفاعی توسط فشار جمعیت حشرات، چرخه زندگی گیاه و هزینه‌های تولید دفاعی در زیستگاهی که یک گونه خاص در آن رشد می‌کند، تنظیم می‌شود. ما ثبات بازسازی متابولوم برگ القا شده توسط گیاهخواران شش گونه نیکوتیانا بومی آمریکای شمالی و آمریکای جنوبی را مطالعه کردیم. این گونه‌ها ارتباط نزدیکی با نپنتس آمریکای شمالی، یعنی نیکولاس بوسیفلو، دارند. La، N. nicotinis، Nicotiana n. علف ضعیف شده، Nicotiana tabacum، تنباکوی خطی، تنباکو (Nicotiana spegazzinii) و تنباکوی برگ تنباکو (Nicotiana obtusifolia) (شکل 5A) (37). شش مورد از این گونه‌ها، از جمله گونه شناخته شده N. please، گیاهان یک ساله از کلاد اطلسی هستند و obtusifolia N. گیاهان چند ساله از کلاد خواهر Trigonophyllae هستند (38). متعاقباً، القای W + W، W + OSM و W + OSS1 روی این هفت گونه انجام شد تا بازآرایی متابولیکی تغذیه حشرات در سطح گونه مورد مطالعه قرار گیرد.
(الف) یک درخت فیلوژنتیک بوت‌استرپ بر اساس حداکثر درستنمایی [برای سنتز گلوتامین هسته‌ای (38)] و توزیع جغرافیایی هفت گونه‌ی نزدیک به هم از جنس نیکوتینا (رنگ‌های مختلف) (37). (ب) یک نمودار پراکندگی از تنوع تخصصی برای پروفایل‌های متابولیکی هفت گونه‌ی نیکوتینا (939 MS/MS؛ فایل داده S1). در سطح گونه، تنوع متابولوم با درجه‌ی تخصص همبستگی منفی دارد. تجزیه و تحلیل همبستگی سطح گونه بین تنوع متابولیکی و تخصص و تجمع JA در شکل 2 نشان داده شده است. S9. رنگ، انواع مختلف؛ مثلث، W + OSS1؛ مستطیل، W + OSM؛ (ج) دینامیک‌های JA و JA-Ile در نیکوتینا بر اساس دامنه‌ی تحریک OS رتبه‌بندی می‌شوند (ANOVA دوطرفه و مقایسه‌ی چندگانه‌ی Tukey HSD، * P <0.05، ** P <0.01 و * ** برای مقایسه‌ی W + OS و W + W، P <0.001). نمودار جعبه‌ای (D) تنوع و (E) تخصص هر گونه پس از شبیه‌سازی گیاه‌خواری و متیل JA (MeJA). علامت ستاره نشان‌دهنده تفاوت معنی‌دار بین W + OS و W + W یا لانولین به‌علاوه W (Lan + W) یا Lan به‌علاوه MeJA (Lan + MeJa) و کنترل Lan است (آنالیز واریانس دوطرفه، و به دنبال آن مقایسه چندگانه پس‌آزمون Tukey's HSD، *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001).
با استفاده از روش خوشه‌ای دوگانه، 9 ماژول از 939 MS/MS (فایل داده S1) را شناسایی کردیم. ترکیب MS/MS که توسط تیمارهای مختلف پیکربندی مجدد شده است، در بین ماژول‌های مختلف بین گونه‌ها بسیار متفاوت است (شکل S8). تجسم Hj (که در اینجا به عنوان تنوع γ در سطح گونه نامیده می‌شود) و δj نشان می‌دهد که گونه‌های مختلف در فضای متابولیکی در گروه‌های بسیار متفاوتی جمع می‌شوند، جایی که تقسیم در سطح گونه معمولاً برجسته‌تر از تحریک است. به استثنای N. linear و N. obliquus، آنها طیف دینامیکی گسترده‌ای از اثرات القایی را نشان می‌دهند (شکل 5B). در مقابل، گونه‌هایی مانند N. purpurea و N. obtusifolia پاسخ متابولیکی کمتری به تیمار دارند، اما متابولوم متنوع‌تر است. توزیع اختصاصی گونه از پاسخ متابولیکی القایی منجر به همبستگی منفی معنی‌داری بین تخصص و تنوع گاما شد (PCC = -0.46، P = 4.9×10-8). تغییرات ناشی از OS در سطوح JAها با تخصص متابولوم همبستگی مثبت و با تنوع گامای متابولیکی نشان داده شده توسط هر گونه همبستگی منفی دارد (شکل 5B و شکل S9). شایان ذکر است که گونه‌هایی که در شکل 5C به صورت محاوره‌ای به عنوان گونه‌های "پاسخ‌دهنده به سیگنال" شناخته می‌شوند، مانند نماتدهای Nepenthes، Nepenthes nepenthes، Nepenthes acute و Nepenthes attenuated، در 30 دقیقه علائم قابل توجهی ایجاد کردند. شیوع اخیر JA و JA-Ile مختص OS، در حالی که سایر باکتری‌هایی که "بدون پاسخ به سیگنال" نامیده می‌شوند، مانند Nepenthes mills، Nepenthes powdery و N. obtusifolia، فقط القای JA-Ile Edge را بدون هیچ گونه اختصاصیت OS نشان می‌دهند (شکل 5C). در سطح متابولیک، همانطور که در بالا ذکر شد، برای Nepenthes ضعیف شده، مواد پاسخ‌دهنده به سیگنال، اختصاصیت OS را نشان دادند و δj را به طور قابل توجهی افزایش دادند، در حالی که Hj را کاهش دادند. این اثر آغازگری ویژه OS در گونه‌هایی که به عنوان گونه‌های غیر واکنشی به سیگنال طبقه‌بندی شده‌اند، مشاهده نشد (شکل 5، D و E). متابولیت‌های ویژه OS بیشتر بین گونه‌های پاسخ‌دهنده به سیگنال به اشتراک گذاشته می‌شوند و این خوشه‌های سیگنال با گونه‌هایی با پاسخ‌های سیگنال ضعیف‌تر خوشه‌بندی می‌شوند، در حالی که گونه‌هایی با پاسخ‌های سیگنال ضعیف‌تر وابستگی متقابل کمتری نشان می‌دهند (شکل S8). این نتیجه نشان می‌دهد که القای JAهای ویژه OS و پیکربندی مجدد متابولوم پایین‌دست ویژه OS در سطح گونه با هم مرتبط هستند.
در مرحله بعد، ما از خمیر لانولین حاوی متیل JA (MeJA) برای تیمار گیاهان استفاده کردیم تا بررسی کنیم که آیا این حالت‌های جفت شدن توسط در دسترس بودن JA اعمال شده توسط JA خارجی که در سیتوپلاسم گیاهان خواهد بود، محدود می‌شوند یا خیر. دی‌استری شدن سریع JA است. ما همان روند تغییر تدریجی از گونه‌های پاسخ‌دهنده به سیگنال به گونه‌های غیرپاسخ‌دهنده به سیگنال را که ناشی از تأمین مداوم JA است، یافتیم (شکل 5، D و E). به طور خلاصه، تیمار MeJA متابولوم‌های نماتدهای خطی، N. obliquus، N. aquaticus، N. pallens و N. mikimotoi را به شدت برنامه‌ریزی مجدد کرد و منجر به افزایش قابل توجه δj و کاهش Hj شد. N. purpurea فقط افزایش δj را نشان داد، اما Hj را نشان نداد. N. obtusifolia، که قبلاً نشان داده شده است که سطوح بسیار کمی از JA را تجمع می‌دهد، نیز از نظر پیکربندی مجدد متابولوم به تیمار MeJA پاسخ ضعیفی می‌دهد. این نتایج نشان می‌دهد که تولید JA یا انتقال سیگنال در گونه‌های بدون پاسخ به سیگنال از نظر فیزیولوژیکی محدود است. برای آزمایش این فرضیه، ما چهار گونه (N. pallens، N. mills، N. pink و N. microphylla) القا شده توسط W + W، W + OSMs و W + OSS1 Transcriptome را مطالعه کردیم (39). مطابق با الگوی بازسازی متابولوم، گونه‌ها در فضای ترانسکریپتوم به خوبی از هم جدا شده‌اند، که در میان آنها N. attenuated بالاترین RDPI القا شده توسط OS را نشان داد، در حالی که N. gracilis کمترین آن را داشت (شکل 6A). با این حال، مشخص شد که تنوع ترانسکریپتوم القا شده توسط N. oblonga در بین چهار گونه کمترین بود، برخلاف بالاترین تنوع متابونومی N. oblonga که قبلاً در هفت گونه نشان داده شده بود. مطالعات قبلی نشان داده است که مجموعه‌ای از ژن‌های مرتبط با سیگنال‌های دفاعی اولیه، از جمله سیگنال‌های JA، ویژگی پاسخ‌های دفاعی اولیه القا شده توسط محرک‌های مرتبط با گیاهخواران را در گونه‌های Nicotiana توضیح می‌دهد (39). مقایسه مسیرهای سیگنالینگ JA بین این چهار گونه، الگوی جالبی را نشان داد (شکل 6B). اکثر ژن‌های این مسیر، مانند AOC، OPR3، ACX و COI1، سطوح نسبتاً بالایی از القا را در این چهار گونه نشان دادند. با این حال، یک ژن کلیدی، JAR4، JA را به شکل فعال بیولوژیکی رونوشت‌های انباشته شده JA-Ile تبدیل می‌کند و سطح رونویسی آن بسیار پایین است، به خصوص در N. mills، Nepenthes pieris و N. microphylla. علاوه بر این، تنها رونوشت ژن دیگر AOS در N. bifidum شناسایی نشد. این تغییرات در بیان ژن ممکن است مسئول فنوتیپ‌های شدید ناشی از تولید کم JA در گونه‌های سیگنال آنرژیک و القای N. gracilis باشد.
(الف) تحلیل نظریه اطلاعات از برنامه‌ریزی مجدد پاسخ‌های رونویسی اولیه چهار گونه تنباکوی نزدیک به هم که 30 دقیقه پس از القای گیاهخواری نمونه‌برداری شده‌اند. RDPI با مقایسه برگ‌های القا شده توسط OS گیاهخوار با کنترل زخم محاسبه می‌شود. رنگ‌ها گونه‌های مختلف و نمادها روش‌های مختلف درمان را نشان می‌دهند. (ب) تحلیل بیان ژن در مسیرهای سیگنالینگ JA در بین چهار گونه. مسیر ساده شده JA در کنار نمودار جعبه‌ای نشان داده شده است. رنگ‌های مختلف روش‌های مختلف پردازش را نشان می‌دهند. ستاره نشان می‌دهد که تفاوت معنی‌داری بین تیمار W + OS و کنترل W + W وجود دارد (برای آزمون t استیودنت برای تفاوت‌های جفتی، *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001). OPDA، 12-اکسوفیتودی‌انوئیک اسید؛ OPC-8: 0،3-اکسو-2(2′(Z)-پنتنیل)-سیکلوپنتان-1-اکتانوئیک اسید.
در بخش آخر، ما بررسی کردیم که چگونه بازسازی اختصاصی گونه‌های حشرات از متابولوم گونه‌های مختلف گیاهی می‌تواند در برابر گیاهخواران مقاوم باشد. تحقیقات قبلی بر جنس نیکوتینا تأکید داشتند. مقاومت آنها در برابر Ms و لاروها بسیار متفاوت است (40). در اینجا، ما ارتباط بین این مدل و انعطاف‌پذیری متابولیکی آنها را بررسی کردیم. با استفاده از چهار گونه تنباکوی فوق و آزمایش همبستگی بین تنوع و تخصص متابولوم ناشی از گیاهخواران و مقاومت گیاهان در برابر Ms و Sl، دریافتیم که مقاومت، تنوع و تخصص به Sl عمومی همبستگی مثبت دارند، در حالی که همبستگی بین مقاومت به Ms متخصص و تخصص ضعیف است و همبستگی با تنوع معنی‌دار نیست (شکل S10). در مورد مقاومت S1، هر دو گونه ضعیف شده N. chinensis و N. gracilis، که قبلاً نشان داده شده بود که هم سطح انتقال سیگنال JA و هم انعطاف‌پذیری متابولوم را نشان می‌دهند، پاسخ‌های بسیار متفاوتی به القای گیاهخواری داشتند و همچنین مقاومت بالای مشابهی نشان دادند. جنسیت.
در شصت سال گذشته، نظریه دفاع گیاهی چارچوبی نظری ارائه داده است که بر اساس آن محققان تعداد قابل توجهی از تکامل و عملکردهای متابولیت‌های تخصصی گیاهی را پیش‌بینی کرده‌اند. اکثر این نظریه‌ها از رویه معمول استنتاج‌های قوی پیروی نمی‌کنند (41). آنها پیش‌بینی‌های کلیدی (3) را در همان سطح تحلیل پیشنهاد می‌دهند. هنگامی که آزمایش پیش‌بینی‌های کلیدی امکان تحلیل نظریه‌های خاص را فراهم می‌کند، این امر باعث می‌شود که این حوزه به جلو حرکت کند. مورد حمایت قرار گیرد، اما دیگران رد شوند (42). در عوض، نظریه جدید پیش‌بینی‌هایی را در سطوح مختلف تحلیل انجام می‌دهد و لایه جدیدی از ملاحظات توصیفی را اضافه می‌کند (42). با این حال، دو نظریه ارائه شده در سطح عملکردی، MT و OD، را می‌توان به راحتی به عنوان پیش‌بینی‌های مهم تغییرات متابولیک تخصصی ناشی از گیاهخواران توضیح داد: نظریه OD معتقد است که تغییرات در "فضای" متابولیک تخصصی بسیار جهت‌دار هستند. نظریه MT معتقد است که این تغییرات غیر جهت‌دار و به طور تصادفی در فضای متابولیک قرار می‌گیرند و تمایل به داشتن متابولیت‌های با ارزش دفاعی بالا دارند. بررسی‌های قبلی پیش‌بینی‌های OD و MT با استفاده از مجموعه محدودی از ترکیبات "دفاعی" پیشینی آزمایش شده‌اند. این آزمایش‌های متابولیت‌محور، امکان تجزیه و تحلیل میزان و مسیر بازپیکربندی متابولوم در طول گیاهخواری را از بین می‌برند و اجازه آزمایش در یک چارچوب آماری منسجم را نمی‌دهند که نیاز به پیش‌بینی‌های کلیدی داشته باشد که بتوان آنها را به عنوان یک کل در نظر گرفت. تغییرات کمی در متابولوم گیاه را تعیین کنید. در اینجا، ما از فناوری نوآورانه در متابولومیکس مبتنی بر MS محاسباتی استفاده کردیم و تجزیه و تحلیل MS دکانولوشن را در جریان کلی توصیفگرهای نظریه اطلاعات انجام دادیم تا تمایز بین دو مورد پیشنهادی در سطح متابولومیکس جهانی را آزمایش کنیم. پیش‌بینی کلیدی این نظریه. نظریه اطلاعات در بسیاری از زمینه‌ها، به ویژه در زمینه تنوع زیستی و تحقیقات جریان مواد مغذی (43) اعمال شده است. با این حال، تا آنجا که ما می‌دانیم، این اولین کاربردی است که برای توصیف فضای اطلاعات متابولیکی گیاهان و حل مشکلات اکولوژیکی مربوط به تغییرات متابولیکی موقت در پاسخ به نشانه‌های محیطی استفاده می‌شود. به طور خاص، توانایی این روش در توانایی آن در مقایسه الگوهای درون و بین گونه‌های گیاهی برای بررسی چگونگی تکامل گیاهخواران از گونه‌های مختلف به الگوهای تکاملی کلان بین گونه‌ای در سطوح مختلف تکامل نهفته است. متابولیسم.
تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) یک مجموعه داده چند متغیره را به یک فضای کاهش ابعاد تبدیل می‌کند تا روند اصلی داده‌ها قابل توضیح باشد، بنابراین معمولاً به عنوان یک تکنیک اکتشافی برای تجزیه مجموعه داده‌ها، مانند متابولوم دکانولوشن، استفاده می‌شود. با این حال، کاهش ابعاد بخشی از محتوای اطلاعات در مجموعه داده‌ها را از دست می‌دهد و PCA نمی‌تواند اطلاعات کمی در مورد ویژگی‌هایی که به طور خاص به نظریه اکولوژیکی مربوط می‌شوند، ارائه دهد، مانند: چگونه گیاهخواران تنوع را در زمینه‌های تخصصی (به عنوان مثال، غنا، توزیع) و فراوانی متابولیت‌ها پیکربندی مجدد می‌کنند؟ کدام متابولیت‌ها پیش‌بینی‌کننده وضعیت القایی یک گیاهخوار خاص هستند؟ از منظر ویژگی، تنوع و القاپذیری، محتوای اطلاعات پروفایل متابولیت‌های خاص برگ تجزیه می‌شود و مشخص می‌شود که خوردن گیاهخواران می‌تواند متابولیسم خاصی را فعال کند. به طور غیرمنتظره‌ای، مشاهده کردیم که همانطور که در شاخص‌های نظریه اطلاعات اجرا شده توضیح داده شده است، وضعیت متابولیکی حاصل پس از حملات دو گیاهخوار (Sl عمومی‌خوار شب‌زی) و متخصص Solanaceae، خانم، همپوشانی زیادی دارد. اگرچه رفتار تغذیه‌ای و غلظت آنها به طور قابل توجهی متفاوت است. آغازگر مزدوج اسید چرب-اسید آمینه (FAC) در OS (31). با استفاده از OS گیاهخوار برای درمان زخم‌های سوراخ استاندارد، درمان گیاهخوار شبیه‌سازی شده نیز روند مشابهی را نشان داد. این روش استاندارد برای شبیه‌سازی پاسخ گیاهان به حملات گیاهخواران، عوامل مخدوش‌کننده ناشی از تغییرات در رفتار غذایی گیاهخواران را که منجر به درجات مختلفی از آسیب در زمان‌های مختلف می‌شود، حذف می‌کند (34). FAC که به عنوان عامل اصلی OSM شناخته می‌شود، JAS و سایر پاسخ‌های هورمون گیاهی را در OSS1 کاهش می‌دهد، در حالی که OSS1 صدها برابر کاهش می‌یابد (31). با این حال، OSS1 در مقایسه با OSM باعث سطوح مشابهی از تجمع JA شد. پیش از این نشان داده شده است که پاسخ JA در نپنتس‌های ضعیف‌شده به OSM بسیار حساس است، جایی که FAC می‌تواند فعالیت خود را حتی اگر با آب به نسبت 1:1000 رقیق شود، حفظ کند (44). بنابراین، در مقایسه با OSM، اگرچه FAC در OSS1 بسیار کم است، اما برای القای شیوع JA کافی است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که پروتئین‌های پورین‌مانند (45) و الیگوساکاریدها (46) می‌توانند به عنوان سرنخ‌های مولکولی برای تحریک پاسخ‌های دفاعی گیاه در OSS1 استفاده شوند. با این حال، هنوز مشخص نیست که آیا این الیسیتورها در OSS1 مسئول تجمع JA مشاهده شده در مطالعه حاضر هستند یا خیر.
اگرچه مطالعات کمی وجود دارد که اثر انگشت‌های متابولیکی افتراقی ناشی از کاربرد گیاهخواران مختلف یا JA یا SA (اسید سالیسیلیک) خارجی را توصیف می‌کند (47)، اما هیچ کس اختلال خاص گونه‌های گیاهخوار در شبکه علف‌های گیاهی و اثرات آن بر اطلاعات شخصی خاص را بررسی نکرده است. تأثیر کلی متابولیسم به طور سیستماتیک مورد مطالعه قرار گرفته است. این تجزیه و تحلیل همچنین تأیید کرد که ارتباط شبکه هورمونی داخلی با سایر هورمون‌های گیاهی غیر از JAها، ویژگی سازماندهی مجدد متابولیکی ناشی از گیاهخواران را شکل می‌دهد. به طور خاص، ما تشخیص دادیم که ET ناشی از OSM به طور قابل توجهی بیشتر از OSS1 است. این حالت با محتوای FAC بیشتر در OSM سازگار است، که شرط لازم و کافی برای ایجاد انفجار ET است (48). در زمینه تعامل بین گیاهان و گیاهخواران، عملکرد سیگنالینگ ET بر پویایی متابولیت‌های خاص گیاه هنوز پراکنده است و فقط یک گروه ترکیبی واحد را هدف قرار می‌دهد. علاوه بر این، اکثر مطالعات از کاربرد برون‌زا ET یا پیش‌سازهای آن یا مهارکننده‌های مختلف برای مطالعه تنظیم ET استفاده کرده‌اند که در میان آنها، این کاربردهای شیمیایی برون‌زا عوارض جانبی غیر اختصاصی زیادی ایجاد می‌کنند. تا آنجا که ما می‌دانیم، این مطالعه اولین بررسی سیستماتیک در مقیاس بزرگ از نقش ET در استفاده از ET برای تولید و درک گیاهان تراریخته مختل شده برای هماهنگی دینامیک متابولوم گیاه است. القای ET مختص گیاهخواران در نهایت می‌تواند پاسخ متابولوم را تعدیل کند. مهمترین مورد، دستکاری تراریخته ژن‌های بیوسنتز ET (ACO) و ادراک (ETR1) است که تجمع de novo فنولامیدها مختص گیاهخواران را نشان داد. قبلاً نشان داده شده است که ET می‌تواند با تنظیم پوترسین N-متیل ترانسفراز (49)، تجمع نیکوتین ناشی از JA را به طور دقیق تنظیم کند. با این حال، از دیدگاه مکانیکی، مشخص نیست که ET چگونه القای فنولامید را به طور دقیق تنظیم می‌کند. علاوه بر عملکرد انتقال سیگنال ET، جریان متابولیکی را می‌توان به S-آدنوزیل-۱-متیونین نیز هدایت کرد تا سرمایه‌گذاری در پلی‌آمینوفنول آمیدها را تنظیم کند. S-آدنوزیل-۱-متیونین ET و واسطه مشترک مسیر بیوسنتز پلی‌آمین است. مکانیسمی که سیگنال ET از طریق آن سطح فنول‌آمید را تنظیم می‌کند، نیاز به مطالعه بیشتر دارد.
برای مدت طولانی، به دلیل تعداد زیاد متابولیت‌های ویژه با ساختار ناشناخته، توجه شدید به دسته‌های متابولیکی خاص، قادر به ارزیابی دقیق تغییرات زمانی تنوع متابولیکی پس از تعاملات بیولوژیکی نبوده است. در حال حاضر، بر اساس تجزیه و تحلیل نظریه اطلاعات، نتیجه اصلی اکتساب طیف MS/MS بر اساس متابولیت‌های بی‌طرفانه این است که گیاهخوارانی که گیاهخواران را می‌خورند یا شبیه‌سازی می‌کنند، همچنان تنوع متابولیکی کلی متابولوم برگ را کاهش می‌دهند و در عین حال درجه تخصص آن را افزایش می‌دهند. این افزایش موقت در ویژگی متابولوم ناشی از گیاهخواران با افزایش هم افزایی در ویژگی ترانسکریپتوم همراه است. ویژگی‌ای که بیشترین سهم را در این تخصص بزرگتر متابولوم (داشتن مقدار Si بالاتر) دارد، متابولیت ویژه با عملکرد گیاهخواری است که قبلاً مشخص شده است. این مدل با پیش‌بینی نظریه OD سازگار است، اما پیش‌بینی MT مربوط به تصادفی بودن برنامه‌ریزی مجدد متابولوم سازگار نیست. با این حال، این داده‌ها با پیش‌بینی مدل ترکیبی (بهترین MT؛ شکل 1B) نیز سازگار است، زیرا سایر متابولیت‌های نامشخص با عملکردهای دفاعی ناشناخته ممکن است هنوز از توزیع تصادفی Si پیروی کنند.
الگوی قابل توجهی که این تحقیق بیشتر به آن دست یافته است این است که از سطح ریزتکامل (جمعیت تک گیاه و تنباکو) تا یک مقیاس تکاملی بزرگتر (گونه‌های تنباکوی نزدیک به هم)، سطوح مختلف سازماندهی تکاملی در "بهترین دفاع" قرار دارند. تفاوت‌های قابل توجهی در توانایی‌های گیاهخواران وجود دارد. مور و همکاران (20) و کسلر و کالسکه (1) به طور مستقل پیشنهاد کردند که سه سطح عملکردی تنوع زیستی که در ابتدا توسط ویتاکر (50) متمایز شده بود، به تغییرات زمانی ساختاری و القایی تنوع شیمیایی تبدیل شود. این نویسندگان هیچ یک خلاصه‌ای ارائه نکردند. رویه‌های جمع‌آوری داده‌های متابولوم در مقیاس بزرگ همچنین نحوه محاسبه تنوع متابولیکی از این داده‌ها را تشریح نمی‌کنند. در این مطالعه، تنظیمات جزئی در طبقه‌بندی عملکردی ویتاکر، تنوع متابولیکی α را به عنوان تنوع طیف‌های MS/MS در یک گیاه معین و تنوع متابولیکی β را به عنوان متابولیسم درون گونه‌ای اساسی گروهی از جمعیت‌ها در نظر می‌گیرد. و تنوع متابولیکی γ امتدادی از تجزیه و تحلیل گونه‌های مشابه خواهد بود.
سیگنال JA برای طیف وسیعی از پاسخ‌های متابولیکی گیاهخواران ضروری است. با این حال، آزمایش‌های کمی دقیقی در مورد سهم تنظیم درون گونه‌ای بیوسنتز JA در تنوع متابولوم وجود ندارد و اینکه آیا سیگنال JA یک مکان عمومی برای تنوع متابولیکی ناشی از استرس در مقیاس کلان تکاملی بالاتر است یا خیر، هنوز مشخص نیست. ما مشاهده کردیم که ماهیت گیاهخواری گیاه‌خواری گیاه‌خواری نپنتس باعث تخصص متابولوم می‌شود و تنوع تخصص متابولوم در جمعیت گونه‌های نیکوتیانا و در میان گونه‌های نزدیک به نیکوتیانا به طور سیستماتیک با سیگنالینگ JA همبستگی مثبت دارد. علاوه بر این، هنگامی که سیگنال JA مختل می‌شود، ویژگی متابولیکی ناشی از یک ژنوتیپ گیاهخوار لغو می‌شود (شکل 3، C و E). از آنجایی که تغییرات طیف متابولیکی جمعیت‌های نپنتس که به طور طبیعی ضعیف شده‌اند، عمدتاً کمی هستند، تغییرات در تنوع و ویژگی متابولیکی β در این تجزیه و تحلیل ممکن است تا حد زیادی ناشی از تحریک شدید دسته‌های ترکیبات غنی از متابولیت باشد. این دسته از ترکیبات، بخشی از پروفایل متابولوم را تشکیل می‌دهند و منجر به همبستگی مثبت با سیگنال‌های JA می‌شوند.
از آنجا که مکانیسم‌های بیوشیمیایی گونه‌های تنباکو که ارتباط نزدیکی با آن دارند بسیار متفاوت است، متابولیت‌ها به طور خاص از جنبه کیفی شناسایی می‌شوند، بنابراین تحلیلی‌تر است. پردازش پروفایل متابولیکی ثبت شده توسط نظریه اطلاعات نشان می‌دهد که القای گیاهخواری، بده بستان بین تنوع گامای متابولیکی و تخصص را تشدید می‌کند. سیگنال JA نقش محوری در این بده بستان ایفا می‌کند. افزایش تخصص متابولوم با پیش‌بینی اصلی OD سازگار است و با سیگنال JA همبستگی مثبت دارد، در حالی که سیگنال JA با تنوع گامای متابولیکی همبستگی منفی دارد. این مدل‌ها نشان می‌دهند که ظرفیت OD گیاهان عمدتاً توسط انعطاف‌پذیری JA تعیین می‌شود، چه در مقیاس ریزتکاملی و چه در مقیاس تکاملی بزرگتر. آزمایش‌های کاربرد JA برون‌زا که نقص‌های بیوسنتز JA را دور می‌زنند، بیشتر نشان می‌دهند که گونه‌های تنباکوی نزدیک را می‌توان به گونه‌های پاسخ‌دهنده به سیگنال و غیرپاسخ‌دهنده به سیگنال تفکیک کرد، درست مانند حالت JA و انعطاف‌پذیری متابولوم ناشی از گیاهخواران. گونه‌های غیرپاسخ‌دهنده به سیگنال به دلیل عدم توانایی در تولید JA درون‌زا نمی‌توانند پاسخ دهند و بنابراین در معرض محدودیت‌های فیزیولوژیکی هستند. این ممکن است ناشی از جهش در برخی از ژن‌های کلیدی در مسیر سیگنالینگ JA (AOS و JAR4 در N. crescens) باشد. این نتیجه نشان می‌دهد که این الگوهای تکاملی کلان بین گونه‌ای ممکن است عمدتاً توسط تغییرات در درک و پاسخگویی به هورمون‌های داخلی هدایت شوند.
علاوه بر تعامل بین گیاهان و گیاهخواران، بررسی تنوع متابولیکی با تمام پیشرفت‌های نظری مهم در تحقیقات سازگاری بیولوژیکی با محیط و تکامل صفات فنوتیپی پیچیده مرتبط است. با افزایش میزان داده‌های به‌دست‌آمده توسط ابزارهای مدرن طیف‌سنجی جرمی، آزمایش فرضیه در مورد تنوع متابولیکی اکنون می‌تواند از تفاوت‌های متابولیت‌های فردی/دسته‌ای فراتر رود و تجزیه و تحلیل جهانی را برای آشکار کردن الگوهای غیرمنتظره انجام دهد. در فرآیند تجزیه و تحلیل در مقیاس بزرگ، یک استعاره مهم، ایده تصور نقشه‌های معنادار است که می‌توانند برای کاوش داده‌ها استفاده شوند. بنابراین، نتیجه مهم ترکیب فعلی متابولومیکس MS/MS بی‌طرفانه و نظریه اطلاعات این است که یک معیار ساده ارائه می‌دهد که می‌تواند برای ساخت نقشه‌هایی برای مرور تنوع متابولیکی در مقیاس‌های مختلف طبقه‌بندی استفاده شود. این الزام اساسی این روش است. مطالعه تکامل خرد/کلان و بوم‌شناسی جامعه.
در سطح کلان-تکاملی، هسته اصلی نظریه تکامل مشترک گیاه-حشره ارلیچ و ریون (51) پیش‌بینی این است که تغییر تنوع متابولیکی بین گونه‌ای، علت تنوع دودمان‌های گیاهی است. با این حال، در پنجاه سالی که از انتشار این اثر مهم می‌گذرد، این فرضیه به ندرت مورد آزمایش قرار گرفته است (52). این امر عمدتاً به دلیل ویژگی‌های فیلوژنتیکی ویژگی‌های متابولیکی قابل مقایسه در دودمان‌های گیاهی دور از دسترس است. این نادر بودن می‌تواند برای تثبیت روش‌های تحلیل هدف مورد استفاده قرار گیرد. گردش کار فعلی MS/MS که توسط نظریه اطلاعات پردازش می‌شود، شباهت ساختاری MS/MS متابولیت‌های ناشناخته (بدون انتخاب متابولیت قبلی) را کمّی می‌کند و این MS/MSها را به مجموعه‌ای از MS/MSها تبدیل می‌کند، بنابراین در متابولیسم حرفه‌ای، این مدل‌های کلان-تکاملی در مقیاس طبقه‌بندی مقایسه می‌شوند. شاخص‌های آماری ساده. این فرآیند مشابه تحلیل فیلوژنتیکی است که می‌تواند از هم‌ترازی توالی برای کمّی‌سازی نرخ تنوع یا تکامل ویژگی بدون پیش‌بینی قبلی استفاده کند.
در سطح بیوشیمیایی، فرضیه غربالگری فیرن و جونز (53) نشان می‌دهد که تنوع متابولیکی در سطوح مختلف حفظ می‌شود تا مواد خام لازم برای اعمال فعالیت‌های بیولوژیکی متابولیت‌های قبلاً نامرتبط یا جایگزین‌شده را فراهم کند. روش‌های نظریه اطلاعات چارچوبی را ارائه می‌دهند که در آن می‌توان این گذارهای تکاملی مختص متابولیت را که در طول تخصص متابولیت رخ می‌دهند، به عنوان بخشی از فرآیند غربالگری تکاملی پیشنهادی، کمی‌سازی کرد: سازگاری فعال بیولوژیکی از اختصاصیت پایین به اختصاصیت بالا متابولیت‌های مهار شده یک محیط معین.
روی هم رفته، در روزهای اولیه زیست‌شناسی مولکولی، نظریه‌های مهم دفاع گیاهی توسعه یافتند و روش‌های قیاسی مبتنی بر فرضیه به طور گسترده به عنوان تنها وسیله پیشرفت علمی در نظر گرفته می‌شوند. این امر عمدتاً به دلیل محدودیت‌های فنی اندازه‌گیری کل متابولوم است. اگرچه روش‌های مبتنی بر فرضیه به ویژه در انتخاب سایر مکانیسم‌های علّی مفید هستند، اما توانایی آنها در پیشبرد درک ما از شبکه‌های بیوشیمیایی محدودتر از روش‌های محاسباتی موجود در علم معاصر با داده‌های فشرده است. بنابراین، نظریه‌هایی که نمی‌توان پیش‌بینی کرد، بسیار فراتر از محدوده داده‌های موجود هستند، بنابراین چرخه فرمول/آزمون فرضی پیشرفت در حوزه تحقیق را نمی‌توان لغو کرد (4). ما پیش‌بینی می‌کنیم که گردش کار محاسباتی متابولومیکس که در اینجا معرفی شده است، می‌تواند علاقه به مسائل اخیر (چگونگی) و نهایی (چرایی) تنوع متابولیکی را دوباره برانگیزد و به دوره جدیدی از علم داده‌های هدایت‌شده نظری کمک کند. این دوره، نظریه‌های مهمی را که الهام‌بخش نسل‌های قبلی بودند، دوباره بررسی کرد.
تغذیه مستقیم گیاه‌خواران با پرورش یک لارو سن دوم یا لارو Sl روی یک برگ گیاه کوزه‌ای کم‌رنگ از یک گیاه گلدار رز، با 10 تکرار گیاه در هر گیاه انجام می‌شود. لاروهای حشره با گیره بسته شدند و بافت برگ باقی‌مانده 24 و 72 ساعت پس از آلودگی جمع‌آوری و سریع منجمد شد و متابولیت‌ها استخراج شدند.
درمان گیاه‌خواری را به شیوه‌ای بسیار هماهنگ شبیه‌سازی کنید. روش این است که در مرحله رشد تاج گل پارچه‌ای، از چرخ‌های الگوی پارچه‌ای برای سوراخ کردن سه ردیف خار در هر طرف رگبرگ میانی سه برگ کاملاً توسعه‌یافته گیاه استفاده کنید و بلافاصله محلول رقیق‌شده با نسبت ۱:۵ را روی گیاه بمالید. یا از انگشتان دستکش‌پوش برای قرار دادن S1 OS در محل سوراخ استفاده کنید. برگ را همانطور که در بالا توضیح داده شد، برداشت و فرآوری کنید. از روش قبلاً توضیح داده شده برای استخراج متابولیت‌های اولیه و هورمون‌های گیاهی استفاده کنید (54).
برای کاربردهای خارجی JA، سه برگ دمبرگ هر یک از شش گیاه گلدار رز از هر گونه با 20 میکرولیتر خمیر لانولین حاوی 150 میکروگرم MeJA (Lan + MeJA) و 20 میکرولیتر لانولین به همراه درمان زخم (Lan + W) تیمار می‌شوند، یا از 20 میکرولیتر لانولین خالص به عنوان شاهد استفاده می‌شود. برگ‌ها 72 ساعت پس از تیمار برداشت، در نیتروژن مایع منجمد شده و تا زمان استفاده در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
چهار لاین تراریخته JA و ET، به نام‌های irAOC (36)، irCOI1 (55)، irACO و sSETR1 (48)، در گروه تحقیقاتی ما شناسایی شده‌اند. irAOC به شدت کاهش سطح JA و JA-Ile را نشان داد، در حالی که irCOI1 به JAها حساس نبود. در مقایسه با EV، تجمع JA-Ile افزایش یافت. به طور مشابه، irACO تولید ET را کاهش می‌دهد و در مقایسه با EV، sSETR1 که به ET حساس نیست، تولید ET را افزایش می‌دهد.
یک طیف‌سنج لیزری فوتوآکوستیک (حسگر ET زمان واقعی Sensor Sense ETD-300) برای انجام اندازه‌گیری ET به صورت غیرتهاجمی استفاده می‌شود. بلافاصله پس از تیمار، نیمی از برگ‌ها بریده شده و به یک ویال شیشه‌ای مهر و موم شده ۴ میلی‌لیتری منتقل شدند و اجازه داده شد فضای بالای ویال ظرف ۵ ساعت جمع شود. در طول اندازه‌گیری، هر ویال به مدت ۸ دقیقه با جریان ۲ لیتر در ساعت هوای خالص که قبلاً از کاتالیزوری که توسط Sensor Sense برای حذف CO2 و آب ارائه شده بود، عبور کرده بود، شستشو داده شد.
داده‌های ریزآرایه در ابتدا در (35) منتشر شد و در پایگاه داده جامع بیان ژن مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) (شماره دسترسی GSE30287) ذخیره شد. داده‌های مربوط به برگ‌های ایجاد شده توسط تیمار W + OSMs و کنترل بدون آسیب برای این مطالعه استخراج شدند. شدت خام log2 است. قبل از تجزیه و تحلیل آماری، خط پایه با استفاده از بسته نرم‌افزاری R به صدک 75 آن تبدیل و نرمال‌سازی شد.
داده‌های اصلی توالی‌یابی RNA (RNA-seq) گونه‌های نیکوتینا از بایگانی کوتاه خواندنی NCBI (SRA) بازیابی شد، شماره پروژه PRJNA301787 است که توسط ژو و همکاران (39) گزارش شده و مطابق شرح داده شده در (56) ادامه می‌یابد. داده‌های خام پردازش شده توسط W + W، W + OSM و W + OSS1 مربوط به گونه‌های نیکوتینا برای تجزیه و تحلیل در این مطالعه انتخاب شدند و به روش زیر پردازش شدند: ابتدا، خوانش‌های خام RNA-seq به فرمت FASTQ تبدیل شدند. HISAT2 FASTQ را به SAM تبدیل می‌کند و SAMtools فایل‌های SAM را به فایل‌های BAM مرتب شده تبدیل می‌کند. StringTie برای محاسبه بیان ژن استفاده می‌شود و روش بیان آن این است که به ازای هر هزار قطعه باز به ازای هر میلیون قطعه رونویسی توالی‌یابی شده، قطعاتی وجود دارد.
ستون کروماتوگرافی Acclaim (150 میلی‌متر در 2.1 میلی‌متر؛ اندازه ذرات 2.2 میکرومتر) مورد استفاده در آنالیز و ستون محافظ 4 میلی‌متر در 4 میلی‌متر از یک ماده تشکیل شده‌اند. گرادیان دوتایی زیر در سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالا (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 استفاده می‌شود: 0 تا 0.5 دقیقه، ایزوکراتیک 90% A [آب دیونیزه، 0.1% (حجمی/حجمی) استونیتریل و 0.05% اسید فرمیک]، 10% B (استونیتریل و 0.05% اسید فرمیک)؛ 0.5 تا 23.5 دقیقه، فاز گرادیان به ترتیب 10% A و 90% B است؛ 23.5 تا 25 دقیقه، ایزوکراتیک 10% A و 90% B. سرعت جریان 400 میکرولیتر در دقیقه است. برای تمام آنالیزهای طیف‌سنجی جرمی (MS)، حلال ستون را به یک آنالیزور چهارقطبی و زمان پرواز (qTOF) مجهز به منبع الکترواسپری که در حالت یونیزاسیون مثبت کار می‌کند (ولتاژ مویرگی، ۴۵۰۰ ولت؛ خروجی مویرگی ۱۳۰ ولت؛ دمای خشک کردن ۲۰۰ درجه سانتیگراد؛ جریان هوای خشک کردن ۱۰ لیتر در دقیقه) تزریق کنید.
تجزیه و تحلیل قطعات MS/MS (که از این پس MS/MS نامیده می‌شود) را که نامربوط یا غیرقابل تشخیص از داده‌ها هستند، انجام دهید تا اطلاعات ساختاری در مورد مشخصات متابولیکی کلی قابل تشخیص به دست آورید. مفهوم روش MS/MS بدون تبعیض بر این واقعیت استوار است که چهارقطبی دارای پنجره جداسازی جرم بسیار بزرگی است [بنابراین، تمام سیگنال‌های نسبت جرم به بار (m/z) را به عنوان قطعات در نظر بگیرید]. به همین دلیل، از آنجا که دستگاه Impact II قادر به ایجاد شیب CE نبود، چندین تجزیه و تحلیل مستقل با استفاده از مقادیر افزایش یافته انرژی برخورد تفکیک ناشی از برخورد (CE) انجام شد. به طور خلاصه، ابتدا نمونه را با استفاده از حالت طیف‌سنجی جرمی تکی (شرایط قطعه قطعه شدن کم ناشی از قطعه قطعه شدن درون منبع) با اسکن از m/z 50 تا 1500 در فرکانس تکرار 5 هرتز تجزیه و تحلیل کنید. از نیتروژن به عنوان گاز برخورد برای آنالیز MS/MS استفاده کنید و اندازه‌گیری‌های مستقل را در چهار ولتاژ مختلف تفکیک ناشی از برخورد زیر انجام دهید: 20، 30، 40 و 50 eV. در طول فرآیند اندازه‌گیری، چهارقطبی بزرگترین پنجره جداسازی جرم را دارد، از m/z 50 تا 1500. هنگامی که m/z بدنه جلویی و آزمایش عرض جداسازی روی 200 تنظیم می‌شود، محدوده جرم به طور خودکار توسط نرم‌افزار عملیاتی دستگاه و 0 Da فعال می‌شود. قطعات جرم را مانند حالت تک جرمی اسکن کنید. برای کالیبراسیون جرم از سدیم فرمات (50 میلی‌لیتر ایزوپروپانول، 200 میکرولیتر اسید فرمیک و 1 میلی‌لیتر محلول آبی 1M NaOH) استفاده کنید. با استفاده از الگوریتم کالیبراسیون با دقت بالای Bruker، فایل داده‌ها پس از اجرای طیف میانگین در یک دوره زمانی معین کالیبره می‌شود. از تابع خروجی نرم‌افزار Data Analysis v4.0 (بروک دالتون، برمن، آلمان) برای تبدیل فایل‌های داده خام به فرمت NetCDF استفاده کنید. مجموعه داده‌های MS/MS در پایگاه داده متابولومیکس باز MetaboLights (www.ebi.ac.uk) با شماره دسترسی MTBLS1471 ذخیره شده است.
مونتاژ MS/MS را می‌توان از طریق تحلیل همبستگی بین سیگنال‌های کیفی MS1 و MS/MS برای انرژی برخورد کم و زیاد و قوانین تازه پیاده‌سازی شده، محقق کرد. اسکریپت R برای تحقق تحلیل همبستگی توزیع پیش‌ساز به محصول و اسکریپت C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) برای پیاده‌سازی قوانین استفاده می‌شود.
به منظور کاهش خطاهای مثبت کاذب ناشی از نویز پس‌زمینه و همبستگی کاذب ناشی از تشخیص ویژگی‌های m/z خاص در تنها چند نمونه، از تابع «پیک پر شده» از بسته R XCMS (برای تصحیح نویز پس‌زمینه) استفاده می‌کنیم. باید برای جایگزینی شدت «NA» (پیک کشف نشده) استفاده شود. هنگامی که از تابع پیک پر شده استفاده می‌شود، هنوز مقادیر شدت «0» زیادی در مجموعه داده‌ها وجود دارد که بر محاسبه همبستگی تأثیر می‌گذارند. سپس، نتایج پردازش داده‌ها را هنگام استفاده از تابع پیک پر شده و زمانی که از تابع پیک پر شده استفاده نمی‌شود، مقایسه می‌کنیم و مقدار نویز پس‌زمینه را بر اساس مقدار تخمینی اصلاح شده میانگین محاسبه می‌کنیم و سپس این مقادیر شدت 0 را با مقدار پس‌زمینه محاسبه شده جایگزین می‌کنیم. ما همچنین فقط ویژگی‌هایی را در نظر گرفتیم که شدت آنها از سه برابر مقدار پس‌زمینه بیشتر بود و آنها را به عنوان «پیک‌های واقعی» در نظر گرفتیم. برای محاسبات PCC، فقط سیگنال‌های m/z پیش‌ماده نمونه (MS1) و مجموعه داده‌های قطعه‌ای با حداقل هشت پیک واقعی در نظر گرفته می‌شوند.
اگر شدت ویژگی کیفی پیش‌ساز در کل نمونه به طور قابل توجهی با شدت کاهش یافته همان ویژگی کیفی که در معرض انرژی برخورد کم یا زیاد قرار گرفته است، همبستگی داشته باشد و این ویژگی توسط CAMERA به عنوان یک پیک ایزوتوپ برچسب گذاری نشده باشد، می‌توان آن را بیشتر تعریف کرد. سپس، با محاسبه تمام جفت‌های پیش‌ساز-محصول ممکن در عرض ۳ ثانیه (پنجره زمان ماندگاری تخمینی برای پیک ماندگاری)، تجزیه و تحلیل همبستگی انجام می‌شود. تنها زمانی که مقدار m/z کمتر از مقدار پیش‌ساز باشد و قطعه قطعه شدن MS/MS در همان مکان نمونه در مجموعه داده‌ها به عنوان پیش‌ساز که از آن مشتق شده است، رخ دهد، آن قطعه قطعه در نظر گرفته می‌شود.
بر اساس این دو قانون ساده، قطعات مشخص‌شده با مقادیر m/z بزرگتر از m/z پیش‌ساز شناسایی‌شده و بر اساس موقعیت نمونه که پیش‌ساز در آن ظاهر می‌شود و قطعه مشخص‌شده، حذف می‌شوند. همچنین می‌توان ویژگی‌های کیفی تولید شده توسط بسیاری از قطعات درون منبع تولید شده در حالت MS1 را به عنوان پیش‌سازهای کاندید انتخاب کرد و در نتیجه ترکیبات MS/MS اضافی تولید کرد. به منظور کاهش این افزونگی داده‌ها، اگر شباهت NDP طیف‌ها از 0.6 بیشتر باشد و متعلق به کروماتوگرام "pcgroup" حاشیه‌نویسی شده توسط CAMERA باشند، آنها را ادغام می‌کنیم. در نهایت، هر چهار نتیجه CE مرتبط با پیش‌ساز و قطعات را با انتخاب بالاترین پیک شدت در بین تمام پیک‌های کاندید با مقدار m/z یکسان در انرژی‌های برخورد مختلف، در طیف ترکیبی نهایی واکندولوته ادغام می‌کنیم. مراحل پردازش بعدی بر اساس مفهوم طیف ترکیبی است و شرایط مختلف CE مورد نیاز برای به حداکثر رساندن احتمال قطعه قطعه شدن را در نظر می‌گیرد، زیرا برخی از قطعات فقط تحت یک انرژی برخورد خاص قابل تشخیص هستند.
از RDPI (30) برای محاسبه‌ی قابلیت القاپذیری پروفایل متابولیک استفاده شد. تنوع طیف متابولیک (شاخص Hj) از فراوانی پیش‌سازهای MS/MS با استفاده از آنتروپی شانون توزیع فراوانی MS/MS با استفاده از معادله‌ی زیر که توسط مارتینز و همکاران (8) شرح داده شده است، بدست می‌آید. Hj = -∑i = 1mPijlog2(Pij) که در آن Pij مربوط به فراوانی نسبی MS/MS i ام در نمونه‌ی j ام است (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
ویژگی متابولیک (شاخص Si) به عنوان هویت بیان یک MS/MS معین در رابطه با فراوانی بین نمونه‌های مورد بررسی تعریف می‌شود. ویژگی MS/MS به صورت Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi) محاسبه می‌شود.
از فرمول زیر برای اندازه‌گیری شاخص δj اختصاصی متابولوم هر نمونه j و میانگین اختصاصیت MS/MS استفاده کنید: δj = ∑i = 1mPijSi
طیف‌های MS/MS به صورت جفت جفت تراز می‌شوند و شباهت بر اساس دو امتیاز محاسبه می‌شود. ابتدا، با استفاده از NDP استاندارد (که به عنوان روش همبستگی کسینوسی نیز شناخته می‌شود)، از معادله زیر برای امتیازدهی شباهت قطعه بین طیف‌ها استفاده کنید. NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 که در آن S1 و S2 به همین ترتیب، برای طیف 1 و طیف 2، و همچنین WS1، i و WS2، i نشان دهنده وزن بر اساس شدت پیک است که تفاوت i امین پیک مشترک بین دو طیف کمتر از 0.01 Da باشد. وزن به صورت زیر محاسبه می‌شود: W = [شدت پیک] m [کیفیت] n، m = 0.5، n = 2، همانطور که توسط MassBank پیشنهاد شده است.
روش امتیازدهی دومی پیاده‌سازی شد که شامل تجزیه و تحلیل NL مشترک بین MS/MS بود. برای این منظور، ما از 52 لیست NL که اغلب در طول فرآیند قطعه قطعه شدن MS با آنها مواجه می‌شویم، به صورت پشت سر هم و NL خاص‌تر (فایل داده S1) که قبلاً برای طیف MS/MS متابولیت‌های ثانویه گونه‌های ضعیف شده Nepenthes حاشیه‌نویسی شده است (9، 26) استفاده کردیم. برای هر MS/MS یک بردار دودویی 1 و 0 ایجاد کنید که به ترتیب مربوط به NL فعلی و عدم وجود برخی از NLها باشد. بر اساس شباهت فاصله اقلیدسی، امتیاز شباهت NL برای هر جفت از بردارهای NL دودویی محاسبه می‌شود.
برای انجام خوشه‌بندی دوگانه، از بسته R DiffCoEx استفاده کردیم که مبتنی بر بسطی از تحلیل هم‌بیانی ژنی وزن‌دار (WGCNA) است. با استفاده از ماتریس‌های امتیازدهی NDP و NL طیف‌های MS/MS، از DiffCoEx برای محاسبه ماتریس همبستگی مقایسه‌ای استفاده کردیم. خوشه‌بندی دودویی با تنظیم پارامتر "cutreeDynamic" به method = "hybrid"، cutHeight = 0.9999، deepSplit = T و minClusterSize = 10 انجام می‌شود. کد منبع R DiffCoEx توسط Tesson و همکاران (57) از فایل اضافی 1 دانلود شد. بسته نرم‌افزاری R WGCNA مورد نیاز را می‌توانید در https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA بیابید.
به منظور انجام تجزیه و تحلیل شبکه مولکولی MS/MS، ما اتصال طیفی جفت شده را بر اساس انواع شباهت NDP و NL محاسبه کردیم و از نرم‌افزار Cytoscape برای تجسم توپولوژی شبکه با استفاده از طرح‌بندی ارگانیک در برنامه افزودنی الگوریتم طرح‌بندی CyFilescape yFiles استفاده کردیم.
برای انجام تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها از نرم‌افزار R نسخه ۳.۰.۱ استفاده کنید. اهمیت آماری با استفاده از تحلیل واریانس دوطرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی تفاوت معنادار صادقانه توکی (HSD) ارزیابی شد. به منظور تجزیه و تحلیل تفاوت بین تیمار گیاهخواری و کنترل، توزیع دوطرفه دو گروه از نمونه‌ها با واریانس یکسان با استفاده از آزمون t استیودنت تجزیه و تحلیل شد.
برای مطالب تکمیلی این مقاله، لطفاً به http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1 مراجعه کنید.
این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution-Non-Commercial توزیع شده است، که استفاده، توزیع و تکثیر در هر رسانه‌ای را مجاز می‌داند، مادامی که استفاده نهایی برای سود تجاری نباشد و فرض بر این باشد که اثر اصلی صحیح است. مرجع.
توجه: ما فقط از شما می‌خواهیم آدرس ایمیل خود را ارائه دهید تا شخصی که به صفحه توصیه می‌کنید بداند که می‌خواهید ایمیل را ببیند و اینکه هرزنامه نیست. ما هیچ آدرس ایمیلی را ثبت نخواهیم کرد.
این سوال برای بررسی اینکه آیا شما بازدیدکننده هستید یا خیر و جلوگیری از ارسال خودکار هرزنامه استفاده می‌شود.
نظریه اطلاعات، یک ارز جهانی برای مقایسه متابولوم‌های خاص و پیش‌بینی نظریه‌های دفاع از آزمون فراهم می‌کند.
نظریه اطلاعات، یک ارز جهانی برای مقایسه متابولوم‌های خاص و پیش‌بینی نظریه‌های دفاع از آزمون فراهم می‌کند.
©2021 انجمن آمریکایی برای پیشرفت علم. تمامی حقوق محفوظ است AAAS شریک HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER است. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.