ما قبلاً گزارش داده بودیم که سطح سرمی متابولیت تریپتوفان مشتق از روده، ایندول-۳-پروپیونیک اسید (IPA)، در بیماران مبتلا به فیبروز کبدی پایین‌تر است. در این مطالعه، ما ترانسکریپتوم و متیلوم DNA را در کبدهای چاق در ارتباط با سطح IPA سرم و همچنین نقش IPA در القای غیرفعال‌سازی فنوتیپی سلول‌های ستاره‌ای کبدی (HSCs) در شرایط آزمایشگاهی بررسی کردیم.
این مطالعه شامل 116 بیمار چاق بدون دیابت نوع 2 (T2DM) (سن 46.8 ± 9.3 سال؛ BMI: 42.7 ± 5.0 کیلوگرم بر متر مربع) بود که تحت عمل جراحی چاقی در مرکز جراحی چاقی Kuopio (KOBS) قرار گرفتند. سطح IPA در گردش خون با استفاده از کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی (LC-MS) اندازه‌گیری شد، تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم کبد با تعیین توالی کل RNA انجام شد و تجزیه و تحلیل متیلاسیون DNA با استفاده از Infinium HumanMethylation450 BeadChip انجام شد. سلول‌های ستاره‌ای کبدی انسان (LX-2) برای آزمایش‌های آزمایشگاهی استفاده شدند.
سطح IPA سرم با بیان ژن‌های دخیل در مسیرهای آپوپتوز، میتوفاژیک و طول عمر در کبد همبستگی داشت. ژن AKT سرین/ترئونین کیناز ۱ (AKT1) فراوان‌ترین و غالب‌ترین ژن برهمکنش‌کننده در رونوشت کبد و پروفایل‌های متیلاسیون DNA بود. درمان با IPA با تعدیل بیان ژن‌های شناخته‌شده برای تنظیم فیبروز، آپوپتوز و بقای سلول‌های LX-2، آپوپتوز را القا کرد، تنفس میتوکندری را کاهش داد و مورفولوژی سلولی و دینامیک میتوکندری را تغییر داد.
روی هم رفته، این داده‌ها از این موضوع پشتیبانی می‌کنند که IPA اثرات درمانی بالقوه‌ای دارد و می‌تواند آپوپتوز را القا کند و فنوتیپ HSC را به سمت حالت غیرفعال تغییر دهد، در نتیجه احتمال مهار فیبروز کبدی را با تداخل در فعال‌سازی HSC و متابولیسم میتوکندری افزایش می‌دهد.
شیوع چاقی و سندرم متابولیک با افزایش شیوع بیماری کبد چرب مرتبط با متابولیسم (MASLD) مرتبط بوده است؛ این بیماری 25 تا 30 درصد از جمعیت عمومی را تحت تأثیر قرار می‌دهد [1]. پیامد اصلی علت MASLD، فیبروز کبدی است، فرآیندی پویا که با تجمع مداوم ماتریکس خارج سلولی فیبری (ECM) مشخص می‌شود [2]. سلول‌های اصلی دخیل در فیبروز کبدی، سلول‌های ستاره‌ای کبدی (HSCs) هستند که چهار فنوتیپ شناخته شده را نشان می‌دهند: خاموش، فعال، غیرفعال و پیر [3، 4]. HSCها می‌توانند فعال شوند و از حالت خاموش به سلول‌های شبه فیبروبلاست تکثیرشونده با تقاضای انرژی بالا، با افزایش بیان اکتین عضله صاف α (α-SMA) و کلاژن نوع I (Col-I) تبدیل شوند [5، 6]. در طول معکوس شدن فیبروز کبدی، HSCهای فعال شده از طریق آپوپتوز یا غیرفعال شدن حذف می‌شوند. این فرآیندها شامل کاهش بیان ژن‌های فیبروژنیک و تعدیل ژن‌های پیش‌برنده بقا (مانند مسیرهای سیگنالینگ NF-κB و PI3K/Akt) [7، 8]، و همچنین تغییرات در دینامیک و عملکرد میتوکندری [9] می‌شود.
مشخص شده است که سطح سرمی متابولیت تریپتوفان، ایندول-3-پروپیونیک اسید (IPA)، که در روده تولید می‌شود، در بیماری‌های متابولیک انسان از جمله MASLD کاهش می‌یابد [10-13]. IPA با مصرف فیبر غذایی مرتبط است، به دلیل اثرات آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی خود شناخته شده است و فنوتیپ استئاتوهپاتیت غیرالکلی (NASH) ناشی از رژیم غذایی را در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی کاهش می‌دهد [11-14]. برخی شواهد از مطالعه قبلی ما به دست آمده است که نشان داد سطح IPA سرم در بیماران مبتلا به فیبروز کبدی نسبت به بیماران چاق بدون فیبروز کبدی در مطالعه جراحی چاقی Kuopio (KOBS) کمتر بود. علاوه بر این، ما نشان دادیم که درمان IPA می‌تواند بیان ژن‌هایی را که نشانگرهای کلاسیک چسبندگی سلولی، مهاجرت سلولی و فعال‌سازی سلول‌های بنیادی خونساز در مدل سلول ستاره‌ای کبدی انسان (LX-2) هستند، کاهش دهد و یک متابولیت بالقوه محافظ کبد است [15]. با این حال، هنوز مشخص نیست که چگونه IPA با فعال کردن آپوپتوز HSC و بیوانرژتیک میتوکندری، باعث رگرسیون فیبروز کبدی می‌شود.
در اینجا، ما نشان می‌دهیم که IPA سرم با بیان ژن‌های غنی‌شده در مسیرهای آپوپتوز، میتوفاژی و طول عمر در کبد افراد چاق اما غیر دیابتی نوع 2 (KOBS) مرتبط است. علاوه بر این، ما دریافتیم که IPA می‌تواند از طریق مسیر غیرفعال‌سازی، پاکسازی و تخریب سلول‌های بنیادی خون‌ساز فعال‌شده (HSCs) را القا کند. این نتایج نقش جدیدی را برای IPA آشکار می‌کند و آن را به یک هدف درمانی بالقوه برای پیشبرد رگرسیون فیبروز کبدی تبدیل می‌کند.
یک مطالعه قبلی در گروه KOBS نشان داد که بیماران مبتلا به فیبروز کبدی در مقایسه با بیماران بدون فیبروز کبدی، سطح IPA در گردش خون پایین‌تری دارند [15]. برای حذف اثر مخدوش‌کننده بالقوه دیابت نوع 2، ما 116 بیمار چاق بدون دیابت نوع 2 (میانگین سنی ± انحراف معیار: 46.8 ± 9.3 سال؛ BMI: 42.7 ± 5.0 کیلوگرم بر متر مربع) (جدول 1) را از مطالعه در حال انجام KOBS به عنوان جمعیت مورد مطالعه انتخاب کردیم [16]. همه شرکت‌کنندگان رضایت کتبی آگاهانه دادند و پروتکل مطالعه توسط کمیته اخلاق بیمارستان شهرستان ساوو شمالی مطابق با اعلامیه هلسینکی (54/2005، 104/2008 و 27/2010) تأیید شد.
نمونه‌های بیوپسی کبد در طول جراحی چاقی گرفته شد و توسط پاتولوژیست‌های باتجربه طبق معیارهای قبلاً شرح داده شده [17، 18] از نظر بافت‌شناسی ارزیابی شد. معیارهای ارزیابی در جدول تکمیلی S1 خلاصه شده و قبلاً شرح داده شده است [19].
نمونه‌های سرم ناشتا با استفاده از کروماتوگرافی مایع غیرهدفمند-طیف‌سنجی جرمی (LC-MS) برای آنالیز متابولومیکس (n = 116) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نمونه‌ها با استفاده از سیستم UHPLC-qTOF-MS (1290 LC، 6540 qTOF-MS، Agilent Technologies، Waldbronn، Karlsruhe، آلمان) همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل شدند19. شناسایی ایزوپروپیل الکل (IPA) بر اساس زمان بازداری و مقایسه طیف MS/MS با استانداردهای خالص انجام شد. شدت سیگنال IPA (مساحت پیک) در تمام تجزیه و تحلیل‌های بعدی در نظر گرفته شد [20].
توالی‌یابی RNA کل کبد با استفاده از Illumina HiSeq 2500 انجام شد و داده‌ها مطابق آنچه قبلاً شرح داده شده است [19، 21، 22] پیش‌پردازش شدند. ما تجزیه و تحلیل بیان افتراقی هدفمند رونوشت‌های مؤثر بر عملکرد/بیوژنز میتوکندری را با استفاده از 1957 ژن انتخاب شده از پایگاه داده MitoMiner 4.0 انجام دادیم [23]. تجزیه و تحلیل متیلاسیون DNA کبد با استفاده از Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) با استفاده از همان روشی که قبلاً شرح داده شده است [24، 25] انجام شد.
سلول‌های ستاره‌ای کبدی انسان (LX-2) با لطف پروفسور استفانو رومئو تهیه و در محیط کشت DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) کشت داده شده و نگهداری شدند. برای انتخاب دوز مؤثر IPA، سلول‌های LX-2 به مدت 24 ساعت با غلظت‌های مختلف IPA (10 میکرومولار، 100 میکرومولار و 1 میلی‌مولار؛ Sigma, 220027) در محیط کشت DMEM/F12 تیمار شدند. علاوه بر این، برای بررسی توانایی IPA در غیرفعال کردن HSCها، سلول‌های LX-2 به مدت 24 ساعت با 5 نانوگرم در میلی‌لیتر TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) و 1 میلی‌مولار IPA در محیط کشت بدون سرم تیمار شدند. برای کنترل‌های مربوط به حامل، از 4 نانومولار HCL حاوی 0.1٪ BSA برای تیمار TGF-β1 و 0.05٪ DMSO برای تیمار IPA استفاده شد و هر دو با هم برای تیمار ترکیبی استفاده شدند.
آپوپتوز با استفاده از کیت تشخیص آپوپتوز FITC Annexin V به همراه 7-AAD (Biolegend، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده، شماره Cat# 640922) طبق دستورالعمل سازنده ارزیابی شد. به طور خلاصه، LX-2 (1 × 105 سلول در هر چاهک) یک شب در پلیت‌های 12 چاهکی کشت داده شدند و سپس با دوزهای متعدد IPA یا IPA و TGF-β1 تیمار شدند. روز بعد، سلول‌های شناور و چسبنده جمع‌آوری، تریپسینه، شسته شده با PBS، دوباره در بافر اتصال Annexin V به حالت تعلیق درآمدند و به مدت 15 دقیقه با FITC-Annexin V و 7-AAD انکوبه شدند.
میتوکندری‌ها در سلول‌های زنده برای فعالیت اکسیداتیو با استفاده از Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific، Carlsbad، CA) رنگ‌آمیزی شدند. برای سنجش MTR، سلول‌های LX-2 با تراکم‌های مساوی با IPA و TGF-β1 انکوبه شدند. پس از 24 ساعت، سلول‌های زنده تریپسینه شدند، با PBS شسته شدند و سپس همانطور که قبلاً توضیح داده شد [26] با 100 میکرومولار MTR در محیط بدون سرم در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند. برای تجزیه و تحلیل مورفولوژی سلول‌های زنده، اندازه سلول و پیچیدگی سیتوپلاسمی به ترتیب با استفاده از پارامترهای پراکندگی رو به جلو (FSC) و پراکندگی جانبی (SSC) تجزیه و تحلیل شدند.
تمام داده‌ها (30000 رویداد) با استفاده از NovoCyte Quanteon (Agilent) جمع‌آوری و با استفاده از نرم‌افزار NovoExpress® 1.4.1 یا FlowJo V.10 تجزیه و تحلیل شدند.
میزان مصرف اکسیژن (OCR) و میزان اسیدی شدن خارج سلولی (ECAR) به صورت بلادرنگ با استفاده از یک آنالیزور شار خارج سلولی اسب دریایی (Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا) مجهز به دستگاه سنجش استرس سلولی اسب دریایی XF مطابق دستورالعمل سازنده اندازه‌گیری شدند. به طور خلاصه، 2 × 104 سلول LX-2 در هر چاهک روی صفحات کشت سلولی XF96 کشت داده شدند. پس از انکوباسیون یک شبه، سلول‌ها با ایزوپروپانول (IPA) و TGF-β1 (روش‌های تکمیلی 1) تیمار شدند. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار Seahorse XF Wave انجام شد که شامل مولد گزارش تست فنوتیپ انرژی سلول اسب دریایی XF است. از این طریق، شاخص سلامت بیوانرژتیک (BHI) محاسبه شد [27].
RNA کل به cDNA رونویسی شد. برای روش‌های خاص، به مرجع [15] مراجعه کنید. سطوح mRNA پروتئین اسیدی ریبوزومی 60S انسانی P0 (RPLP0) و سیکلوفیلین A1 (PPIA) به عنوان کنترل‌های ژنی ساختاری استفاده شدند. سیستم PCR Real-Time QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) با کیت TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) یا کیت Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050) استفاده شد و تاخوردگی نسبی بیان ژن با استفاده از پارامترهای چرخه‌ای مقایسه‌ای مقدار Ct (ΔΔCt) و روش ∆∆Ct محاسبه شد. جزئیات پرایمرها در جداول تکمیلی S2 و S3 ارائه شده است.
DNA هسته‌ای (ncDNA) و DNA میتوکندریایی (mtDNA) با استفاده از کیت خون و بافت DNeasy (Qiagen) همانطور که قبلاً توضیح داده شد [28] استخراج شدند. مقدار نسبی mtDNA با محاسبه نسبت هر ناحیه mtDNA هدف به میانگین هندسی سه ناحیه DNA هسته‌ای (mtDNA/ncDNA) محاسبه شد، همانطور که در روش‌های تکمیلی 2 به تفصیل شرح داده شده است. جزئیات پرایمرهای mtDNA و ncDNA در جدول تکمیلی S4 ارائه شده است.
سلول‌های زنده با Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (شرکت Thermo Fisher Scientific، کارلسبد، کالیفرنیا) رنگ‌آمیزی شدند تا شبکه‌های میتوکندریایی بین سلولی و درون سلولی قابل مشاهده باشند. سلول‌های LX-2 (1 × 104 سلول در هر چاهک) روی اسلایدهای شیشه‌ای در صفحات کشت کف شیشه‌ای مربوطه (شرکت Ibidi GmbH، مارتینسرید، آلمان) کشت داده شدند. پس از 24 ساعت، سلول‌های زنده LX-2 به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با 100 میکرومولار MTR انکوبه شدند و هسته سلول‌ها با DAPI (1 میکروگرم در میلی‌لیتر، سیگما-آلدریچ) همانطور که قبلاً توضیح داده شد [29] رنگ‌آمیزی شدند. شبکه‌های میتوکندری با استفاده از میکروسکوپ معکوس Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH، Jena، آلمان) مجهز به ماژول کانفوکال Zeiss LSM 800 در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر مرطوب با 5٪ CO2 با استفاده از یک عدسی شیئی 63×NA 1.3 تصویربرداری شدند. ما ده تصویر سری Z را برای هر نوع نمونه به دست آوردیم. هر سری Z شامل 30 بخش است که هر کدام ضخامت 9.86 میکرومتر دارند. برای هر نمونه، تصاویری از ده میدان دید مختلف با استفاده از نرم‌افزار ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH، Jena، آلمان) به دست آمد و تجزیه و تحلیل مورفولوژی میتوکندری با استفاده از نرم‌افزار ImageJ (نسخه 1.54d) [30، 31] طبق پارامترهای ذکر شده در روش‌های تکمیلی 3 انجام شد.
سلول‌ها با گلوتارآلدئید ۲٪ در بافر فسفات ۰.۱ مولار تثبیت شدند و سپس با محلول تتراکسید اسمیوم ۱٪ (سیگما آلدریچ، میسوری، ایالات متحده) تثبیت شدند، به تدریج با استون (مرک، دارمشتات، آلمان) دهیدراته شدند و در نهایت در رزین اپوکسی قرار داده شدند. برش‌های فوق نازک تهیه و با ۱٪ اورانیل استات (مرک، دارمشتات، آلمان) و ۱٪ سیترات سرب (مرک، دارمشتات، آلمان) رنگ‌آمیزی شدند. تصاویر فراساختاری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری JEM 2100F EXII (JEOL Ltd، توکیو، ژاپن) با ولتاژ شتاب‌دهنده ۸۰ کیلوولت به دست آمد.
مورفولوژی سلول‌های LX-2 که به مدت 24 ساعت با IPA تیمار شده بودند، با استفاده از میکروسکوپ نوری معکوس Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 و AxioCam MRm، Jena، آلمان) با بزرگنمایی 50 برابر و با استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست بررسی شد.
داده‌های بالینی به صورت میانگین ± انحراف معیار یا میانه (دامنه بین چارکی: IQR) بیان شدند. برای مقایسه تفاوت‌های بین سه گروه مورد مطالعه، از آنالیز واریانس یک طرفه (متغیرهای پیوسته) یا آزمون χ² (متغیرهای دسته‌بندی شده) استفاده شد. برای اصلاح آزمایش‌های متعدد، از نرخ مثبت کاذب (FDR) استفاده شد و ژن‌هایی با FDR < 0.05 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شدند. از آنالیز همبستگی اسپیرمن برای همبستگی متیلاسیون DNA CpG با شدت سیگنال IPA استفاده شد و مقادیر p اسمی (p < 0.05) گزارش شد.
آنالیز مسیر با استفاده از یک ابزار آنالیز مجموعه ژن مبتنی بر وب (WebGestalt) برای 268 رونوشت (p اسمی < 0.01)، 119 رونوشت مرتبط با میتوکندری (p اسمی < 0.05) و 4350 CpG از 3093 رونوشت کبدی که با سطوح IPA سرم در گردش مرتبط بودند، انجام شد. از ابزار Venny DB (نسخه 2.1.0) که به صورت رایگان در دسترس است، برای یافتن ژن‌های همپوشانی و از StringDB (نسخه 11.5) برای تجسم تعاملات پروتئین-پروتئین استفاده شد.
برای آزمایش LX-2، نمونه‌ها با استفاده از آزمون D'Agostino-Pearson از نظر نرمال بودن مورد آزمایش قرار گرفتند. داده‌ها از حداقل سه تکرار بیولوژیکی به دست آمدند و تحت آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون تعقیبی Bonferroni قرار گرفتند. مقدار p کمتر از 0.05 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده‌اند و تعداد آزمایش‌ها در هر شکل نشان داده شده است. تمام تجزیه و تحلیل‌ها و نمودارها با استفاده از نرم‌افزار آماری GraphPad Prism 8 برای ویندوز (GraphPad Software Inc.، نسخه 8.4.3، سن دیگو، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.
ابتدا، ما ارتباط سطح IPA سرم را با رونوشت‌های کبد، کل بدن و میتوکندری بررسی کردیم. در پروفایل رونوشت کل، قوی‌ترین ژن مرتبط با سطح IPA سرم، MAPKAPK3 (FDR = 0.0077؛ پروتئین کیناز فعال‌شده با میتوژن 3) بود؛ در پروفایل رونوشت مرتبط با میتوکندری، قوی‌ترین ژن مرتبط، AKT1 (FDR = 0.7621؛ سرین/ترئونین کیناز 1 AKT) بود (فایل تکمیلی 1 و فایل تکمیلی 2).
سپس رونوشت‌های سراسری (n = 268؛ p < 0.01) و رونوشت‌های مرتبط با میتوکندری (n = 119؛ p < 0.05) را تجزیه و تحلیل کردیم و در نهایت آپوپتوز را به عنوان مهمترین مسیر متعارف شناسایی کردیم (p = 0.0089). برای رونوشت‌های میتوکندری مرتبط با سطوح IPA سرم، ما بر آپوپتوز (FDR = 0.00001)، میتوفاژی (FDR = 0.000029) و مسیرهای سیگنالینگ TNF (FDR = 0.000006) تمرکز کردیم (شکل 1A، جدول 2، و شکل‌های تکمیلی 1A-B).
تحلیل همپوشانی رونوشت‌های سراسری، مرتبط با میتوکندری و متیلاسیون DNA در کبد انسان در ارتباط با سطوح IPA سرم. A نشان دهنده 268 رونوشت سراسری، 119 رونوشت مرتبط با میتوکندری و رونوشت‌های متیله شده DNA است که به 3092 جایگاه CpG مرتبط با سطوح IPA سرم نگاشت شده‌اند (مقادیر p < 0.01 برای رونوشت‌های سراسری و DNA متیله شده، و مقادیر p < 0.05 برای رونوشت‌های میتوکندریایی). رونوشت‌های اصلی همپوشانی در وسط نشان داده شده‌اند (AKT1 و YKT6). B نقشه برهمکنش 13 ژن با بالاترین امتیاز برهمکنش (0.900) با سایر ژن‌ها از 56 ژن همپوشانی (ناحیه خط سیاه) که به طور قابل توجهی با سطوح IPA سرم مرتبط بودند، با استفاده از ابزار آنلاین StringDB ساخته شد. سبز: ژن‌های نگاشت شده به جزء سلولی هستی‌شناسی ژن (GO): میتوکندری (GO:0005739). AKT1 پروتئینی است که بالاترین امتیاز (0.900) را برای تعامل با سایر پروتئین‌ها بر اساس داده‌ها (بر اساس متن‌کاوی، آزمایش‌ها، پایگاه‌های داده و بیان همزمان) دارد. گره‌های شبکه نشان‌دهنده پروتئین‌ها و لبه‌ها نشان‌دهنده ارتباطات بین پروتئین‌ها هستند.
از آنجایی که متابولیت‌های میکروبیوتای روده می‌توانند ترکیب اپی‌ژنتیک را از طریق متیلاسیون DNA تنظیم کنند [32]، ما بررسی کردیم که آیا سطح IPA سرم با متیلاسیون DNA کبد مرتبط است یا خیر. ما دریافتیم که دو محل اصلی متیلاسیون مرتبط با سطح IPA سرم نزدیک به ناحیه 3 غنی از پرولین-سرین (C19orf55) و عضو 6 خانواده پروتئین شوک حرارتی B (کوچک) (HSPB6) بودند (فایل تکمیلی 3). متیلاسیون DNA مربوط به 4350 CpG (p < 0.01) با سطح IPA سرم همبستگی داشت و در مسیرهای تنظیم طول عمر غنی شده بود (p = 0.006) (شکل 1A، جدول 2 و شکل تکمیلی 1C).
برای درک مکانیسم‌های بیولوژیکی زیربنایی ارتباط بین سطوح IPA سرم، رونوشت‌های سراسری، رونوشت‌های مرتبط با میتوکندری و متیلاسیون DNA در کبد انسان، ما یک تجزیه و تحلیل همپوشانی از ژن‌های شناسایی شده در تجزیه و تحلیل مسیر قبلی انجام دادیم (شکل 1A). نتایج تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر 56 ژن همپوشانی (درون خط سیاه در شکل 1A) نشان داد که مسیر آپوپتوز (p = 0.00029) دو ژن مشترک در سه تجزیه و تحلیل را برجسته کرد: AKT1 و YKT6 (همولوگ YKT6 v-SNARE)، همانطور که در نمودار ون نشان داده شده است (شکل تکمیلی 2 و شکل 1A). جالب توجه است که ما دریافتیم که AKT1 (cg19831386) و YKT6 (cg24161647) با سطوح IPA سرم همبستگی مثبت دارند (فایل تکمیلی 3). برای شناسایی برهمکنش‌های پروتئینی بالقوه بین محصولات ژنی، ۱۳ ژن با بالاترین امتیاز ناحیه مشترک (۰.۹۰۰) را از بین ۵۶ ژن هم‌پوشان به عنوان ورودی انتخاب کردیم و یک نقشه برهمکنش ساختیم. بر اساس سطح اطمینان (اطمینان حاشیه‌ای)، ژن AKT1 با بالاترین امتیاز (۰.۹۰۰) در صدر قرار داشت (شکل ۱B).
بر اساس تجزیه و تحلیل مسیر، دریافتیم که آپوپتوز مسیر اصلی است، بنابراین بررسی کردیم که آیا درمان IPA بر آپوپتوز HSCها در شرایط آزمایشگاهی تأثیر می‌گذارد یا خیر. ما قبلاً نشان داده بودیم که دوزهای مختلف IPA (10 میکرومولار، 100 میکرومولار و 1 میلی‌مولار) برای سلول‌های LX-2 غیرسمی بودند [15]. این مطالعه نشان داد که درمان IPA در غلظت‌های 10 میکرومولار و 100 میکرومولار تعداد سلول‌های زنده و نکروزه را افزایش می‌دهد. با این حال، در مقایسه با گروه کنترل، زنده ماندن سلول‌ها در غلظت 1 میلی‌مولار IPA کاهش یافت، در حالی که میزان نکروز سلولی بدون تغییر باقی ماند (شکل 2A، B). در مرحله بعد، برای یافتن غلظت بهینه برای القای آپوپتوز در سلول‌های LX-2، 10 میکرومولار، 100 میکرومولار و 1 میلی‌مولار IPA را به مدت 24 ساعت آزمایش کردیم (شکل 2A-E و شکل تکمیلی 3A-B). جالب توجه است که IPA با غلظت‌های 10 میکرومولار و 100 میکرومولار، میزان آپوپتوز (%) را کاهش دادند، با این حال، IPA با غلظت 1 میلی‌مولار، آپوپتوز دیرهنگام و میزان آپوپتوز (%) را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد و بنابراین برای آزمایش‌های بیشتر انتخاب شد (شکل‌های 2A-D).
IPA باعث آپوپتوز سلول‌های LX-2 می‌شود. برای تعیین کمیت میزان آپوپتوز و مورفولوژی سلول‌ها با استفاده از فلوسیتومتری، از روش رنگ‌آمیزی دوگانه Annexin V و 7-AAD استفاده شد. سلول‌های BA به مدت 24 ساعت با 10 میکرومولار، 100 میکرومولار و 1 میلی‌مولار IPA یا با F–H TGF-β1 (5 نانوگرم در میلی‌لیتر) و 1 میلی‌مولار IPA در محیط بدون سرم به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. A: سلول‌های زنده (Annexin V -/ 7AAD-)؛ B: سلول‌های نکروزه (Annexin V -/ 7AAD+)؛ C، F: سلول‌های اولیه (Annexin V +/ 7AAD-)؛ D، G: سلول‌های دیررس (Annexin V+/7AAD.+)؛ E، H: درصد کل سلول‌های آپوپتوز اولیه و دیررس در میزان آپوپتوز (%). داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، n = 3 آزمایش مستقل بیان شده‌اند. مقایسه‌های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) به همراه آزمون تعقیبی بونفرونی انجام شد. *p < 0.05; ****p < 0.0001
همانطور که قبلاً نشان داده‌ایم، 5 نانوگرم در میلی‌لیتر TGF-β1 می‌تواند با افزایش بیان ژن‌های نشانگر کلاسیک، فعال‌سازی HSC را القا کند [15]. سلول‌های LX-2 با 5 نانوگرم در میلی‌لیتر TGF-β1 و 1 میلی‌مولار IPA به صورت ترکیبی تیمار شدند (شکل 2E-H). تیمار با TGF-β1 میزان آپوپتوز را تغییر نداد، با این حال، تیمار همزمان با IPA، آپوپتوز دیرهنگام و میزان آپوپتوز (%) را در مقایسه با تیمار TGF-β1 افزایش داد (شکل 2E-H). این نتایج نشان می‌دهد که 1 میلی‌مولار IPA می‌تواند آپوپتوز را در سلول‌های LX-2 مستقل از القای TGF-β1 افزایش دهد.
ما همچنین اثر IPA را بر تنفس میتوکندریایی در سلول‌های LX-2 بررسی کردیم. نتایج نشان داد که 1 میلی‌مولار IPA پارامترهای نرخ مصرف اکسیژن (OCR) را کاهش می‌دهد: تنفس غیر میتوکندریایی، تنفس پایه و حداکثر، نشت پروتون و تولید ATP در مقایسه با گروه کنترل (شکل 3A، B)، در حالی که شاخص سلامت بیوانرژتیک (BHI) تغییر نکرد.
IPA تنفس میتوکندریایی را در سلول‌های LX-2 کاهش می‌دهد. منحنی تنفس میتوکندریایی (OCR) به صورت پارامترهای تنفس میتوکندریایی (تنفس غیر میتوکندریایی، تنفس پایه، تنفس حداکثری، نشت پروتون، تولید ATP، SRC و BHI) ارائه شده است. سلول‌های A و B به ترتیب با 10 میکرومولار، 100 میکرومولار و 1 میلی‌مولار IPA به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سلول‌های C و D به ترتیب با TGF-β1 (5 نانوگرم در میلی‌لیتر) و 1 میلی‌مولار IPA در محیط بدون سرم به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. همه اندازه‌گیری‌ها با استفاده از کیت CyQuant نسبت به محتوای DNA نرمال‌سازی شدند. BHI: شاخص سلامت بیوانرژتیک؛ SRC: ظرفیت ذخیره تنفسی؛ OCR: میزان مصرف اکسیژن. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD)، n = 5 آزمایش مستقل ارائه شده‌اند. مقایسه‌های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی Bonferroni انجام شد. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ و ***p < 0.001
برای درک جامع‌تر اثر IPA بر پروفایل بیوانرژتیک سلول‌های LX-2 فعال‌شده با TGF-β1، ما فسفوریلاسیون اکسیداتیو میتوکندری را با OCR تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 3C، D). نتایج نشان داد که درمان با TGF-β1 می‌تواند حداکثر تنفس، ظرفیت ذخیره تنفسی (SRC) و BHI را در مقایسه با گروه کنترل کاهش دهد (شکل 3C، D). علاوه بر این، درمان ترکیبی تنفس پایه، نشت پروتون و تولید ATP را کاهش داد، اما SRC و BHI به طور قابل توجهی بالاتر از آنهایی بودند که با TGF-β1 درمان شدند (شکل 3C، D).
ما همچنین «آزمایش فنوتیپ انرژی سلولی» ارائه شده توسط نرم‌افزار Seahorse را انجام دادیم (شکل تکمیلی 4A-D). همانطور که در شکل تکمیلی 3B نشان داده شده است، هر دو پتانسیل متابولیک OCR و ECAR پس از درمان TGF-β1 کاهش یافتند، با این حال، هیچ تفاوتی در گروه‌های درمان ترکیبی و IPA در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد. علاوه بر این، هر دو سطح پایه و استرس OCR پس از درمان ترکیبی و IPA در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت (شکل تکمیلی 4C). جالب توجه است که الگوی مشابهی با درمان ترکیبی مشاهده شد، که در آن هیچ تغییری در سطوح پایه و استرس ECAR در مقایسه با درمان TGF-β1 مشاهده نشد (شکل تکمیلی 4C). در HSCها، کاهش فسفوریلاسیون اکسیداتیو میتوکندری و توانایی درمان ترکیبی برای بازیابی SCR و BHI پس از قرار گرفتن در معرض درمان TGF-β1، پتانسیل متابولیک (OCR و ECAR) را تغییر نداد. روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که IPA ممکن است انرژی زیستی را در HSCها کاهش دهد، که نشان می‌دهد IPA ممکن است پروفایل انرژی کمتری را القا کند که فنوتیپ HSC را به سمت غیرفعال شدن تغییر می‌دهد (شکل تکمیلی 4D).
اثر IPA بر دینامیک میتوکندری با استفاده از کمی‌سازی سه‌بعدی مورفولوژی میتوکندری و اتصالات شبکه و همچنین رنگ‌آمیزی MTR بررسی شد (شکل 4 و شکل تکمیلی 5). شکل 4 نشان می‌دهد که در مقایسه با گروه کنترل، تیمار TGF-β1 میانگین سطح، تعداد شاخه، طول کل شاخه و تعداد محل اتصال شاخه را کاهش داده (شکل 4A و B) و نسبت میتوکندری را از مورفولوژی کروی به مورفولوژی متوسط ​​تغییر داده است (شکل 4C). تنها تیمار IPA میانگین حجم میتوکندری را کاهش داده و نسبت میتوکندری را از مورفولوژی کروی به مورفولوژی متوسط ​​در مقایسه با گروه کنترل تغییر داده است (شکل 4A). در مقابل، کرویت، میانگین طول شاخه و فعالیت میتوکندری که توسط MTR وابسته به پتانسیل غشای میتوکندری ارزیابی شده است (شکل 4A و E) بدون تغییر باقی مانده و این پارامترها بین گروه‌ها تفاوتی نداشتند. روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که به نظر می‌رسد تیمار TGF-β1 و IPA شکل و اندازه میتوکندری و همچنین پیچیدگی شبکه را در سلول‌های زنده LX-2 تعدیل می‌کنند.
IPA پویایی میتوکندری و فراوانی DNA میتوکندری را در سلول‌های LX-2 تغییر می‌دهد. الف. تصاویر کانفوکال نماینده از سلول‌های زنده LX-2 که به مدت 24 ساعت در محیط بدون سرم با TGF-β1 (5 نانوگرم در میلی‌لیتر) و 1 میلی‌مولار IPA انکوبه شده‌اند، شبکه‌های میتوکندری رنگ‌آمیزی شده با Mitotracker™ Red CMXRos و هسته‌های رنگ‌آمیزی شده آبی با DAPI را نشان می‌دهند. همه داده‌ها حاوی حداقل 15 تصویر در هر گروه بودند. ما 10 تصویر Z-stack برای هر نوع نمونه به دست آوردیم. هر توالی محور Z شامل 30 برش بود که هر کدام ضخامت 9.86 میکرومتر داشتند. نوار مقیاس: 10 میکرومتر. ب. اشیاء نماینده (فقط میتوکندری) با اعمال آستانه‌گذاری تطبیقی ​​به تصویر شناسایی شدند. تجزیه و تحلیل کمی و مقایسه اتصالات شبکه مورفولوژیکی میتوکندری برای همه سلول‌ها در هر گروه انجام شد. ج. فراوانی نسبت‌های شکل میتوکندری. مقادیر نزدیک به 0 نشان دهنده اشکال کروی و مقادیر نزدیک به 1 نشان دهنده اشکال رشته‌ای هستند. محتوای DNA میتوکندریایی (mtDNA) مطابق آنچه در مواد و روش‌ها توضیح داده شده است، تعیین شد. آنالیز Mitotracker™ Red CMXRos با استفاده از فلوسیتومتری (30000 رویداد) مطابق آنچه در مواد و روش‌ها توضیح داده شده است، انجام شد. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، n = 3 آزمایش مستقل ارائه شده‌اند. مقایسه‌های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی بونفرونی انجام شد. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
سپس محتوای mtDNA در سلول‌های LX-2 را به عنوان شاخصی از تعداد میتوکندری‌ها تجزیه و تحلیل کردیم. در مقایسه با گروه کنترل، محتوای mtDNA در گروه تحت درمان با TGF-β1 افزایش یافت (شکل 4D). در مقایسه با گروه تحت درمان با TGF-β1، محتوای mtDNA در گروه درمان ترکیبی کاهش یافت (شکل 4D)، که نشان می‌دهد IPA ممکن است محتوای mtDNA و احتمالاً تعداد میتوکندری‌ها و همچنین تنفس میتوکندری را کاهش دهد (شکل 3C). علاوه بر این، به نظر می‌رسد IPA محتوای mtDNA را در درمان ترکیبی کاهش می‌دهد اما بر فعالیت میتوکندریایی با واسطه MTR تأثیری ندارد (شکل‌های 4A-C).
ما ارتباط IPA را با سطوح mRNA ژن‌های مرتبط با فیبروز، آپوپتوز، بقا و دینامیک میتوکندری در سلول‌های LX-2 بررسی کردیم (شکل 5A-D). در مقایسه با گروه کنترل، گروه تحت درمان با TGF-β1 افزایش بیان ژن‌هایی مانند زنجیره α2 کلاژن نوع I (COL1A2)، اکتین عضله صاف α (αSMA)، متالوپروتئیناز ماتریکس 2 (MMP2)، مهارکننده بافتی متالوپروتئیناز 1 (TIMP1) و ژن شبه دینامین 1 (DRP1) را نشان داد که نشان‌دهنده افزایش فیبروز و فعال‌سازی است. علاوه بر این، در مقایسه با گروه کنترل، درمان با TGF-β1 سطح mRNA گیرنده هسته‌ای پرگنان X (PXR)، کاسپاز 8 (CASP8)، MAPKAPK3، مهارکننده α سلول B، پپتید سبک تقویت‌کننده ژن فاکتور هسته‌ای κ (NFκB1A) و مهارکننده زیر واحد β کیناز فاکتور هسته‌ای κB (IKBKB) را کاهش داد (شکل 5A-D). در مقایسه با درمان با TGF-β1، درمان ترکیبی با TGF-β1 و IPA بیان COL1A2 و MMP2 را کاهش داد، اما سطح mRNA PXR، TIMP1، لنفوم سلول B-2 (BCL-2)، CASP8، NFκB1A، NFκB1-β و IKBKB را افزایش داد. درمان با IPA به طور قابل توجهی بیان MMP2، پروتئین X مرتبط با Bcl-2 (BAX)، AKT1، پروتئین آتروفی نوری 1 (OPA1) و پروتئین فیوژن میتوکندریایی 2 (MFN2) را کاهش داد، در حالی که بیان CASP8، NFκB1A، NFκB1B و IKBKB در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت. با این حال، هیچ تفاوتی در بیان کاسپاز-3 (CASP3)، فاکتور فعال کننده پپتیداز آپوپتوزی 1 (APAF1)، پروتئین فیوژن میتوکندریایی 1 (MFN1) و پروتئین شکافت 1 (FIS1) مشاهده نشد. در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که درمان با IPA بیان ژن‌های مرتبط با فیبروز، آپوپتوز، بقا و دینامیک میتوکندری را تعدیل می‌کند. داده‌های ما نشان می‌دهد که درمان با IPA فیبروز را در سلول‌های LX-2 کاهش می‌دهد. در عین حال، با تغییر فنوتیپ به سمت غیرفعال شدن، بقا را تحریک می‌کند.
IPA بیان ژن‌های فیبروبلاست، آپوپتوز، زیست‌پذیری و دینامیک میتوکندری را در سلول‌های LX-2 تعدیل می‌کند. هیستوگرام‌ها بیان mRNA را نسبت به کنترل درون‌زا (RPLP0 یا PPIA) پس از القای سلول‌های LX-2 با TGF-β1 و IPA در محیط بدون سرم به مدت 24 ساعت نشان می‌دهند. A نشان دهنده فیبروبلاست‌ها، B نشان دهنده سلول‌های آپوپتوز، C نشان دهنده سلول‌های زنده و D نشان دهنده بیان ژن دینامیک میتوکندری است. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شده‌اند، n = 3 آزمایش مستقل. مقایسه‌های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی بونفرونی انجام شد. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
سپس، تغییرات در اندازه سلول (FSC-H) و پیچیدگی سیتوپلاسمی (SSC-H) با استفاده از فلوسیتومتری (شکل 6A، B) ارزیابی شدند و تغییرات در مورفولوژی سلول پس از تیمار با IPA با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و میکروسکوپ فاز کنتراست ارزیابی شدند (شکل تکمیلی 6A-B). همانطور که انتظار می‌رفت، اندازه سلول‌ها در گروه تیمار شده با TGF-β1 در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت (شکل 6A، B)، که نشان‌دهنده گسترش کلاسیک شبکه آندوپلاسمی خشن (ER*) و فاگولیزوزوم‌ها (P) است که نشان‌دهنده فعال شدن سلول‌های بنیادی خونساز (HSC) است (شکل تکمیلی 6A). با این حال، در مقایسه با گروه تیمار شده با TGF-β1، اندازه سلول، پیچیدگی سیتوپلاسمی (شکل 6A، B) و محتوای ER* در گروه تیمار ترکیبی TGF-β1 و IPA کاهش یافت (شکل تکمیلی 6A). علاوه بر این، تیمار با IPA اندازه سلول، پیچیدگی سیتوپلاسمی (شکل‌های 6A، B)، محتوای P و ER* (شکل تکمیلی 6A) را در مقایسه با گروه کنترل کاهش داد. علاوه بر این، محتوای سلول‌های آپوپتوز شده پس از 24 ساعت تیمار با IPA در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت (فلش‌های سفید، شکل تکمیلی 6B). در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که 1 میلی‌مولار IPA می‌تواند آپوپتوز HSC را تحریک کرده و تغییرات پارامترهای مورفولوژیکی سلولی ناشی از TGF-β1 را معکوس کند، در نتیجه اندازه و پیچیدگی سلول را تنظیم می‌کند که ممکن است با غیرفعال شدن HSC مرتبط باشد.
IPA اندازه سلول و پیچیدگی سیتوپلاسمی را در سلول‌های LX-2 تغییر می‌دهد. تصاویر نمایشی از آنالیز فلوسیتومتری. این آنالیز از یک استراتژی دروازه‌ای مخصوص سلول‌های LX-2 استفاده کرد: SSC-A/FSC-A برای تعریف جمعیت سلولی، FSC-H/FSC-A برای شناسایی دوتایی‌ها و SSC-H/FSC-H برای آنالیز اندازه و پیچیدگی سلول. سلول‌ها به مدت 24 ساعت با TGF-β1 (5 نانوگرم در میلی‌لیتر) و 1 میلی‌مولار IPA در محیط بدون سرم انکوبه شدند. سلول‌های LX-2 برای آنالیز اندازه سلول و پیچیدگی سیتوپلاسمی به ربع پایین سمت چپ (SSC-H-/FSC-H-)، ربع بالا سمت چپ (SSC-H+/FSC-H-)، ربع پایین سمت راست (SSC-H-/FSC-H+) و ربع بالا سمت راست (SSC-H+/FSC-H+) توزیع شدند. ب. مورفولوژی سلول با استفاده از فلوسیتومتری و با استفاده از FSC-H (پراکندگی رو به جلو، اندازه سلول) و SSC-H (پراکندگی جانبی، پیچیدگی سیتوپلاسمی) (30000 رویداد) تجزیه و تحلیل شد. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، n = 3 آزمایش مستقل ارائه شده‌اند. مقایسه‌های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی بونفرونی انجام شد. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ ***p < 0.001 و ****p < 0.0001
متابولیت‌های روده‌ای مانند IPA به موضوع داغی برای تحقیقات تبدیل شده‌اند و این نشان می‌دهد که ممکن است اهداف جدیدی در میکروبیوتای روده کشف شوند. بنابراین جالب است که IPA، متابولیتی که ما آن را با فیبروز کبد در انسان مرتبط می‌دانیم [15]، در مدل‌های حیوانی به عنوان یک ترکیب ضد فیبروتیک بالقوه نشان داده شده است [13، 14]. در اینجا، ما برای اولین بار ارتباط بین IPA سرم و ترانسکریپتومیک کبد جهانی و متیلاسیون DNA در افراد چاق بدون دیابت نوع 2 (T2D) را نشان می‌دهیم که آپوپتوز، میتوفاژی و طول عمر و همچنین یک ژن کاندید احتمالی AKT1 را که هموستاز کبد را تنظیم می‌کند، برجسته می‌کند. یکی دیگر از نوآوری‌های مطالعه ما این است که ما تعامل درمان IPA با آپوپتوز، مورفولوژی سلولی، بیوانرژتیک میتوکندری و دینامیک را در سلول‌های LX-2 نشان دادیم که نشان‌دهنده طیف انرژی پایین‌تری است که فنوتیپ HSC را به سمت غیرفعال شدن تغییر می‌دهد و IPA را به یک کاندید بالقوه برای بهبود فیبروز کبد تبدیل می‌کند.
ما دریافتیم که آپوپتوز، میتوفاژی و طول عمر، مهم‌ترین مسیرهای متعارف غنی‌شده در ژن‌های کبدی مرتبط با IPA سرم در گردش هستند. اختلال در سیستم کنترل کیفیت میتوکندری (MQC) می‌تواند منجر به اختلال عملکرد میتوکندری، میتوفاژی و آپوپتوز شود و در نتیجه وقوع MASLD را افزایش دهد [33، 34]. بنابراین، می‌توانیم حدس بزنیم که IPA ممکن است در حفظ پویایی سلول و یکپارچگی میتوکندری از طریق آپوپتوز، میتوفاژی و طول عمر در کبد نقش داشته باشد. داده‌های ما نشان داد که دو ژن در سه سنجش مشترک بودند: YKT6 و AKT1. شایان ذکر است که YKT6 یک پروتئین SNARE است که در فرآیند ادغام غشای سلولی نقش دارد. این پروتئین با تشکیل یک کمپلکس آغازین با STX17 و SNAP29 روی اتوفاگوزوم، در اتوفاژی و میتوفاژی نقش دارد و در نتیجه ادغام اتوفاگوزوم‌ها و لیزوزوم‌ها را افزایش می‌دهد [35]. علاوه بر این، از دست دادن عملکرد YKT6 منجر به اختلال در میتوفاژی می‌شود [36]، در حالی که افزایش بیان YKT6 با پیشرفت کارسینوم هپاتوسلولار (HCC) مرتبط است و افزایش بقای سلولی را نشان می‌دهد [37]. از سوی دیگر، AKT1 مهمترین ژن تعاملی است و نقش مهمی در بیماری‌های کبدی، از جمله مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT، چرخه سلولی، مهاجرت سلولی، تکثیر، چسبندگی کانونی، عملکرد میتوکندری و ترشح کلاژن ایفا می‌کند [38-40]. مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT فعال شده می‌تواند سلول‌های بنیادی خونساز (HSCs) را که سلول‌های مسئول تولید ماتریکس خارج سلولی (ECM) هستند، فعال کند و اختلال در تنظیم آن ممکن است در بروز و پیشرفت فیبروز کبدی نقش داشته باشد [40]. علاوه بر این، AKT یکی از عوامل کلیدی بقای سلولی است که آپوپتوز سلولی وابسته به p53 را مهار می‌کند و فعال شدن AKT ممکن است با مهار آپوپتوز سلول‌های کبدی مرتبط باشد [41، 42]. نتایج به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که IPA ممکن است با تأثیرگذاری بر تصمیم هپاتوسیت‌ها بین ورود به آپوپتوز یا بقا، در آپوپتوز مرتبط با میتوکندری کبد نقش داشته باشد. این اثرات ممکن است توسط ژن‌های کاندید AKT و/یا YKT6 تنظیم شوند که برای هموستاز کبد حیاتی هستند.
نتایج ما نشان داد که IPA با غلظت 1 میلی‌مولار، مستقل از تیمار TGF-β1، باعث القای آپوپتوز و کاهش تنفس میتوکندریایی در سلول‌های LX-2 شد. شایان ذکر است که آپوپتوز یک مسیر اصلی برای رفع فیبروز و فعال‌سازی سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC) است و همچنین یک رویداد کلیدی در پاسخ فیزیولوژیکی برگشت‌پذیر فیبروز کبدی است [4، 43]. علاوه بر این، بازیابی BHI در سلول‌های LX-2 پس از درمان ترکیبی، بینش جدیدی در مورد نقش بالقوه IPA در تنظیم بیوانرژتیک میتوکندریایی ارائه داد. در شرایط استراحت و غیرفعال، سلول‌های خون‌ساز معمولاً از فسفوریلاسیون اکسیداتیو میتوکندری برای تولید ATP استفاده می‌کنند و فعالیت متابولیکی پایینی دارند. از سوی دیگر، فعال‌سازی HSC، تنفس و بیوسنتز میتوکندریایی را برای جبران نیازهای انرژی ورود به حالت گلیکولیتیک افزایش می‌دهد [44]. این واقعیت که IPA بر پتانسیل متابولیکی و ECAR تأثیری نداشت، نشان می‌دهد که مسیر گلیکولیتیک اولویت کمتری دارد. به طور مشابه، مطالعه دیگری نشان داد که IPA با غلظت 1 میلی‌مولار قادر به تعدیل فعالیت زنجیره تنفسی میتوکندری در کاردیومیوسیت‌ها، رده سلولی هپاتوسیت انسانی (Huh7) و سلول‌های اندوتلیال ورید نافی انسان (HUVEC) است. با این حال، هیچ اثری از IPA بر گلیکولیز در کاردیومیوسیت‌ها یافت نشد، که نشان می‌دهد IPA ممکن است بر بیوانرژتیک سایر انواع سلول‌ها تأثیر بگذارد [45]. بنابراین، ما حدس می‌زنیم که IPA با غلظت 1 میلی‌مولار ممکن است به عنوان یک جداکننده شیمیایی خفیف عمل کند، زیرا می‌تواند بیان ژن فیبروژنیک، مورفولوژی سلولی و بیوانرژتیک میتوکندری را بدون تغییر مقدار mtDNA به طور قابل توجهی کاهش دهد [46]. جداکننده‌های میتوکندری می‌توانند فیبروز ناشی از کشت و فعال‌سازی HSC را مهار کنند [47] و تولید ATP میتوکندریایی تنظیم‌شده یا القا شده توسط پروتئین‌های خاصی مانند پروتئین‌های جداکننده (UCP) یا ترانسلوکاز نوکلئوتید آدنین (ANT) را کاهش دهند. بسته به نوع سلول، این پدیده می‌تواند سلول‌ها را از آپوپتوز محافظت کند و/یا آپوپتوز را تقویت کند [46]. با این حال، مطالعات بیشتری برای روشن شدن نقش IPA به عنوان یک عامل جداکننده میتوکندری در غیرفعال‌سازی سلول‌های بنیادی خون‌ساز مورد نیاز است.
سپس بررسی کردیم که آیا تغییرات در تنفس میتوکندری در مورفولوژی میتوکندری در سلول‌های زنده LX-2 منعکس می‌شود یا خیر. جالب توجه است که درمان با TGF-β1 نسبت میتوکندری را از کروی به متوسط ​​تغییر می‌دهد، با کاهش شاخه‌بندی میتوکندری و افزایش بیان DRP1، یک عامل کلیدی در تقسیم میتوکندری [48]. علاوه بر این، قطعه قطعه شدن میتوکندری با پیچیدگی کلی شبکه مرتبط است و گذار از همجوشی به شکافت برای فعال‌سازی سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC) حیاتی است، در حالی که مهار شکافت میتوکندری منجر به آپوپتوز HSC می‌شود [49]. بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که درمان با TGF-β1 ممکن است باعث کاهش پیچیدگی شبکه میتوکندری با کاهش شاخه‌بندی شود، که در شکافت میتوکندری مرتبط با سلول‌های بنیادی خون‌ساز فعال (HSC) رایج‌تر است. علاوه بر این، داده‌های ما نشان داد که IPA می‌تواند نسبت میتوکندری را از شکل کروی به شکل متوسط ​​تغییر دهد و در نتیجه بیان OPA1 و MFN2 را کاهش دهد. مطالعات نشان داده‌اند که کاهش بیان OPA1 می‌تواند باعث کاهش پتانسیل غشای میتوکندری و شروع آپوپتوز سلولی شود [50]. MFN2 به عنوان واسطه ادغام میتوکندری و آپوپتوز شناخته شده است [51]. نتایج به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که القای سلول‌های LX-2 توسط TGF-β1 و/یا IPA، به نظر می‌رسد شکل و اندازه میتوکندری و همچنین وضعیت فعال‌سازی و پیچیدگی شبکه را تعدیل می‌کند.
نتایج ما نشان می‌دهد که درمان ترکیبی TGFβ-1 و IPA می‌تواند با تنظیم بیان mRNA ژن‌های فیبروز، آپوپتوز و مرتبط با بقا در سلول‌های گریزان از آپوپتوز، mtDNA و پارامترهای مورفولوژیکی سلول را کاهش دهد. در واقع، IPA سطح بیان mRNA ژن‌های AKT1 و ژن‌های مهم فیبروز مانند COL1A2 و MMP2 را کاهش داد، اما سطح بیان CASP8 را که با آپوپتوز مرتبط است، افزایش داد. نتایج ما نشان داد که پس از درمان با IPA، بیان BAX کاهش و بیان mRNA زیر واحدهای خانواده TIMP1، BCL-2 و NF-κB افزایش یافت، که نشان می‌دهد IPA می‌تواند سیگنال‌های بقا را در سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC) که از آپوپتوز می‌گریزند، تحریک کند. این مولکول‌ها ممکن است به عنوان سیگنال‌های پیش‌برنده بقا در سلول‌های بنیادی خون‌ساز فعال‌شده عمل کنند، که ممکن است با افزایش بیان پروتئین‌های ضد آپوپتوز (مانند Bcl-2)، کاهش بیان BAX پیش‌برنده آپوپتوز و تعامل پیچیده بین TIMP و NF-κB مرتبط باشد [5، 7]. IPA اثرات خود را از طریق PXR اعمال می‌کند و ما دریافتیم که درمان ترکیبی با TGF-β1 و IPA سطح بیان mRNAی PXR را افزایش می‌دهد که نشان‌دهنده سرکوب فعال‌سازی HSC است. سیگنال‌دهی PXR فعال‌شده، فعال‌سازی HSC را هم در داخل بدن و هم در شرایط آزمایشگاهی مهار می‌کند [52، 53]. نتایج ما نشان می‌دهد که IPA ممکن است با افزایش آپوپتوز، کاهش فیبروز و متابولیسم میتوکندری و افزایش سیگنال‌های بقا، که فرآیندهای معمولی تبدیل فنوتیپ HSC فعال‌شده به غیرفعال هستند، در پاکسازی HSCهای فعال‌شده شرکت کند. یکی دیگر از توضیحات احتمالی برای مکانیسم و ​​نقش بالقوه IPA در آپوپتوز این است که میتوکندری‌های ناکارآمد را در درجه اول از طریق میتوفاژی (مسیر ذاتی) و مسیر سیگنالینگ TNF خارجی (جدول 1) که مستقیماً با مسیر سیگنالینگ بقای NF-κB مرتبط است (شکل تکمیلی 7) از بین می‌برد. جالب توجه است که ژن‌های غنی‌شده مرتبط با IPA قادر به القای سیگنال‌های پیش‌آپوپتوز و پیش‌زنده‌مانی در مسیر آپوپتوز هستند [54]، که نشان می‌دهد IPA ممکن است با تعامل با این ژن‌ها، مسیر آپوپتوز یا زنده‌مانی را القا کند. با این حال، چگونگی القای آپوپتوز یا زنده‌مانی توسط IPA در طول فعال‌سازی HSC و مسیرهای مکانیسمی آن هنوز مشخص نیست.
IPA یک متابولیت میکروبی است که از تریپتوفان غذایی از طریق میکروبیوتای روده تشکیل می‌شود. مطالعات نشان داده‌اند که این ماده دارای خواص ضد التهابی، آنتی‌اکسیدانی و تنظیم اپی‌ژنتیکی در محیط روده است.[55] مطالعات نشان داده‌اند که IPA می‌تواند عملکرد سد روده را تعدیل کرده و استرس اکسیداتیو را کاهش دهد، که ممکن است در اثرات فیزیولوژیکی موضعی آن نقش داشته باشد.[56] در واقع، IPA از طریق گردش خون به اندام‌های هدف منتقل می‌شود و از آنجایی که IPA ساختار متابولیت اصلی مشابهی با مشتقات تریپتوفان، سروتونین و ایندول دارد، IPA اعمال متابولیکی را انجام می‌دهد که منجر به سرنوشت متابولیکی رقابتی می‌شود.[52] IPA ممکن است با متابولیت‌های مشتق شده از تریپتوفان برای محل‌های اتصال روی آنزیم‌ها یا گیرنده‌ها رقابت کند و به طور بالقوه مسیرهای متابولیکی طبیعی را مختل کند. این امر نیاز به مطالعات بیشتر در مورد فارماکوکینتیک و فارماکودینامیک آن را برای درک بهتر پنجره درمانی آن برجسته می‌کند.[57] هنوز مشخص نیست که آیا این امر می‌تواند در سلول‌های بنیادی خونساز (HSC) نیز رخ دهد یا خیر.
ما اذعان داریم که مطالعه ما محدودیت‌هایی دارد. برای بررسی خاص ارتباط‌های مرتبط با IPA، بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 (T2DM) را حذف کردیم. ما اذعان داریم که این امر، کاربرد گسترده یافته‌های ما را در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 و بیماری پیشرفته کبدی محدود می‌کند. اگرچه غلظت فیزیولوژیکی IPA در سرم انسان 1 تا 10 میکرومولار است [11، 20]، غلظت 1 میلی‌مولار IPA بر اساس بالاترین غلظت غیرسمی [15] و بالاترین میزان آپوپتوز، بدون هیچ تفاوتی در درصد جمعیت سلول‌های نکروتیک، انتخاب شد. اگرچه در این مطالعه از سطوح فوق فیزیولوژیکی IPA استفاده شد، در حال حاضر هیچ اجماعی در مورد دوز مؤثر IPA وجود ندارد [52]. اگرچه نتایج ما قابل توجه است، سرنوشت متابولیکی گسترده‌تر IPA همچنان یک حوزه تحقیقاتی فعال است. علاوه بر این، یافته‌های ما در مورد ارتباط بین سطح IPA سرم و متیلاسیون DNA رونوشت‌های کبدی نه تنها از سلول‌های بنیادی خونساز (HSCs) بلکه از بافت‌های کبدی نیز به دست آمده است. ما بر اساس یافته‌های قبلی خود از تجزیه و تحلیل رونوشت‌ها که نشان می‌داد IPA با فعال‌سازی سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC) مرتبط است [15]، و HSCها سلول‌های اصلی دخیل در پیشرفت فیبروز کبدی هستند، تصمیم گرفتیم از سلول‌های LX-2 انسانی استفاده کنیم. کبد از انواع مختلفی از سلول‌ها تشکیل شده است، بنابراین مدل‌های سلولی دیگری مانند سیستم کشت مشترک سلول‌های کبدی-HSC-سلول‌های ایمنی همراه با فعال‌سازی کاسپاز و قطعه قطعه شدن DNA و همچنین مکانیسم عمل از جمله سطح پروتئین باید برای مطالعه نقش IPA و تعامل آن با سایر انواع سلول‌های کبدی در نظر گرفته شوند.