از بازدید شما از nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از آخرین نسخه مرورگر استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، این سایت شامل استایل‌ها یا جاوا اسکریپت نخواهد بود.
سولفید هیدروژن (H2S) اثرات فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی متعددی بر بدن انسان دارد. هیدروسولفید سدیم (NaHS) به طور گسترده به عنوان یک ابزار دارویی برای ارزیابی اثرات H2S در آزمایش‌های بیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد. اگرچه از دست دادن H2S از محلول‌های NaHS تنها چند دقیقه طول می‌کشد، اما در برخی مطالعات حیوانی از محلول‌های NaHS به عنوان ترکیبات دهنده H2S در آب آشامیدنی استفاده شده است. این مطالعه بررسی کرد که آیا آب آشامیدنی با غلظت 30 میکرومولار NaHS تهیه شده در بطری‌های موش/موش می‌تواند حداقل برای 12 تا 24 ساعت پایدار بماند، همانطور که برخی از نویسندگان پیشنهاد کرده‌اند. محلولی از NaHS (30 میکرومولار) را در آب آشامیدنی تهیه کنید و بلافاصله آن را در بطری‌های آب موش/موش بریزید. نمونه‌ها از نوک و داخل بطری آب در زمان‌های 0، 1، 2، 3، 4، 5، 6، 12 و 24 ساعت جمع‌آوری شدند تا میزان سولفید با استفاده از روش متیلن بلو اندازه‌گیری شود. علاوه بر این، به موش‌های نر و ماده به مدت دو هفته NaHS (30 میکرومولار) تزریق شد و غلظت سولفید سرم هر دو روز در میان در طول هفته اول و در پایان هفته دوم اندازه‌گیری شد. محلول NaHS در نمونه به‌دست‌آمده از نوک بطری آب ناپایدار بود؛ به ترتیب پس از 12 و 24 ساعت 72٪ و 75٪ کاهش یافت. در نمونه‌های به‌دست‌آمده از داخل بطری‌های آب، کاهش NaHS در عرض 2 ساعت معنی‌دار نبود؛ با این حال، پس از 12 و 24 ساعت به ترتیب 47٪ و 72٪ کاهش یافت. تزریق NaHS بر سطح سولفید سرم موش‌های نر و ماده تأثیری نداشت. در نتیجه، محلول‌های NaHS تهیه‌شده از آب آشامیدنی نباید برای اهدای H2S استفاده شوند زیرا محلول ناپایدار است. این روش تجویز، حیوانات را در معرض مقادیر نامنظم و کمتر از حد انتظار NaHS قرار می‌دهد.
سولفید هیدروژن (H2S) از سال ۱۷۰۰ به عنوان یک سم مورد استفاده قرار گرفته است؛ با این حال، نقش احتمالی آن به عنوان یک مولکول سیگنال‌دهی زیستی درون‌زا توسط آبه و کیمورا در سال ۱۹۹۶ توصیف شد. در طول سه دهه گذشته، عملکردهای متعدد H2S در سیستم‌های مختلف انسانی روشن شده است که منجر به این درک شده است که مولکول‌های دهنده H2S ممکن است کاربردهای بالینی در درمان یا مدیریت برخی بیماری‌ها داشته باشند؛ برای بررسی اخیر به چیرینو و همکاران مراجعه کنید.
هیدروسولفید سدیم (NaHS) به طور گسترده به عنوان یک ابزار دارویی برای ارزیابی اثرات H2S در بسیاری از کشت‌های سلولی و مطالعات حیوانی مورد استفاده قرار گرفته است5،6،7،8. با این حال، NaHS یک دهنده ایده‌آل H2S نیست زیرا به سرعت در محلول به H2S/HS- تبدیل می‌شود، به راحتی با پلی‌سولفیدها آلوده می‌شود و به راحتی اکسید و متصاعد می‌شود4،9. در بسیاری از آزمایش‌های بیولوژیکی، NaHS در آب حل می‌شود و منجر به تبخیر غیرفعال و از دست دادن H2S10،11،12، اکسیداسیون خود به خودی H2S11،12،13 و فتولیز می‌شود14. سولفید موجود در محلول اصلی به دلیل تبخیر H2S11 بسیار سریع از بین می‌رود. در یک ظرف درباز، نیمه عمر (t1/2) H2S حدود 5 دقیقه است و غلظت آن حدود 13٪ در دقیقه کاهش می‌یابد10. اگرچه از دست دادن سولفید هیدروژن از محلول‌های NaHS تنها چند دقیقه طول می‌کشد، برخی مطالعات حیوانی از محلول‌های NaHS به عنوان منبع سولفید هیدروژن در آب آشامیدنی به مدت ۱ تا ۲۱ هفته استفاده کرده‌اند و محلول حاوی NaHS را هر ۱۲ تا ۲۴ ساعت جایگزین کرده‌اند.15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26 این عمل با اصول تحقیقات علمی سازگار نیست، زیرا دوز داروها باید بر اساس استفاده آنها در گونه‌های دیگر، به ویژه انسان، باشد.27
تحقیقات پیش‌بالینی در زیست‌پزشکی با هدف بهبود کیفیت مراقبت از بیمار یا نتایج درمان انجام می‌شود. با این حال، نتایج اکثر مطالعات حیوانی هنوز به انسان تعمیم داده نشده است28،29،30. یکی از دلایل این شکست در انتقال، عدم توجه به کیفیت روش‌شناختی مطالعات حیوانی است30. بنابراین، هدف از این مطالعه بررسی این موضوع بود که آیا محلول‌های 30 میکرومولار NaHS تهیه شده در بطری‌های آب موش صحرایی/موش خانگی می‌توانند به مدت 12 تا 24 ساعت در آب آشامیدنی پایدار بمانند، همانطور که در برخی مطالعات ادعا یا پیشنهاد شده است.
تمام آزمایش‌های این مطالعه مطابق با دستورالعمل‌های منتشر شده برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی در ایران انجام شد31. تمام گزارش‌های تجربی در این مطالعه نیز از دستورالعمل‌های ARRIVE32 پیروی کردند. کمیته اخلاق پژوهشکده علوم غدد درون‌ریز، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تمام مراحل تجربی در این مطالعه را تأیید کرد.
استات روی دی هیدرات (CAS: 5970-45-6) و کلرید فریک بی‌آب (CAS: 7705-08-0) از Biochem، Chemopahrama (Cosne-sur-Loire، فرانسه) خریداری شدند. سدیم هیدروسولفید هیدرات (CAS: 207683-19-0) و N,N-دی متیل-p-فنیلن دی آمین (DMPD) (CAS: 535-47-0) از Sigma-Aldrich (سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. ایزوفلوران از Piramal (بتلهم، پنسیلوانیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. اسید هیدروکلریک (HCl) از Merck (دارمشتات، آلمان) خریداری شد.
محلولی از NaHS (30 میکرومولار) را در آب آشامیدنی تهیه کنید و بلافاصله آن را در بطری‌های آب موش/موش بریزید. این غلظت بر اساس انتشارات متعدد با استفاده از NaHS به عنوان منبع H2S انتخاب شده است؛ به بخش بحث مراجعه کنید. NaHS یک مولکول هیدراته است که می‌تواند حاوی مقادیر مختلفی از آب هیدراتاسیون (یعنی NaHS•xH2O) باشد؛ طبق گفته سازنده، درصد NaHS مورد استفاده در مطالعه ما 70.7٪ (یعنی NaHS•1.3 H2O) بود و ما این مقدار را در محاسبات خود در نظر گرفتیم، جایی که از وزن مولکولی 56.06 گرم بر مول استفاده کردیم که وزن مولکولی NaHS بی‌آب است. آب هیدراتاسیون (که آب تبلور نیز نامیده می‌شود) مولکول‌های آبی هستند که ساختار بلوری را تشکیل می‌دهند33. هیدرات‌ها در مقایسه با بی‌آب‌ها34 خواص فیزیکی و ترمودینامیکی متفاوتی دارند.
قبل از افزودن NaHS به آب آشامیدنی، pH و دمای حلال را اندازه‌گیری کنید. بلافاصله محلول NaHS را داخل بطری آب موش/موش صحرایی در قفس حیوانات بریزید. نمونه‌ها از نوک و از داخل بطری آب در زمان‌های 0، 1، 2، 3، 4، 5، 6، 12 و 24 ساعت جمع‌آوری شدند تا میزان سولفید اندازه‌گیری شود. اندازه‌گیری سولفید بلافاصله پس از هر نمونه‌برداری انجام شد. ما از نوک لوله نمونه گرفتیم زیرا برخی مطالعات نشان داده‌اند که اندازه منافذ کوچک لوله آب می‌تواند تبخیر H2S را به حداقل برساند15،19. به نظر می‌رسد این موضوع در مورد محلول داخل بطری نیز صدق می‌کند. با این حال، این مورد در مورد محلول موجود در گردن بطری آب که سرعت تبخیر بالاتری داشت و خوداکسیدکننده بود، صدق نمی‌کرد. در واقع، حیوانات ابتدا این آب را نوشیدند.
در این مطالعه از موش‌های صحرایی نر و ماده نژاد ویستار استفاده شد. موش‌ها در قفس‌های پلی‌پروپیلن (2 تا 3 موش در هر قفس) تحت شرایط استاندارد (دمای 21 تا 26 درجه سانتیگراد، رطوبت 32 تا 40 درصد) با 12 ساعت روشنایی (7 صبح تا 7 عصر) و 12 ساعت تاریکی (7 عصر تا 7 صبح) نگهداری شدند. موش‌ها به آب لوله‌کشی دسترسی آزاد داشتند و با غذای استاندارد (شرکت خوراک دام پارس، تهران، ایران) تغذیه شدند. موش‌های صحرایی ماده (10=n، وزن بدن: 190 تا 230 گرم) و نر (10=n، وزن بدن: 320 تا 370 گرم) همسن (6 ماهه) و همسن به طور تصادفی به گروه‌های کنترل و تحت درمان با NaHS (30 میکرومولار) (5=n در هر گروه) تقسیم شدند. برای تعیین حجم نمونه، از رویکرد KISS (Keep It Simple, Stupid) استفاده کردیم که ترکیبی از تجربیات قبلی و تحلیل توان 35 است. ما ابتدا یک مطالعه آزمایشی روی 3 موش صحرایی انجام دادیم و میانگین سطح سولفید کل سرم و انحراف معیار (8.1 ± 0.81 میکرومولار) را تعیین کردیم. سپس، با در نظر گرفتن توان 80٪ و فرض سطح معنی‌داری دو طرفه 5٪، حجم نمونه اولیه (n = 5 بر اساس متون قبلی) را تعیین کردیم که با اندازه اثر استاندارد 2.02 با مقدار از پیش تعریف شده پیشنهادی فستینگ برای محاسبه حجم نمونه حیوانات آزمایشگاهی35 مطابقت داشت. پس از ضرب این مقدار در انحراف معیار (2.02 × 0.81)، اندازه اثر قابل تشخیص پیش‌بینی شده (1.6 میکرومولار) 20٪ بود که قابل قبول است. این بدان معناست که n = 5/گروه برای تشخیص تغییر میانگین 20٪ بین گروه‌ها کافی است. موش‌ها به طور تصادفی با استفاده از تابع تصادفی نرم‌افزار اکسل 36 به گروه‌های کنترل و تحت درمان با NaSH تقسیم شدند (شکل تکمیلی 1). کورسازی در سطح پیامد انجام شد و محققانی که اندازه‌گیری‌های بیوشیمیایی را انجام می‌دادند از تخصیص گروه‌ها آگاه نبودند.
گروه‌های NaHS از هر دو جنس به مدت 2 هفته با محلول 30 میکرومولار NaHS تهیه شده در آب آشامیدنی تیمار شدند. محلول تازه هر 24 ساعت یکبار در اختیار موش‌ها قرار گرفت و در این مدت وزن بدن اندازه‌گیری شد. نمونه‌های خون از نوک دم همه موش‌ها تحت بیهوشی ایزوفلوران، یک روز در میان در پایان هفته‌های اول و دوم جمع‌آوری شد. نمونه‌های خون به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 گرم سانتریفیوژ شدند، سرم جدا شد و برای اندازه‌گیری‌های بعدی اوره، کراتینین (Cr) و سولفید کل سرم در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد. اوره سرم با روش اوره‌آز آنزیمی و کراتینین سرم با روش فتومتریک Jaffe با استفاده از کیت‌های موجود در بازار (شرکت Man، تهران، ایران) و یک آنالیزور خودکار (Selectra E، شماره سریال 0-2124، هلند) تعیین شد. ضرایب تغییرات درون و بین سنجشی برای اوره و Cr کمتر از 2.5٪ بود.
روش متیلن بلو (MB) برای اندازه‌گیری سولفید کل در آب آشامیدنی و سرم حاوی NaHS استفاده می‌شود؛ MB رایج‌ترین روش برای اندازه‌گیری سولفید در محلول‌های فله و نمونه‌های بیولوژیکی است11،37. روش MB می‌تواند برای تخمین کل سولفید کل38 و اندازه‌گیری سولفیدهای معدنی به شکل H2S، HS- و S2 در فاز آبی39 استفاده شود. در این روش، گوگرد در حضور استات روی به صورت سولفید روی (ZnS) رسوب می‌کند11،38. رسوب استات روی پرکاربردترین روش برای جداسازی سولفیدها از سایر کروموفورها است11. ZnS با استفاده از HCl11 در شرایط اسیدی قوی دوباره حل شد. سولفید با نسبت استوکیومتری 1:2 در واکنشی که توسط کلرید فریک (Fe3+ به عنوان یک عامل اکسید کننده عمل می‌کند) کاتالیز می‌شود، با DMPD واکنش می‌دهد و رنگ MB را تشکیل می‌دهد که به صورت اسپکتروفتومتری در طول موج 670 نانومتر40،41 شناسایی می‌شود. حد تشخیص روش MB تقریباً 1 میکرومولار است.
در این مطالعه، 100 میکرولیتر از هر نمونه (محلول یا سرم) به یک لوله اضافه شد؛ سپس 200 میکرولیتر استات روی (1% w/v در آب مقطر)، 100 میکرولیتر DMPD (20 میلی‌مولار در 7.2 مولار HCl) و 133 میکرولیتر FeCl3 (30 میلی‌مولار در 1.2 مولار HCl) اضافه شد. مخلوط به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد و در تاریکی انکوبه شد. محلول به مدت 10 دقیقه با سرعت 10000 گرم سانتریفیوژ شد و جذب محلول رویی با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA) در طول موج 670 نانومتر خوانده شد. غلظت سولفید با استفاده از منحنی کالیبراسیون NaHS (0-100 میکرومولار) در ddH2O تعیین شد (شکل تکمیلی 2). تمام محلول‌های مورد استفاده برای اندازه‌گیری‌ها تازه تهیه شدند. ضرایب تغییرات درون و بین سنجشی برای اندازه‌گیری‌های سولفید به ترتیب 2.8٪ و 3.4٪ بود. ما همچنین کل سولفید بازیابی شده از نمونه‌های آب آشامیدنی و سرم حاوی تیوسولفات سدیم را با استفاده از روش نمونه غنی‌شده42 تعیین کردیم. بازیابی برای نمونه‌های آب آشامیدنی و سرم حاوی تیوسولفات سدیم به ترتیب 91 ± 1.1٪ (6 = n) و 93 ± 2.4٪ (6 = n) بود.
تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism نسخه 8.0.2 برای ویندوز (نرم‌افزار GraphPad، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده، www.graphpad.com) انجام شد. برای مقایسه دما و pH آب آشامیدنی قبل و بعد از افزودن NaHS، از آزمون t زوجی استفاده شد. میزان کاهش H2S در محلول حاوی NaHS به صورت درصد کاهش نسبت به جذب اولیه محاسبه شد و برای ارزیابی اینکه آیا این کاهش از نظر آماری معنی‌دار است، ما یک آنالیز واریانس یک طرفه با اندازه‌گیری‌های مکرر و به دنبال آن آزمون مقایسه چندگانه دانت انجام دادیم. وزن بدن، اوره سرم، کراتینین سرم و سولفید کل سرم در طول زمان بین موش‌های کنترل و موش‌های تحت درمان با NaHS از جنس‌های مختلف با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه مختلط (بین-درون) و به دنبال آن آزمون تعقیبی بونفرونی مقایسه شد. مقادیر P دو طرفه < 0.05 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شدند.
pH آب آشامیدنی قبل از افزودن NaHS، 7.60 ± 0.01 و پس از افزودن NaHS، 7.71 ± 0.03 بود (n = 13، p = 0.0029). دمای آب آشامیدنی 26.5 ± 0.2 بود و پس از افزودن NaHS به 26.2 ± 0.2 کاهش یافت (n = 13، p = 0.0128). محلول 30 میکرومولار NaHS را در آب آشامیدنی تهیه کرده و آن را در یک بطری آب نگهداری کنید. محلول NaHS ناپایدار است و غلظت آن با گذشت زمان کاهش می‌یابد. هنگام نمونه‌برداری از گردن بطری آب، کاهش قابل توجهی (68.0٪) در ساعت اول مشاهده شد و محتوای NaHS در محلول به ترتیب پس از 12 و 24 ساعت 72٪ و 75٪ کاهش یافت. در نمونه‌های به‌دست‌آمده از بطری‌های آب، کاهش NaHS تا 2 ساعت معنی‌دار نبود، اما پس از 12 و 24 ساعت به ترتیب 47٪ و 72٪ کاهش یافت. این داده‌ها نشان می‌دهد که درصد NaHS در محلول 30 میکرومولار تهیه‌شده در آب آشامیدنی، صرف‌نظر از محل نمونه‌برداری، پس از 24 ساعت تقریباً به یک‌چهارم مقدار اولیه کاهش یافته است (شکل 1).
پایداری محلول NaHS (30 میکرومولار) در آب آشامیدنی در بطری‌های موش صحرایی/موش. پس از آماده‌سازی محلول، نمونه‌ها از نوک و داخل بطری آب گرفته شدند. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (n = 6/گروه) ارائه شده‌اند. * و #، P < 0.05 در مقایسه با زمان 0. عکس بطری آب، نوک (با دهانه) و بدنه بطری را نشان می‌دهد. حجم نوک تقریباً 740 میکرولیتر است.
غلظت NaHS در محلول تازه تهیه شده 30 میکرومولار، 30.3 ± 0.4 میکرومولار بود (محدوده: 28.7-31.9 میکرومولار، n = 12). با این حال، پس از 24 ساعت، غلظت NaHS به مقدار کمتری کاهش یافت (میانگین: 3.0 ± 0.6 میکرومولار). همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، غلظت‌های NaHS که موش‌ها در معرض آن قرار گرفتند، در طول دوره مطالعه ثابت نبود.
وزن بدن موش‌های ماده در طول زمان به طور قابل توجهی افزایش یافت (از 205.2 ± 5.2 گرم به 213.8 ± 7.0 گرم در گروه کنترل و از 204.0 ± 8.6 گرم به 211.8 ± 7.5 گرم در گروه تحت درمان با NaHS)؛ با این حال، درمان با NaHS هیچ تاثیری بر وزن بدن نداشت (شکل 3). وزن بدن موش‌های نر در طول زمان به طور قابل توجهی افزایش یافت (از 338.6 ± 8.3 گرم به 352.4 ± 6.0 گرم در گروه کنترل و از 352.4 ± 5.9 گرم به 363.2 ± 4.3 گرم در گروه تحت درمان با NaHS)؛ با این حال، درمان با NaHS هیچ تاثیری بر وزن بدن نداشت (شکل 3).
تغییرات وزن بدن در موش‌های ماده و نر پس از تجویز NaHS (30 میکرومولار). داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده و با استفاده از آنالیز واریانس مختلط دو طرفه (درون-بین) با آزمون تعقیبی بونفرونی مقایسه شدند. n = 5 از هر جنس در هر گروه.
غلظت اوره و کراتین فسفات سرم در موش‌های کنترل و موش‌های تحت درمان با NaSH در طول مطالعه قابل مقایسه بود. علاوه بر این، درمان با NaSH بر غلظت اوره و کراتینکروم سرم تأثیری نداشت (جدول 1).
غلظت‌های پایه سولفید کل سرم بین موش‌های نر کنترل و موش‌های نر تحت درمان با NaHS (8.1 ± 0.5 میکرومولار در مقابل 9.3 ± 0.2 میکرومولار) و ماده (9.1 ± 1.0 میکرومولار در مقابل 6.1 ± 1.1 میکرومولار) قابل مقایسه بود. تجویز NaHS به مدت 14 روز هیچ تاثیری بر سطح سولفید کل سرم در موش‌های نر یا ماده نداشت (شکل 4).
تغییرات غلظت کل سولفید سرم در موش‌های نر و ماده پس از تجویز NaHS (30 میکرومولار). داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده و با استفاده از آنالیز واریانس مختلط دو طرفه (درون-درون) با آزمون تعقیبی بونفرونی مقایسه شدند. هر جنس، n = 5/گروه.
نتیجه‌گیری اصلی این مطالعه این است که آب آشامیدنی حاوی NaHS ناپایدار است: تنها حدود یک چهارم از کل محتوای سولفید اولیه را می‌توان ۲۴ ساعت پس از نمونه‌برداری از نوک و داخل بطری‌های آب موش/موش خانگی تشخیص داد. علاوه بر این، موش‌ها به دلیل از دست دادن H2S در محلول NaHS در معرض غلظت‌های ناپایدار NaHS قرار گرفتند و افزودن NaHS به آب آشامیدنی بر وزن بدن، اوره و کراتین کروم سرم یا کل سولفید سرم تأثیری نداشت.
در این مطالعه، میزان از دست دادن H2S از محلول‌های 30 میکرومولار NaHS تهیه شده در آب آشامیدنی تقریباً 3٪ در ساعت بود. در یک محلول بافر (100 میکرومولار سولفید سدیم در 10 میلی‌مولار PBS، pH 7.4)، غلظت سولفید در طول 8 ساعت 7٪ کاهش یافت11. ما قبلاً با گزارش اینکه میزان از دست دادن سولفید از محلول 54 میکرومولار NaHS در آب آشامیدنی تقریباً 2.3٪ در ساعت بود (4٪ در ساعت در 12 ساعت اول و 1.4٪ در ساعت در 12 ساعت آخر پس از آماده‌سازی)8، از تجویز داخل صفاقی NaHS دفاع کرده‌ایم. مطالعات قبلی43، از دست دادن مداوم H2S از محلول‌های NaHS را نشان دادند، که عمدتاً به دلیل تبخیر و اکسیداسیون است. حتی بدون افزودن حباب، سولفید موجود در محلول اصلی به دلیل تبخیر H2S به سرعت از دست می‌رود11. مطالعات نشان داده‌اند که در طول فرآیند رقیق‌سازی، که حدود 30 تا 60 ثانیه طول می‌کشد، حدود 5 تا 10 درصد از H2S به دلیل تبخیر از بین می‌رود6. برای جلوگیری از تبخیر H2S از محلول، محققان اقدامات متعددی از جمله هم زدن ملایم محلول12، پوشاندن محلول اصلی با فیلم پلاستیکی6 و به حداقل رساندن قرار گرفتن محلول در معرض هوا را انجام داده‌اند، زیرا سرعت تبخیر H2S به سطح مشترک هوا-مایع بستگی دارد13. اکسیداسیون خود به خودی H2S عمدتاً به دلیل یون‌های فلزات واسطه، به ویژه آهن فریک، که ناخالصی‌های موجود در آب هستند، رخ می‌دهد13. اکسیداسیون H2S منجر به تشکیل پلی‌سولفیدها (اتم‌های گوگرد متصل به پیوندهای کووالانسی)11 می‌شود. برای جلوگیری از اکسیداسیون آن، محلول‌های حاوی H2S در حلال‌های بدون اکسیژن تهیه می‌شوند44،45 و سپس به مدت 20 تا 30 دقیقه با آرگون یا نیتروژن تصفیه می‌شوند تا از اکسیژن‌زدایی اطمینان حاصل شود.11،12،37،44،45،46 دی‌اتیلن‌تری‌آمین‌پنتااستیک اسید (DTPA) یک کلات‌کننده فلزی (10-4 مولار) است که از خوداکسیداسیون HS- در محلول‌های هوازی جلوگیری می‌کند. در غیاب DTPA، سرعت خوداکسیداسیون HS- تقریباً 50٪ در مدت زمان تقریباً 3 ساعت در دمای 25 درجه سانتیگراد است37،47. علاوه بر این، از آنجایی که اکسیداسیون 1e-سولفید توسط نور ماوراء بنفش کاتالیز می‌شود، محلول باید روی یخ نگهداری و از نور محافظت شود11.
همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، NaHS هنگام حل شدن در آب به Na+ و HS-6 تفکیک می‌شود. این تفکیک توسط pK1 واکنش تعیین می‌شود که وابسته به دما است: pK1 = 3.122 + 1132/T، که در آن T از 5 تا 30 درجه سانتیگراد متغیر است و بر حسب درجه کلوین (K) اندازه‌گیری می‌شود، K = °C + 273.1548. HS- دارای pK2 بالایی است (pK2 = 19)، بنابراین در pH < 96.49، S2- تشکیل نمی‌شود یا در مقادیر بسیار کمی تشکیل می‌شود. در مقابل، HS- به عنوان یک باز عمل می‌کند و H+ را از یک مولکول H2O می‌پذیرد و H2O به عنوان یک اسید عمل می‌کند و به H2S و OH- تبدیل می‌شود.
تشکیل گاز H2S محلول در محلول NaHS (30 میکرومولار). aq، محلول آبی؛ g، گاز؛ l، مایع. در تمام محاسبات فرض شده است که pH آب = 7.0 و دمای آب = 20 درجه سانتیگراد است. ایجاد شده با BioRender.com.
علیرغم شواهدی مبنی بر ناپایداری محلول‌های NaHS، چندین مطالعه حیوانی از محلول‌های NaHS در آب آشامیدنی به عنوان یک ترکیب دهنده H2S15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26 با مدت زمان مداخله از 1 تا 21 هفته استفاده کرده‌اند (جدول 2). در طول این مطالعات، محلول NaHS هر 12 ساعت، 15، 17، 18، 24، 25 ساعت یا 24 ساعت، 19، 20، 21، 22، 23 ساعت تجدید می‌شد. نتایج ما نشان داد که موش‌ها به دلیل از دست دادن H2S از محلول NaHS در معرض غلظت‌های ناپایدار دارو قرار گرفتند و محتوای NaHS در آب آشامیدنی موش‌ها طی 12 یا 24 ساعت به طور قابل توجهی نوسان داشت (شکل 2 را ببینید). دو مورد از این مطالعات گزارش دادند که سطح H2S در آب طی 24 ساعت ثابت مانده است22 یا اینکه تنها 2 تا 3 درصد از دست دادن H2S طی 12 ساعت مشاهده شده است15، اما داده‌های پشتیبان یا جزئیات اندازه‌گیری ارائه نکردند. دو مطالعه نشان داده‌اند که قطر کوچک بطری‌های آب می‌تواند تبخیر H2S را به حداقل برساند15،19. با این حال، نتایج ما نشان داد که این امر ممکن است تنها 2 ساعت از دست دادن H2S از بطری آب را به تأخیر بیندازد، نه 12 تا 24 ساعت. هر دو مطالعه خاطرنشان می‌کنند که ما فرض می‌کنیم سطح NaHS در آب آشامیدنی تغییر نکرده است زیرا ما تغییر رنگی در آب مشاهده نکردیم. بنابراین، اکسیداسیون H2S توسط هوا قابل توجه نبود19،20. جای تعجب است که این روش ذهنی، پایداری NaHS در آب را ارزیابی می‌کند، نه تغییر غلظت آن در طول زمان را.
از دست دادن H2S در محلول NaHS به pH و دما مربوط می‌شود. همانطور که در مطالعه ما اشاره شد، حل شدن NaHS در آب منجر به تشکیل محلول قلیایی می‌شود50. هنگامی که NaHS در آب حل می‌شود، تشکیل گاز H2S محلول به مقدار pH بستگی دارد6. هرچه pH محلول کمتر باشد، نسبت NaHS موجود به صورت مولکول‌های گاز H2S بیشتر است و سولفید بیشتری از محلول آبی از دست می‌رود11. هیچ یک از این مطالعات pH آب آشامیدنی مورد استفاده به عنوان حلال NaHS را گزارش نکرده‌اند. طبق توصیه‌های سازمان بهداشت جهانی، که توسط اکثر کشورها پذیرفته شده است، pH آب آشامیدنی باید در محدوده 6.5 تا 8.55 باشد. در این محدوده pH، سرعت اکسیداسیون خود به خودی H2S تقریباً ده برابر افزایش می‌یابد13. حل شدن NaHS در آب در این محدوده pH منجر به غلظت گاز H2S محلول از 1 تا 22.5 میکرومولار می‌شود که بر اهمیت نظارت بر pH آب قبل از حل کردن NaHS تأکید می‌کند. علاوه بر این، محدوده دمایی گزارش شده در مطالعه فوق (18-26 درجه سانتیگراد) منجر به تغییر تقریباً 10 درصدی در غلظت گاز H2S محلول در محلول می‌شود، زیرا تغییرات دما pK1 را تغییر می‌دهد و تغییرات کوچک در pK1 می‌تواند تأثیر قابل توجهی بر غلظت گاز H2S محلول داشته باشد48. علاوه بر این، مدت زمان طولانی برخی مطالعات (5 ماه)22، که در طی آن انتظار می‌رود تغییرات دمایی زیادی رخ دهد، نیز این مشکل را تشدید می‌کند.
همه مطالعات به جز یکی21 از محلول 30 میکرومولار NaHS در آب آشامیدنی استفاده کردند. برای توضیح دوز مورد استفاده (یعنی 30 میکرومولار)، برخی از نویسندگان اشاره کردند که NaHS در فاز آبی دقیقاً همان غلظت گاز H2S را تولید می‌کند و محدوده فیزیولوژیکی H2S 10 تا 100 میکرومولار است، بنابراین این دوز در محدوده فیزیولوژیکی قرار دارد15،16. برخی دیگر توضیح دادند که 30 میکرومولار NaHS می‌تواند سطح H2S پلاسما را در محدوده فیزیولوژیکی، یعنی 5 تا 300 میکرومولار، حفظ کند19،20. ما غلظت NaHS در آب را 30 میکرومولار (pH = 7.0، T = 20 °C) در نظر می‌گیریم که در برخی مطالعات برای مطالعه اثرات H2S استفاده شده است. می‌توانیم محاسبه کنیم که غلظت گاز H2S محلول 14.7 میکرومولار است که حدود 50٪ از غلظت اولیه NaHS است. این مقدار مشابه مقداری است که توسط سایر نویسندگان تحت شرایط مشابه محاسبه شده است13،48.
در مطالعه ما، تجویز NaHS وزن بدن را تغییر نداد؛ این نتیجه با نتایج سایر مطالعات روی موش‌های نر22،23 و موش‌های صحرایی نر18 مطابقت دارد؛ با این حال، دو مطالعه گزارش دادند که NaSH وزن کاهش یافته بدن را در موش‌های نفرکتومی شده بازیابی کرد24،26، در حالی که سایر مطالعات تأثیر تجویز NaSH بر وزن بدن را گزارش نکردند15،16،17،19،20،21،25. علاوه بر این، در مطالعه ما، تجویز NaSH بر سطح اوره و کراتین کروم سرم تأثیری نداشت، که با نتایج گزارش دیگری25 مطابقت دارد.
این مطالعه نشان داد که افزودن NaHS به آب آشامیدنی به مدت 2 هفته، بر غلظت کل سولفید سرم در موش‌های نر و ماده تأثیری نداشت. این یافته با نتایج Sen و همکاران (16) مطابقت دارد: 8 هفته درمان با 30 میکرومولار NaHS در آب آشامیدنی، بر سطح سولفید پلاسما در موش‌های کنترل تأثیری نداشت. با این حال، آنها گزارش دادند که این مداخله، سطح کاهش یافته H2S را در پلاسمای موش‌های نفرکتومی شده بازیابی کرد. Li و همکاران (22) نیز گزارش دادند که درمان با 30 میکرومولار NaHS در آب آشامیدنی به مدت 5 ماه، سطح سولفید آزاد پلاسما را در موش‌های مسن حدود 26٪ افزایش داد. مطالعات دیگر، تغییراتی در سولفید در گردش خون پس از افزودن NaHS به آب آشامیدنی گزارش نکرده‌اند.
هفت مطالعه استفاده از سیگما NaHS را گزارش کرده‌اند15،16،19،20،21،22،23 اما جزئیات بیشتری در مورد آب هیدراتاسیون ارائه نکرده‌اند و پنج مطالعه منبع NaHS مورد استفاده در روش‌های آماده‌سازی خود را ذکر نکرده‌اند17،18،24،25،26. NaHS یک مولکول هیدراته است و محتوای آب هیدراتاسیون آن می‌تواند متفاوت باشد، که بر مقدار NaHS مورد نیاز برای تهیه محلولی با مولاریته مشخص تأثیر می‌گذارد. به عنوان مثال، محتوای NaHS در مطالعه ما NaHS•1.3 H2O بود. بنابراین، غلظت واقعی NaHS در این مطالعات ممکن است کمتر از مقادیر گزارش شده باشد.
«چطور چنین ترکیب کوتاه‌عمری می‌تواند چنین اثر طولانی‌مدتی داشته باشد؟» پوزگی و همکارانش21 این سوال را هنگام ارزیابی اثرات NaHS بر کولیت در موش‌ها پرسیدند. آن‌ها امیدوارند که مطالعات آینده بتوانند به این سوال پاسخ دهند و حدس بزنند که محلول‌های NaHS ممکن است علاوه بر H2S و دی‌سولفیدهایی که واسطه اثر NaHS21 هستند، حاوی پلی‌سولفیدهای پایدارتری باشند. احتمال دیگر این است که غلظت‌های بسیار پایین NaHS باقی‌مانده در محلول نیز ممکن است اثر مفیدی داشته باشد. در واقع، اولسون و همکارانش شواهدی ارائه کردند که نشان می‌دهد سطوح میکرومولار H2S در خون فیزیولوژیکی نیستند و باید در محدوده نانومولار باشند یا اصلاً وجود نداشته باشند13. H2S ممکن است از طریق سولفاتاسیون پروتئین، یک تغییر پس از ترجمه برگشت‌پذیر که بر عملکرد، پایداری و محلی‌سازی بسیاری از پروتئین‌ها تأثیر می‌گذارد، عمل کند52،53،54. در واقع، در شرایط فیزیولوژیکی، تقریباً 10 تا 25 درصد از بسیاری از پروتئین‌های کبد سولفیله می‌شوند53. هر دو مطالعه تخریب سریع NaHS را تأیید می‌کنند19،23 اما با کمال تعجب بیان می‌کنند که «ما غلظت NaHS را در آب آشامیدنی با جایگزینی روزانه آن کنترل کردیم.»23 یک مطالعه به طور تصادفی بیان کرد که «NaHS یک دهنده استاندارد H2S است و معمولاً در عمل بالینی برای جایگزینی خود H2S استفاده می‌شود.»18
بحث فوق نشان می‌دهد که NaHS از طریق تبخیر، اکسیداسیون و فتولیز از محلول خارج می‌شود و بنابراین پیشنهادهایی برای کاهش اتلاف H2S از محلول ارائه شده است. اول، تبخیر H2S به سطح مشترک گاز-مایع13 و pH محلول11 بستگی دارد؛ بنابراین، برای به حداقل رساندن اتلاف تبخیری، می‌توان گردن بطری آب را تا حد امکان کوچک کرد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد15،19، و pH آب را می‌توان تا حد بالایی قابل قبول (یعنی 6.5-8.551) تنظیم کرد تا اتلاف تبخیری به حداقل برسد11. دوم، اکسیداسیون خود به خودی H2S به دلیل اثرات اکسیژن و وجود یون‌های فلزات واسطه در آب آشامیدنی13 رخ می‌دهد، بنابراین اکسیژن‌زدایی آب آشامیدنی با آرگون یا نیتروژن44،45 و استفاده از کلات‌کننده‌های فلزی37،47 می‌تواند اکسیداسیون سولفیدها را کاهش دهد. سوم، برای جلوگیری از تجزیه نوری H2S، بطری‌های آب را می‌توان با فویل آلومینیومی پیچید؛ این روش همچنین در مورد مواد حساس به نور مانند استرپتوزوتوسین نیز صدق می‌کند55. در نهایت، نمک‌های سولفید معدنی (NaHS، Na2S و CaS) را می‌توان از طریق گاواژ تجویز کرد، نه اینکه طبق گزارش‌های قبلی در آب آشامیدنی حل شوند56،57،58؛ مطالعات نشان داده‌اند که سولفید سدیم رادیواکتیو که از طریق گاواژ به موش‌ها تجویز می‌شود، به خوبی جذب شده و تقریباً در تمام بافت‌ها توزیع می‌شود59. تا به امروز، اکثر مطالعات نمک‌های سولفید معدنی را به صورت داخل صفاقی تجویز کرده‌اند. با این حال، این مسیر به ندرت در محیط‌های بالینی استفاده می‌شود60. از سوی دیگر، مسیر خوراکی رایج‌ترین و ترجیحی‌ترین مسیر تجویز در انسان است61. بنابراین، توصیه می‌کنیم اثرات دهنده‌های H2S در جوندگان از طریق گاواژ دهانی ارزیابی شود.
یکی از محدودیت‌ها این است که ما سولفید را در محلول آبی و سرم با استفاده از روش MB اندازه‌گیری کردیم. روش‌های اندازه‌گیری سولفید شامل تیتراسیون ید، اسپکتروفتومتری، روش الکتروشیمیایی (پتانسیومتری، آمپرومتری، روش کولومتری و روش آمپرومتری) و کروماتوگرافی (کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) است که در میان آنها رایج‌ترین روش مورد استفاده، روش اسپکتروفتومتری MB62 است. یکی از محدودیت‌های روش MB برای اندازه‌گیری H2S در نمونه‌های بیولوژیکی این است که تمام ترکیبات حاوی گوگرد را اندازه‌گیری می‌کند و H2S63 آزاد را اندازه‌گیری نمی‌کند زیرا در شرایط اسیدی انجام می‌شود که منجر به استخراج گوگرد از منبع بیولوژیکی می‌شود64. با این حال، طبق گفته انجمن بهداشت عمومی آمریکا، MB روش استاندارد برای اندازه‌گیری سولفید در آب است65. بنابراین، این محدودیت بر نتایج اصلی ما در مورد ناپایداری محلول‌های حاوی NaHS تأثیری ندارد. علاوه بر این، در مطالعه ما، بازیابی اندازه‌گیری‌های سولفید در نمونه‌های آب و سرم حاوی NaHS به ترتیب 91٪ و 93٪ بود. این مقادیر با محدوده‌های گزارش‌شده قبلی (77-92)66 مطابقت دارند که نشان‌دهنده دقت تحلیلی قابل قبول است42. شایان ذکر است که ما از موش‌های نر و ماده مطابق با دستورالعمل‌های مؤسسه ملی بهداشت (NIH) استفاده کردیم تا از اتکای بیش از حد به مطالعات حیوانی فقط نر در مطالعات پیش‌بالینی جلوگیری کنیم67 و در صورت امکان، موش‌های نر و ماده را در نظر بگیریم68. این نکته توسط دیگران نیز مورد تأکید قرار گرفته است69،70،71.
در نتیجه، نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که محلول‌های NaHS تهیه‌شده از آب آشامیدنی به دلیل ناپایداری‌شان نمی‌توانند برای تولید H2S استفاده شوند. این روش تجویز، حیوانات را در معرض سطوح ناپایدار و پایین‌تر از حد انتظار NaHS قرار می‌دهد؛ بنابراین، یافته‌ها ممکن است برای انسان‌ها قابل استفاده نباشند.
مجموعه داده‌های مورد استفاده و/یا تحلیل‌شده در طول مطالعه‌ی حاضر، بنا به درخواست معقول، از نویسنده‌ی مسئول در دسترس است.
زابو، ک. جدول زمانی تحقیقات سولفید هیدروژن (H2S): از سم محیطی تا واسطه بیولوژیکی. بیوشیمی و فارماکولوژی 149، 5-19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
آبه، ک. و کیمورا، ه. نقش احتمالی سولفید هیدروژن به عنوان یک تعدیل‌کننده عصبی درون‌زا. مجله علوم اعصاب، 16، 1066-1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
چیرینو، جی.، سابو، سی. و پاپاپتروپولوس، ای. نقش فیزیولوژیکی سولفید هیدروژن در سلول‌ها، بافت‌ها و اندام‌های پستانداران. مرورهایی در فیزیولوژی و زیست‌شناسی مولکولی 103، 31-276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
دیلون، کی. ام، کارازون، آر. جی، ماتسون، جی. بی، و کاشفی، کی. نویدبخش تکامل سیستم‌های دارورسانی سلولی برای اکسید نیتریک و سولفید هیدروژن: عصر جدیدی از پزشکی شخصی‌سازی‌شده. بیوشیمی و فارماکولوژی ۱۷۶، ۱۱۳۹۳۱. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (۲۰۲۰).
سان، ایکس. و همکاران. تجویز طولانی‌مدت یک دهنده سولفید هیدروژن با رهایش آهسته می‌تواند از آسیب ایسکمی/خونرسانی مجدد میوکارد جلوگیری کند. گزارش‌های علمی ۷، ۳۵۴۱. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
سیتدیکووا، جی اف، فوکس، آر.، کاینز، دبلیو.، ویگر، تی ام و هرمان، ای. فسفوریلاسیون کانال BK حساسیت به سولفید هیدروژن (H2S) را تنظیم می‌کند. Frontiers in Physiology 5، 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova، GF، Weiger، TM و Hermann، A. سولفید هیدروژن فعالیت کانال پتاسیم فعال شده با کلسیم (BK) را در سلول‌های تومور هیپوفیز موش صحرایی افزایش می‌دهد. Archit. Pfluegers. 459، 389-397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
جدّی، س. و همکاران. سولفید هیدروژن اثر محافظتی نیتریت را در برابر آسیب ایسکمی-ریپرفیوژن میوکارد در موش‌های صحرایی دیابتی نوع 2 افزایش می‌دهد. اکسید نیتریک 124، 15-23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
کوروینو، آ. و همکاران. روندهای شیمی اهداکنندگان H2S و تأثیر آن بر بیماری‌های قلبی عروقی. آنتی‌اکسیدان‌ها 10، 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
دی‌لئون، ای‌آر، استوی، جی‌اف، و اولسون، کی‌آر (۲۰۱۲). تلفات غیرفعال سولفید هیدروژن در آزمایش‌های بیولوژیکی. بیوشیمی تحلیلی ۴۲۱، ۲۰۳–۲۰۷. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (۲۰۱۲).
ناگی، پ. و همکاران. جنبه‌های شیمیایی اندازه‌گیری سولفید هیدروژن در نمونه‌های فیزیولوژیکی. Biochimica et Biophysical Acta 1840، 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
کلاین، LL.D. تعیین اسپکتروفتومتری سولفید هیدروژن در آب‌های طبیعی. Limnol. Oceanogr. 14، 454-458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
اولسون، کی آر (۲۰۱۲). آموزش عملی در شیمی و زیست‌شناسی سولفید هیدروژن. «آنتی‌اکسیدان‌ها». سیگنالینگ ردوکس. ۱۷، ۳۲–۴۴. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (۲۰۱۲).