از بازدید شما از nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از آخرین نسخه مرورگر استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، این سایت شامل استایل‌ها یا جاوا اسکریپت نخواهد بود.
سینتون 3-(آنتراسن-9-ایل)-2-سیانوآکریلوئیل کلرید 4 سنتز شد و از طریق واکنش آن با نوکلئوفیل‌های مختلف نیتروژن، برای سنتز انواع ترکیبات هتروسیکلیک بسیار فعال استفاده شد. ساختار هر ترکیب هتروسیکلیک سنتز شده با استفاده از طیف‌سنجی و آنالیز عنصری به طور کامل مشخص شد. ده مورد از سیزده ترکیب هتروسیکلیک جدید، اثربخشی امیدوارکننده‌ای در برابر باکتری‌های مقاوم به چند دارو (MRSA) نشان دادند. در میان آنها، ترکیبات 6، 7، 10، 13b و 14 بالاترین فعالیت ضدباکتریایی را با هاله‌های مهار نزدیک به 4 سانتی‌متر نشان دادند. با این حال، مطالعات داکینگ مولکولی نشان داد که این ترکیبات میل ترکیبی متفاوتی با پروتئین اتصال‌دهنده پنی‌سیلین 2a (PBP2a)، یک هدف کلیدی برای مقاومت MRSA، دارند. برخی از ترکیبات مانند 7، 10 و 14 میل ترکیبی اتصال و پایداری برهمکنش بالاتری در محل فعال PBP2a در مقایسه با لیگاند کو-کریستالی شده کینازولینون نشان دادند. در مقابل، ترکیبات 6 و 13b امتیاز داکینگ پایین‌تری داشتند اما همچنان فعالیت ضدباکتریایی قابل توجهی از خود نشان دادند، به طوری که ترکیب 6 کمترین مقادیر MIC (9.7 میکروگرم در 100 میکرولیتر) و MBC (78.125 میکروگرم در 100 میکرولیتر) را داشت. تجزیه و تحلیل داکینگ، برهمکنش‌های کلیدی از جمله پیوند هیدروژنی و انباشتگی π، به ویژه با باقیمانده‌هایی مانند Lys 273، Lys 316 و Arg 298 را نشان داد که به عنوان برهمکنش‌کننده با لیگاند متبلور شده در ساختار کریستالی PBP2a شناسایی شدند. این باقیمانده‌ها برای فعالیت آنزیمی PBP2a ضروری هستند. این نتایج نشان می‌دهد که ترکیبات سنتز شده ممکن است به عنوان داروهای ضد MRSA امیدوارکننده عمل کنند و اهمیت ترکیب داکینگ مولکولی با سنجش‌های زیستی را برای شناسایی کاندیداهای درمانی مؤثر برجسته می‌کنند.
در چند سال اول این قرن، تلاش‌های تحقیقاتی عمدتاً بر توسعه روش‌ها و رویه‌های جدید و ساده برای سنتز چندین سیستم هتروسیکل نوآورانه با فعالیت ضدمیکروبی با استفاده از مواد اولیه در دسترس متمرکز بود.
بخش‌های آکریلونیتریل به عنوان مواد اولیه مهم برای سنتز بسیاری از سیستم‌های هتروسیکلیک قابل توجه در نظر گرفته می‌شوند زیرا ترکیبات بسیار واکنش‌پذیری هستند. علاوه بر این، مشتقات 2-سیانوآکریلوئیل کلرید در سال‌های اخیر به طور گسترده برای توسعه و سنتز محصولات با اهمیت حیاتی در زمینه کاربردهای دارویی، مانند واسطه‌های دارویی1،2،3، پیش‌سازهای عوامل ضد HIV، ضد ویروسی، ضد سرطانی، ضد باکتریایی، ضد افسردگی و آنتی‌اکسیدانی4،5،6،7،8،9،10 مورد استفاده قرار گرفته‌اند. اخیراً، اثربخشی بیولوژیکی آنتراسن و مشتقات آن، از جمله خواص آنتی‌بیوتیکی، ضد سرطانی11،12، ضد باکتریایی13،14،15 و حشره‌کشی16،17، توجه زیادی را به خود جلب کرده است18،19،20،21. ترکیبات ضد میکروبی حاوی بخش‌های آکریلونیتریل و آنتراسن در شکل‌های 1 و 2 نشان داده شده است.
طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی (WHO) (2021)، مقاومت ضدمیکروبی (AMR) یک تهدید جهانی برای سلامت و توسعه است22،23،24،25. بیماران قابل درمان نیستند و در نتیجه مدت اقامت در بیمارستان طولانی‌تر و نیاز به داروهای گران‌تر و همچنین افزایش مرگ و میر و ناتوانی افزایش می‌یابد. فقدان داروهای ضدمیکروبی مؤثر اغلب منجر به شکست درمان برای عفونت‌های مختلف، به ویژه در طول شیمی‌درمانی و جراحی‌های بزرگ می‌شود.
طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی ۲۰۲۴، استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) و اشریشیا کلی در فهرست پاتوژن‌های دارای اولویت قرار دارند. هر دو باکتری در برابر بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم هستند، بنابراین عفونت‌هایی را نشان می‌دهند که درمان و کنترل آنها دشوار است و نیاز مبرمی به توسعه ترکیبات ضدمیکروبی جدید و مؤثر برای رفع این مشکل وجود دارد. آنتراسن و مشتقات آن، ضدمیکروبی‌های شناخته‌شده‌ای هستند که می‌توانند بر روی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی عمل کنند. هدف از این مطالعه، سنتز یک مشتق جدید است که بتواند با این پاتوژن‌های خطرناک برای سلامتی مبارزه کند.
سازمان بهداشت جهانی (WHO) گزارش می‌دهد که بسیاری از پاتوژن‌های باکتریایی در برابر چندین آنتی‌بیوتیک مقاوم هستند، از جمله استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)، که یک علت شایع عفونت در جامعه و مراکز مراقبت‌های بهداشتی است. گزارش شده است که بیماران مبتلا به عفونت‌های MRSA، 64 درصد بیشتر از بیماران مبتلا به عفونت‌های حساس به دارو، میزان مرگ و میر دارند. علاوه بر این، E. coli یک خطر جهانی محسوب می‌شود زیرا آخرین خط دفاعی در برابر انتروباکتریاسه‌های مقاوم به کارباپنم (یعنی E. coli) کولیستین است، اما اخیراً باکتری‌های مقاوم به کولیستین در چندین کشور گزارش شده‌اند. 22،23،24،25
بنابراین، طبق برنامه اقدام جهانی سازمان بهداشت جهانی در مورد مقاومت ضدمیکروبی26، نیاز مبرمی به کشف و سنتز مواد ضدمیکروبی جدید وجود دارد. پتانسیل بالای آنتراسن و آکریلونیتریل به عنوان عوامل ضدباکتری27، ضدقارچ28، ضدسرطان29 و آنتی‌اکسیدان30 در مقالات متعدد منتشر شده برجسته شده است. از این نظر، می‌توان گفت که این مشتقات کاندیداهای خوبی برای استفاده در برابر استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) هستند.
مرور منابع قبلی ما را بر آن داشت تا مشتقات جدیدی را در این دسته‌ها سنتز کنیم. بنابراین، مطالعه حاضر با هدف توسعه سیستم‌های هتروسیکلیک جدید حاوی بخش‌های آنتراسن و آکریلونیتریل، ارزیابی اثربخشی ضدمیکروبی و ضدباکتریایی آنها و بررسی برهمکنش‌های اتصال بالقوه آنها با پروتئین اتصال‌دهنده پنی‌سیلین 2a (PBP2a) با استفاده از داکینگ مولکولی انجام شد. بر اساس مطالعات قبلی، مطالعه حاضر سنتز، ارزیابی بیولوژیکی و تجزیه و تحلیل محاسباتی سیستم‌های هتروسیکلیک را برای شناسایی عوامل امیدوارکننده استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) با فعالیت مهاری قوی PBP2a ادامه داد31،32،33،34،35،36،37،38،39،40،41،42،43،44،45،46،47،48،49.
تحقیق فعلی ما بر سنتز و ارزیابی ضدمیکروبی ترکیبات هتروسیکل جدید حاوی بخش‌های آنتراسن و اکریلونیتریل متمرکز است. 3-(آنتراسن-9-ایل)-2-سیانوآکریلوئیل کلرید 4 تهیه و به عنوان بلوک سازنده برای ساخت سیستم‌های هتروسیکل جدید مورد استفاده قرار گرفت.
ساختار ترکیب ۴ با استفاده از داده‌های طیفی تعیین شد. طیف ۱H-NMR وجود CH= را در ۹.۲۶ ppm نشان داد، طیف IR وجود یک گروه کربونیل را در ۱۷۳۷ cm−۱ و یک گروه سیانو را در ۲۲۲۴ cm−۱ نشان داد و طیف ۱۳CNMR نیز ساختار پیشنهادی را تأیید کرد (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
سنتز 3-(آنتراسن-9-ایل)-2-سیانوآکریلوئیل کلرید 4 با هیدرولیز گروه‌های آروماتیک 250، 41، 42، 53 با محلول اتانولی هیدروکسید سدیم (10%) انجام شد تا اسیدهای 354، 45، 56 تولید شوند که سپس با تیونیل کلرید در حمام آب واکنش داده شدند تا مشتق آکریلوئیل کلرید 4 با بازده بالا (88.5%)، مطابق شکل 3، به دست آید.
برای ایجاد ترکیبات هتروسیکلیک جدید با اثر ضدباکتریایی مورد انتظار، واکنش آسیل کلرید ۴ با دی‌نوکلئوفیل‌های مختلف انجام شد.
اسید کلرید ۴ به مدت یک ساعت در دمای ۰ درجه با هیدرازین هیدرات واکنش داده شد. متأسفانه، پیرازولون ۵ به دست نیامد. محصول، مشتقی از آکریل آمید بود که ساختار آن توسط داده‌های طیفی تأیید شد. طیف IR آن، نوارهای جذبی C=O را در ۱۷۲۰ cm−۱، C≡N را در ۲۲۲۸ cm−۱ و NH را در ۳۴۲۴ cm−۱ نشان داد. طیف ۱H-NMR سیگنال تبادلی تک‌تایی پروتون‌های اولفین و پروتون‌های NH را در ۹.۳ ppm نشان داد (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
دو مول اسید کلرید ۴ با یک مول فنیل هیدرازین واکنش داده شد تا مشتق N-فنیل اکریلوئیل هیدرازین ۷ با بازده خوب (۷۷٪) تولید شود (شکل ۵). ساختار ۷ با داده‌های طیف‌سنجی مادون قرمز تأیید شد که جذب دو گروه C=O را در ۱۶۹۱ و ۱۶۷۱ cm−۱، جذب گروه CN را در ۲۲۲۲ cm−۱ و جذب گروه NH را در ۳۲۴۵ cm−۱ نشان داد و طیف ۱H-NMR آن، گروه CH را در ۹.۱۵ و ۸.۸۱ ppm و پروتون NH را در ۱۰.۸۸ ppm نشان داد (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
در این مطالعه، واکنش آسیل کلرید ۴ با ۱،۳-دینوکلئوفیل‌ها بررسی شد. واکنش آسیل کلرید ۴ با ۲-آمینوپیریدین در ۱،۴-دی‌اکسان با TEA به عنوان باز در دمای اتاق، مشتق آکریل آمید ۸ را ایجاد کرد (شکل ۵)، که ساختار آن با استفاده از داده‌های طیفی شناسایی شد. طیف‌های IR نوارهای جذبی سیانو کشیده شده در ۲۲۲۲ cm−۱، NH₂ در ۳۱۴۸ cm−۱ و کربونیل در ۱۶۶۵ cm−۱ را نشان دادند؛ طیف‌های ۱H NMR وجود پروتون‌های الفین را در ۹.۱۴ ppm تأیید کردند (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
ترکیب ۴ با تیواوره واکنش می‌دهد و پیریمیدینتیون ۹ تولید می‌کند؛ ترکیب ۴ با تیوسمی‌کاربازید واکنش می‌دهد و مشتق تیوپیرازول ۱۰ را تولید می‌کند (شکل ۵). ساختار ترکیبات ۹ و ۱۰ با آنالیز طیفی و عنصری تأیید شد (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
تترازین-۳-تیول ۱۱ با واکنش ترکیب ۴ با تیوکاربازید به عنوان یک ۱،۴-دینوکلئوفیل تهیه شد (شکل ۵) و ساختار آن با طیف‌سنجی و آنالیز عنصری تأیید شد. در طیف مادون قرمز، پیوند C=N در ۱۶۱۹ cm−۱ ظاهر شد. در همان زمان، طیف ۱H-NMR آن، سیگنال‌های چند صفحه‌ای پروتون‌های آروماتیک را در ۷.۷۸-۸.۶۶ ppm و پروتون‌های SH را در ۳.۳۱ ppm حفظ کرد (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
آکریلوئیل کلرید 4 با 1،2-دی‌آمینوبنزن، 2-آمینوتیوفنول، آنترانیلیک اسید، 1،2-دی‌آمینواتان و اتانول‌آمین به عنوان 1،4-دینوکلئوفیل واکنش می‌دهد و سیستم‌های هتروسیکلیک جدیدی تشکیل می‌دهد (13-16).
ساختار این ترکیبات تازه سنتز شده با آنالیز طیفی و عنصری تأیید شد (به بخش آزمایش مراجعه کنید). مشتق 2-هیدروکسی فنیل آکریل آمید 17 با واکنش با 2-آمینوفنول به عنوان یک دی نوکلئوفیل به دست آمد (شکل 6) و ساختار آن با آنالیز طیفی و عنصری تأیید شد. طیف مادون قرمز ترکیب 17 نشان داد که سیگنال‌های C=O و C≡N به ترتیب در 1681 و 2226 cm−1 ظاهر شدند. در همین حال، طیف 1H-NMR آن سیگنال تکی پروتون الفین را در 9.19 ppm حفظ کرد و پروتون OH در 9.82 ppm ظاهر شد (به بخش آزمایش مراجعه کنید).
واکنش اسید کلرید ۴ با یک نوکلئوفیل (مثلاً اتیل آمین، ۴-تولوئیدین و ۴-متوکسی آنیلین) در دی اکسان به عنوان حلال و TEA به عنوان کاتالیزور در دمای اتاق، مشتقات آکریل آمید کریستالی سبز ۱۸، ۱۹a و ۱۹b را به همراه داشت. داده‌های عنصری و طیفی ترکیبات ۱۸، ۱۹a و ۱۹b ساختار این مشتقات را تأیید کردند (به بخش آزمایش مراجعه کنید) (شکل ۷).
پس از غربالگری فعالیت ضدمیکروبی ترکیبات مصنوعی مختلف، نتایج متفاوتی به دست آمد که در جدول 1 و شکل 8 نشان داده شده است (به فایل شکل مراجعه کنید). تمام ترکیبات آزمایش شده درجات مختلفی از مهار را در برابر باکتری گرم مثبت MRSA نشان دادند، در حالی که باکتری گرم منفی اشریشیا کلی مقاومت کاملی در برابر همه ترکیبات نشان داد. ترکیبات آزمایش شده را می‌توان بر اساس قطر هاله عدم رشد در برابر MRSA به سه دسته تقسیم کرد. دسته اول فعال‌ترین و شامل پنج ترکیب (6، 7، 10، 13b و 14) بود. قطر هاله عدم رشد این ترکیبات نزدیک به 4 سانتی‌متر بود؛ فعال‌ترین ترکیبات در این دسته ترکیبات 6 و 13b بودند. دسته دوم نسبتاً فعال بود و شامل پنج ترکیب دیگر (11، 13a، 15، 18 و 19a) بود. هاله عدم رشد این ترکیبات از 3.3 تا 3.65 سانتی‌متر متغیر بود، که ترکیب 11 بزرگترین هاله عدم رشد 3.65 ± 0.1 سانتی‌متر را نشان داد. از سوی دیگر، گروه آخر شامل سه ترکیب (8، 17 و 19b) با کمترین فعالیت ضدمیکروبی (کمتر از 3 سانتی‌متر) بود. شکل 9 توزیع مناطق مهار رشد مختلف را نشان می‌دهد.
بررسی بیشتر فعالیت ضدمیکروبی ترکیبات آزمایش‌شده شامل تعیین MIC و MBC برای هر ترکیب بود. نتایج کمی متفاوت بود (همانطور که در جداول 2، 3 و شکل 10 نشان داده شده است (به فایل شکل مراجعه کنید))، و ظاهراً ترکیبات 7، 11، 13a و 15 به عنوان بهترین ترکیبات طبقه‌بندی شدند. آنها کمترین مقادیر MIC و MBC را داشتند (39.06 میکروگرم در 100 میکرولیتر). اگرچه ترکیبات 7 و 8 مقادیر MIC کمتری داشتند (9.7 میکروگرم در 100 میکرولیتر)، مقادیر MBC آنها بالاتر بود (78.125 میکروگرم در 100 میکرولیتر). بنابراین، آنها ضعیف‌تر از ترکیبات ذکر شده قبلی در نظر گرفته شدند. با این حال، این شش ترکیب مؤثرترین ترکیبات آزمایش شده بودند، زیرا مقادیر MBC آنها کمتر از 100 میکروگرم در 100 میکرولیتر بود.
ترکیبات (10، 14، 18 و 19b) در مقایسه با سایر ترکیبات آزمایش‌شده، فعالیت کمتری داشتند، زیرا مقادیر MBC آنها از 156 تا 312 میکروگرم در 100 میکرولیتر متغیر بود. از سوی دیگر، ترکیبات (8، 17 و 19a) کمترین امید را داشتند، زیرا بالاترین مقادیر MBC (به ترتیب 625، 625 و 1250 میکروگرم در 100 میکرولیتر) را داشتند.
در نهایت، با توجه به سطوح تحمل نشان داده شده در جدول 3، ترکیبات آزمایش شده را می‌توان بر اساس نحوه عملکردشان به دو دسته تقسیم کرد: ترکیباتی با اثر باکتری‌کشی (7، 8، 10، 11، 13a، 15، 18، 19b) و ترکیباتی با اثر ضد باکتری (6، 13b، 14، 17، 19a). در میان آنها، ترکیبات 7، 11، 13a و 15 ترجیح داده می‌شوند که فعالیت کشندگی را در غلظت بسیار پایین (39.06 میکروگرم در 100 میکرولیتر) نشان می‌دهند.
ده مورد از سیزده ترکیب آزمایش‌شده، پتانسیل مقابله با استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) مقاوم به آنتی‌بیوتیک را نشان دادند. بنابراین، غربالگری بیشتر با پاتوژن‌های مقاوم‌تر به آنتی‌بیوتیک (به‌ویژه ایزوله‌های محلی که باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی بیماری‌زا را پوشش می‌دهند) و مخمرهای بیماری‌زا و همچنین آزمایش سیتوتوکسیک هر ترکیب برای ارزیابی ایمنی آن توصیه می‌شود.
مطالعات داکینگ مولکولی برای ارزیابی پتانسیل ترکیبات سنتز شده به عنوان مهارکننده‌های پروتئین اتصال‌دهنده پنی‌سیلین 2a (PBP2a) در استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) انجام شد. PBP2a یک آنزیم کلیدی دخیل در بیوسنتز دیواره سلولی باکتریایی است و مهار این آنزیم با تشکیل دیواره سلولی تداخل می‌کند و در نهایت منجر به لیز باکتری و مرگ سلولی می‌شود.1 نتایج داکینگ در جدول 4 فهرست شده و با جزئیات بیشتر در فایل داده‌های تکمیلی شرح داده شده است و نتایج نشان می‌دهد که چندین ترکیب، به ویژه باقیمانده‌های جایگاه فعال کلیدی مانند Lys 273، Lys 316 و Arg 298، میل ترکیبی قوی برای PBP2a نشان می‌دهند. برهمکنش‌ها، از جمله پیوند هیدروژنی و انباشتگی π، بسیار شبیه به برهمکنش‌های لیگاند کو-کریستالی شده کینازولینون (CCL) بودند که نشان‌دهنده پتانسیل این ترکیبات به عنوان مهارکننده‌های قوی است.
داده‌های داکینگ مولکولی، همراه با سایر پارامترهای محاسباتی، قویاً نشان دادند که مهار PBP2a مکانیسم کلیدی مسئول فعالیت ضدباکتریایی مشاهده‌شده این ترکیبات است. نمرات داکینگ و مقادیر جذر میانگین مربعات انحراف (RMSD) میل ترکیبی و پایداری اتصال را بیشتر نشان دادند و از این فرضیه پشتیبانی کردند. همانطور که در جدول 4 نشان داده شده است، در حالی که چندین ترکیب میل ترکیبی خوبی نشان دادند، برخی از ترکیبات (به عنوان مثال، 7، 9، 10 و 14) امتیاز داکینگ بالاتری نسبت به لیگاند متبلور شده داشتند، که نشان می‌دهد آنها ممکن است تعاملات قوی‌تری با باقیمانده‌های جایگاه فعال PBP2a داشته باشند. با این حال، فعال‌ترین ترکیبات زیستی 6 و 13b امتیاز داکینگ کمی پایین‌تری (به ترتیب -5.98 و -5.63) در مقایسه با سایر لیگاندها نشان دادند. این نشان می‌دهد که اگرچه می‌توان از نمرات داکینگ برای پیش‌بینی میل ترکیبی استفاده کرد، عوامل دیگر (به عنوان مثال، پایداری لیگاند و تعاملات مولکولی در محیط بیولوژیکی) نیز نقش کلیدی در تعیین فعالیت ضدباکتریایی دارند. نکته قابل توجه این است که مقادیر RMSD تمام ترکیبات سنتز شده کمتر از 2 آنگستروم بود که تأیید می‌کند حالت‌های اتصال آنها از نظر ساختاری با ترکیب اتصال لیگاند متبلور شده سازگار است و پتانسیل آنها را به عنوان مهارکننده‌های قوی PBP2a بیشتر تأیید می‌کند.
اگرچه نمرات داکینگ و مقادیر RMS پیش‌بینی‌های ارزشمندی ارائه می‌دهند، اما همبستگی بین این نتایج داکینگ و فعالیت ضدمیکروبی در نگاه اول همیشه واضح نیست. اگرچه مهار PBP2a به عنوان یک عامل کلیدی مؤثر بر فعالیت ضدمیکروبی به شدت پشتیبانی می‌شود، اما چندین تفاوت نشان می‌دهد که سایر خواص بیولوژیکی نیز نقش مهمی ایفا می‌کنند. ترکیبات 6 و 13b با وجود نمرات داکینگ پایین‌تر در مقایسه با ترکیبات 7، 9، 10 و 14، بالاترین فعالیت ضدمیکروبی را نشان دادند، با قطر هاله مهار 4 سانتی‌متر و کمترین مقادیر MIC (9.7 میکروگرم در 100 میکرولیتر) و MBC (78.125 میکروگرم در 100 میکرولیتر). این نشان می‌دهد که اگرچه مهار PBP2a به فعالیت ضدمیکروبی کمک می‌کند، عواملی مانند حلالیت، فراهمی زیستی و پویایی تعامل در محیط باکتریایی نیز بر فعالیت کلی تأثیر می‌گذارند. شکل 11 حالت‌های داکینگ آنها را نشان می‌دهد که نشان می‌دهد هر دو ترکیب، حتی با نمرات اتصال نسبتاً پایین، هنوز هم قادر به تعامل با باقیمانده‌های کلیدی PBP2a هستند و به طور بالقوه کمپلکس مهار را تثبیت می‌کنند. این نشان می‌دهد که اگرچه داکینگ مولکولی بینش‌های مهمی در مورد مهار PBP2a ارائه می‌دهد، اما برای درک کامل اثرات ضد میکروبی این ترکیبات در دنیای واقعی، باید سایر عوامل بیولوژیکی نیز در نظر گرفته شوند.
با استفاده از ساختار کریستالی PBP2a (شناسه PDB: 4CJN)، نقشه‌های برهمکنش دوبعدی و سه‌بعدی از فعال‌ترین ترکیبات 6 و 13b که با پروتئین اتصال‌دهنده پنی‌سیلین 2a (PBP2a) استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) متصل شده‌اند، ساخته شدند. این نقشه‌ها الگوهای برهمکنش این ترکیبات را با لیگاند کو-کریستالی‌شده کینازولینون (CCL) که دوباره متصل شده است، مقایسه می‌کنند و برهمکنش‌های کلیدی مانند پیوند هیدروژنی، انباشتگی π و برهمکنش‌های یونی را برجسته می‌کنند.
الگوی مشابهی برای ترکیب 7 مشاهده شد که امتیاز داکینگ نسبتاً بالایی (-6.32) و قطر هاله عدم رشد مشابه (3.9 سانتی‌متر) با ترکیب 10 نشان داد. با این حال، MIC آن (39.08 میکروگرم در 100 میکرولیتر) و MBC آن (39.06 میکروگرم در 100 میکرولیتر) به طور قابل توجهی بالاتر بود، که نشان می‌دهد برای نشان دادن اثر ضد باکتریایی به غلظت‌های بالاتری نیاز دارد. این نشان می‌دهد که اگرچه ترکیب 7 در مطالعات داکینگ میل ترکیبی قوی نشان داد، عواملی مانند فراهمی زیستی، جذب سلولی یا سایر خواص فیزیکوشیمیایی ممکن است اثربخشی بیولوژیکی آن را محدود کنند. اگرچه ترکیب 7 خواص باکتری‌کشی نشان داد، اما در مقایسه با ترکیبات 6 و 13b در مهار رشد باکتری‌ها کمتر مؤثر بود.
ترکیب 10 با بالاترین امتیاز داکینگ (-6.40) تفاوت چشمگیرتری را نشان داد که نشان‌دهنده میل ترکیبی قوی با PBP2a است. با این حال، قطر ناحیه مهار آن (3.9 سانتی‌متر) با ترکیب 7 قابل مقایسه بود و MBC آن (312 میکروگرم در 100 میکرولیتر) به طور قابل توجهی بالاتر از ترکیبات 6، 7 و 13b بود که نشان‌دهنده فعالیت باکتری‌کشی ضعیف‌تر است. این نشان می‌دهد که با وجود پیش‌بینی‌های خوب داکینگ، ترکیب 10 به دلیل سایر عوامل محدودکننده مانند حلالیت، پایداری یا نفوذپذیری ضعیف غشای باکتری، در کشتن MRSA کمتر مؤثر بوده است. این نتایج از این درک پشتیبانی می‌کند که اگرچه مهار PBP2a نقش کلیدی در فعالیت ضدباکتریایی دارد، اما تفاوت‌های مشاهده شده در فعالیت بیولوژیکی بین ترکیبات آزمایش شده را به طور کامل توضیح نمی‌دهد. این تفاوت‌ها نشان می‌دهد که برای روشن شدن کامل مکانیسم‌های ضدباکتریایی، تجزیه و تحلیل‌های تجربی بیشتر و ارزیابی‌های بیولوژیکی عمیق مورد نیاز است.
نتایج داکینگ مولکولی در جدول 4 و فایل داده‌های تکمیلی، رابطه پیچیده بین امتیازات داکینگ و فعالیت ضدمیکروبی را برجسته می‌کند. اگرچه ترکیبات 6 و 13b امتیازات داکینگ پایین‌تری نسبت به ترکیبات 7، 9، 10 و 14 دارند، اما بالاترین فعالیت ضدمیکروبی را نشان می‌دهند. نقشه‌های برهمکنش آنها (که در شکل 11 نشان داده شده است) نشان می‌دهد که علیرغم امتیازات اتصال پایین‌تر، آنها هنوز پیوندهای هیدروژنی قابل توجه و برهمکنش‌های π-stacking با باقیمانده‌های کلیدی PBP2a تشکیل می‌دهند که می‌توانند کمپلکس مهارکننده آنزیم را به روشی بیولوژیکی مفید تثبیت کنند. علیرغم امتیازات داکینگ نسبتاً پایین 6 و 13b، فعالیت ضدمیکروبی افزایش یافته آنها نشان می‌دهد که هنگام ارزیابی پتانسیل مهارکننده، باید خواص دیگری مانند حلالیت، پایداری و جذب سلولی را نیز همراه با داده‌های داکینگ در نظر گرفت. این امر اهمیت ترکیب مطالعات داکینگ با آنالیز ضدمیکروبی تجربی را برای ارزیابی دقیق پتانسیل درمانی ترکیبات جدید برجسته می‌کند.
این نتایج نشان می‌دهد که اگرچه داکینگ مولکولی ابزاری قدرتمند برای پیش‌بینی تمایل اتصال و شناسایی مکانیسم‌های بالقوه مهار است، اما نباید برای تعیین اثربخشی ضدمیکروبی تنها به آن تکیه کرد. داده‌های مولکولی نشان می‌دهند که مهار PBP2a یک عامل کلیدی مؤثر بر فعالیت ضدمیکروبی است، اما تغییرات در فعالیت بیولوژیکی نشان می‌دهد که سایر خواص فیزیکوشیمیایی و فارماکوکینتیک باید برای افزایش اثربخشی درمانی بهینه شوند. مطالعات آینده باید بر بهینه‌سازی ساختار شیمیایی ترکیبات 7 و 10 تمرکز کنند تا فراهمی زیستی و جذب سلولی را بهبود بخشند و اطمینان حاصل کنند که تعاملات قوی داکینگ به فعالیت ضدمیکروبی واقعی تبدیل می‌شوند. مطالعات بیشتر، از جمله زیست‌سنجی‌های اضافی و تجزیه و تحلیل رابطه ساختار-فعالیت (SAR)، برای درک بیشتر ما از نحوه عملکرد این ترکیبات به عنوان مهارکننده‌های PBP2a و توسعه عوامل ضدمیکروبی مؤثرتر، بسیار مهم خواهد بود.
ترکیبات سنتز شده از 3-(آنتراسن-9-ایل)-2-سیانوآکریلوئیل کلرید 4 درجات مختلفی از فعالیت ضد میکروبی را نشان دادند، و چندین ترکیب مهار قابل توجهی از استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA) نشان دادند. تجزیه و تحلیل رابطه ساختار-فعالیت (SAR) ویژگی‌های ساختاری کلیدی زیربنایی اثر ضد میکروبی این ترکیبات را آشکار کرد.
وجود هر دو گروه آکریلونیتریل و آنتراسن برای افزایش فعالیت ضدمیکروبی حیاتی بود. گروه نیتریل بسیار واکنش‌پذیر در آکریلونیتریل برای تسهیل تعامل با پروتئین‌های باکتریایی ضروری است و در نتیجه به خواص ضدمیکروبی این ترکیب کمک می‌کند. ترکیبات حاوی آکریلونیتریل و آنتراسن به طور مداوم اثرات ضدمیکروبی قوی‌تری نشان دادند. آروماتیک بودن گروه آنتراسن، این ترکیبات را بیشتر تثبیت کرد و به طور بالقوه فعالیت بیولوژیکی آنها را افزایش داد.
معرفی حلقه‌های هتروسیکلیک به طور قابل توجهی اثر ضد باکتریایی چندین مشتق را بهبود بخشید. به طور خاص، مشتق بنزوتیازول ۱۳b و مشتق آکریل هیدرازید ۶ بالاترین فعالیت ضد باکتریایی را با هاله عدم رشد تقریباً ۴ سانتی‌متر نشان دادند. این مشتقات هتروسیکلیک اثرات بیولوژیکی قابل توجهی نشان دادند که نشان می‌دهد ساختار هتروسیکلیک نقش کلیدی در اثرات ضد باکتریایی دارد. به همین ترتیب، پیریمیدینتیون در ترکیب ۹، تیوپیرازول در ترکیب ۱۰ و حلقه تترازین در ترکیب ۱۱ به خواص ضد باکتریایی ترکیبات کمک کردند و اهمیت اصلاح هتروسیکلیک را بیشتر برجسته کردند.
در میان ترکیبات سنتز شده، ترکیبات 6 و 13b به دلیل فعالیت‌های ضدباکتریایی عالی خود برجسته بودند. حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) ترکیب 6، 9.7 میکروگرم در 100 میکرولیتر و حداقل غلظت باکتری‌کشی (MBC) آن 78.125 میکروگرم در 100 میکرولیتر بود که توانایی عالی آن را در از بین بردن استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) برجسته می‌کند. به طور مشابه، ترکیب 13b دارای هاله عدم رشد 4 سانتی‌متر مربع و مقادیر MIC و MBC پایین بود که فعالیت ضدباکتریایی قوی آن را تأیید می‌کند. این نتایج نقش کلیدی گروه‌های عاملی آکریلوهیدرازید و بنزوتیازول را در تعیین اثربخشی زیستی این ترکیبات برجسته می‌کند.
در مقابل، ترکیبات ۷، ۱۰ و ۱۴ فعالیت ضدباکتریایی متوسطی با هاله‌های عدم رشد از ۳.۶۵ تا ۳.۹ سانتی‌متر مربع نشان دادند. این ترکیبات برای از بین بردن کامل باکتری‌ها به غلظت‌های بالاتری نیاز داشتند، همانطور که از مقادیر نسبتاً بالای MIC و MBC آنها مشخص است. اگرچه این ترکیبات نسبت به ترکیبات ۶ و ۱۳b فعالیت کمتری داشتند، اما همچنان پتانسیل ضدباکتریایی قابل توجهی نشان دادند، که نشان می‌دهد ترکیب بخش‌های آکریلونیتریل و آنتراسن در حلقه هتروسیکلیک به اثر ضدباکتریایی آنها کمک می‌کند.
ترکیبات، نحوه‌ی عملکرد متفاوتی دارند، برخی خواص باکتری‌کشی و برخی دیگر اثرات باکتریواستاتیک از خود نشان می‌دهند. ترکیبات ۷، ۱۱، ۱۳a و ۱۵ باکتری‌کش هستند و برای از بین بردن کامل باکتری‌ها به غلظت‌های پایین‌تری نیاز دارند. در مقابل، ترکیبات ۶، ۱۳b و ۱۴ باکتریواستاتیک هستند و می‌توانند رشد باکتری‌ها را در غلظت‌های پایین‌تر مهار کنند، اما برای از بین بردن کامل باکتری‌ها به غلظت‌های بالاتری نیاز دارند.
به طور کلی، تجزیه و تحلیل رابطه ساختار-فعالیت، اهمیت معرفی بخش‌های آکریلونیتریل و آنتراسن و ساختارهای هتروسیکلیک را برای دستیابی به فعالیت ضدباکتریایی قابل توجه برجسته می‌کند. این نتایج نشان می‌دهد که بهینه‌سازی این اجزای ساختاری و بررسی اصلاحات بیشتر برای بهبود حلالیت و نفوذپذیری غشا ممکن است منجر به توسعه داروهای ضد MRSA مؤثرتر شود.
تمام واکنشگرها و حلال‌ها با استفاده از روش‌های استاندارد (الگوموریة، مصر) خالص‌سازی و خشک شدند. نقاط ذوب با استفاده از دستگاه نقطه ذوب الکترونیکی GallenKamp تعیین و بدون اصلاح گزارش شدند. طیف‌های مادون قرمز (IR) (cm⁻1) در گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه عین شمس با استفاده از گلوله‌های پتاسیم برومید (KBr) بر روی طیف‌سنج FTIR Thermo Electron Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، ایالات متحده آمریکا) ثبت شدند.
طیف‌های 1H NMR در فرکانس 300 مگاهرتز با استفاده از طیف‌سنج GEMINI NMR (GEMINI Manufacturing & Engineering, Anaheim, CA, USA) و طیف‌سنج BRUKER NMR 300 مگاهرتز (BRUKER Manufacturing & Engineering, Inc.) به دست آمدند. تترامتیل‌سیلان (TMS) به عنوان استاندارد داخلی به همراه دی‌متیل سولفوکسید دوتره (DMSO-d₆) استفاده شد. اندازه‌گیری‌های NMR در دانشکده علوم دانشگاه قاهره، جیزه، مصر انجام شد. تجزیه عنصری (CHN) با استفاده از یک آنالیزور عنصری Perkin-Elmer 2400 انجام شد و نتایج به دست آمده با مقادیر محاسبه شده مطابقت خوبی دارند.
مخلوطی از اسید ۳ (۵ میلی‌مول) و تیونیل کلرید (۵ میلی‌لیتر) به مدت ۴ ساعت در حمام آب در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد. تیونیل کلرید اضافی با تقطیر تحت فشار کاهش‌یافته حذف شد. جامد قرمز حاصل جمع‌آوری و بدون خالص‌سازی بیشتر استفاده شد. نقطه ذوب: ۲۰۰-۲۰۲ درجه سانتی‌گراد، بازده: ۸۸.۵٪. IR (KBr، ν، cm−۱): ۲۲۲۴ (C≡N)، ۱۷۳۷ (C=O). ۱H-NMR (۴۰۰ مگاهرتز، DMSO-d۶) δ (ppm): ۹.۲۶ (s، ۱H، CH=)، ۷.۲۷-۸.۵۷ (m، ۹H، هتروآروماتیک‌سازی). 13C NMR (75 مگاهرتز، DMSO-d6) δ (ppm): 115.11 (C≡N)، 124.82–130.53 (CH3 آنتراسن)، 155.34، 114.93 (CH3=C–C=O)، 162.22 (C=O)؛ HRMS (ESI) m/z [M + H]+: 291.73111. آنالایزر. محاسبه شده برای C18H10ClNO (291.73): C، 74.11؛ H، 3.46؛ N، 4.80. یافت شده: C، 74.41؛ H، 3.34؛ N، 4.66%.
در دمای ۰ درجه سانتیگراد، ۴ (۲ میلی‌مول، ۰.۷ گرم) در دی‌اکسان بی‌آب (۲۰ میلی‌لیتر) حل شد و هیدرازین هیدرات (۲ میلی‌مول، ۰.۱۶ میلی‌لیتر، ۸۰٪) قطره قطره اضافه و به مدت ۱ ساعت هم زده شد. جامد رسوب شده با فیلتراسیون جمع‌آوری و از اتانول تبلور مجدد یافت تا ترکیب ۶ حاصل شود.
بلورهای سبز، نقطه ذوب ۱۹۰-۱۹۲ درجه سانتیگراد، بازده ۶۹.۳۶٪؛ IR (KBr) ν=۳۴۲۴ (NH)، ۲۲۲۸ (C≡N)، ۱۷۲۰ (C=O)، ۱۶۲۱ (C=N) cm−۱. ۱H-NMR (۴۰۰ مگاهرتز، DMSO-d۶) δ (ppm): ۹.۳ (br s، H، NH، تبادلی)، ۷.۶۹-۸.۵۱ (m، ۱۸H، هتروآروماتیک)، ۹.۱۶ (s، ۱H، CH=)، ۸.۵۴ (s، ۱H، CH=)؛ مقدار محاسبه شده برای C33H21N3O (۴۷۵.۵۳): C، ۸۳.۳۵؛ H، ۴.۴۵؛ N، ۸.۸۴. یافت شده: C، ۸۴.۰۱؛ H، ۴.۳۸؛ ن، ۸.۰۵٪.
۴ (۲ میلی‌مول، ۰.۷ گرم) را در ۲۰ میلی‌لیتر محلول دی‌اکسان بی‌آب (حاوی چند قطره تری‌اتیل‌آمین) حل کنید، فنیل‌هیدرازین/۲-آمینوپیریدین (۲ میلی‌مول) اضافه کنید و به ترتیب به مدت ۱ و ۲ ساعت در دمای اتاق هم بزنید. مخلوط واکنش را در یخ یا آب بریزید و با اسید هیدروکلریک رقیق اسیدی کنید. جامد جدا شده را فیلتر کنید و از اتانول تبلور مجدد کنید تا ۷ به دست آید و از بنزن تبلور مجدد کنید تا ۸ به دست آید.
بلورهای سبز، نقطه ذوب ۱۶۰-۱۶۲ درجه سانتیگراد، بازده ۷۷٪؛ IR (KBr، ν، cm−۱): ۳۲۴۵ (NH)، ۲۲۲۲ (C≡N)، ۱۶۹۱ (C=O)، ۱۶۷۱ (C=O) cm−۱. ۱H-NMR (۴۰۰ مگاهرتز، DMSO-d۶): δ (ppm): ۱۰.۸۸ (s، ۱H، NH، تبادلی)، ۹.۱۵ (s، ۱H، CH=)، ۸.۸۱ (s، ۱H، CH=)، ۶.۷۸-۸.۵۸ (m، ۲۳H، هتروآروماتیک)؛ مقدار محاسبه شده برای C42H26N4O2 (۶۱۸.۶۸): C، ۸۱.۵۴؛ H، ۴.۲۴؛ N، ۹.۰۶. یافت شده: C، ۸۱.۹۶؛ اچ، ۳.۹۱؛ ان، ۸.۹۱٪.
۴ (۲ میلی‌مول، ۰.۷ گرم) در ۲۰ میلی‌لیتر محلول دی‌اکسان بی‌آب (حاوی چند قطره تری‌اتیل‌آمین) حل شد، ۲-آمینوپیریدین (۲ میلی‌مول، ۰.۲۵ گرم) اضافه شد و مخلوط به مدت ۲ ساعت در دمای اتاق هم زده شد. مخلوط واکنش در آب یخ ریخته شد و با اسید هیدروکلریک رقیق اسیدی شد. رسوب تشکیل شده فیلتر و از بنزن دوباره متبلور شد و کریستال‌های سبز ۸ با نقطه ذوب ۱۴۶-۱۴۸ درجه سانتیگراد و بازده ۸۲.۵٪ به دست آمد. طیف مادون قرمز (KBr) ν: ۳۱۴۸ (NH)، ۲۲۲۲ (C≡N)، ۱۶۶۵ (C=O) cm−۱. 1H NMR (400 مگاهرتز، DMSO-d6): δ (ppm): 8.78 (s، H، NH، تبادلی)، 9.14 (s، 1H، CH=)، 7.36-8.55 (m، 13H، هتروآروماتیکیزاسیون)؛ محاسبه شده برای C23H15N3O (348.38): C، 79.07؛ H، 4.33؛ N، 12.03. یافت شده: C، 78.93؛ H، 3.97؛ N، 12.36%.
ترکیب ۴ (۲ میلی‌مول، ۰.۷ گرم) در ۲۰ میلی‌لیتر دی‌اکسان خشک (حاوی چند قطره تری‌اتیل‌آمین و ۲ میلی‌مول تیواوره/سمی‌کاربازید) حل شد و به مدت ۲ ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. حلال در خلاء تبخیر شد. باقیمانده از دی‌اکسان دوباره متبلور شد تا مخلوطی حاصل شود.