مرتب‌سازی پروتئین در مسیر ترشحی برای حفظ بخش‌بندی سلولی و هموستاز ضروری است. علاوه بر مرتب‌سازی با واسطه پوسته، نقش لیپیدها در مرتب‌سازی کینزین در فرآیند انتقال ترشحی یک سوال اساسی دیرینه است که هنوز به آن پاسخ داده نشده است. در اینجا، ما تصویربرداری سه‌بعدی همزمان چند رنگی با وضوح بالا را در زمان واقعی انجام می‌دهیم تا در داخل بدن ثابت کنیم که پروتئین‌های تثبیت‌شده با گلیکوزیل فسفاتیدیل اینوزیتول تازه سنتز شده با بخش‌های لیپیدی سرامید بسیار طولانی، در محل خروج خالص اندوپلاسم‌های تخصصی خوشه‌بندی و طبقه‌بندی می‌شوند، که با محل خروج خالص پروتئین‌های غشایی متفاوت است. علاوه بر این، ما نشان می‌دهیم که طول زنجیره سرامید در غشای شبکه آندوپلاسمی برای این انتخاب‌پذیری مرتب‌سازی حیاتی است. مطالعه ما اولین شواهد مستقیم در داخل بدن را برای طبقه‌بندی محموله‌های پروتئینی بر اساس طول زنجیره لیپید به محل‌های خروج انتخابی در مسیر ترشحی ارائه می‌دهد.
در سلول‌های یوکاریوتی، پروتئین‌های سنتز شده در شبکه آندوپلاسمی (ER) سپس در طول انتقال از طریق مسیر ترشحی برای رساندن به مقصد سلولی مناسب خود مرتب می‌شوند (1). علاوه بر مرتب‌سازی با واسطه پوشش، مدت‌ها گمان می‌رفت که لیپیدهای خاص می‌توانند با خوشه‌بندی آنها در دامنه‌های غشایی خاص که پروتئین‌های خاص را مشخص می‌کنند، به عنوان نقاط خروج انتخابی نیز عمل کنند (2-5). با این حال، هنوز شواهد مستقیمی در داخل بدن برای اثبات این مکانیسم احتمالی مبتنی بر لیپید وجود ندارد. به منظور حل این مشکل اساسی، ما در مخمر بررسی کردیم که چگونه پروتئین‌های متصل به گلیکوزیل فسفاتیدیل اینوزیتول (GPI-APs) به طور متفاوتی از ER خارج می‌شوند. GPI-APs انواع پروتئین‌های سطح سلولی متصل به لیپید هستند (6، 7). GPI-AP یک پروتئین ترشحی است که از طریق بخش گلیکولیپیدی (لنگر GPI) به لایه‌های بیرونی غشای پلاسما متصل می‌شود. آنها لنگرهای GPI را به عنوان تغییرات پس از ترجمه محافظه‌کارانه در لومن ER می‌پذیرند (8). پس از اتصال، GPI-AP از طریق دستگاه گلژی (5، 9) از ER به غشای پلاسمایی منتقل می‌شود. وجود لنگرهای GPI باعث می‌شود GPI-AP به طور جداگانه از پروتئین‌های ترشح شده از غشای غشایی (از جمله سایر پروتئین‌های غشای پلاسما) در امتداد مسیر ترشحی منتقل شود (5، 9، 10). در سلول‌های مخمر، GPI-APها از سایر پروتئین‌های ترشح شده در شبکه آندوپلاسمی جدا می‌شوند و سپس در وزیکول‌های منحصر به فردی که توسط کمپلکس پروتئین پوششی II (COPII) پیچیده شده‌اند، بسته‌بندی می‌شوند (6، 7). عوامل تعیین‌کننده این فرآیند طبقه‌بندی در فرآیند صادرات ER نامشخص است، اما گمان می‌رود که این مکانیسم ممکن است به لیپیدها، به ویژه بازسازی ساختاری بخش لیپیدی لنگر GPI نیاز داشته باشد (5، 8). در مخمر، بازسازی لیپید GPI بلافاصله پس از اتصال GPI آغاز می‌شود و در بسیاری از موارد، باعث اتصال سرامید به اسید چرب اشباع شده با زنجیره بلند 26 کربنی (C26:0) می‌شود (11، 12). سرامید C26 سرامید اصلی تولید شده توسط سلول‌های مخمر تاکنون است. این سرامید در ER سنتز می‌شود و بیشتر آن از طریق وزیکول‌های COPII به دستگاه گلژی صادر می‌شود (13). خروج GPI-AP از ER به طور خاص نیاز به سنتز مداوم سرامید دارد (14، 15) و به نوبه خود، تبدیل سرامید به سرامید فسفات اینوزیتول (IPC) در دستگاه گلژی به سنتز لنگر GPI بستگی دارد (16). مطالعات بیوفیزیکی با غشاهای مصنوعی نشان داده است که سرامیدهای زنجیره آسیل بسیار طولانی می‌توانند با هم ادغام شوند و دامنه‌های منظمی با خواص فیزیکی منحصر به فرد تشکیل دهند (17، 18). این داده‌ها منجر به این فرضیه می‌شود که سرامید C26 و GPI-AP با سرامید C26 از خواص فیزیکی خود برای ادغام در مناطق یا نواحی منظم در محیط لیپیدی نسبتاً آشفته غشای ER استفاده می‌کنند. این ماده عمدتاً از گلیسرولیپیدهای کوتاه و غیراشباع (C16:1 و C18:1) تشکیل شده است (19، 20). این مناطق به صورت انتخابی بر روی محل‌های خروج خاص ER (ERES) متمرکز خواهند شد، جایی که سرامید و GPI-AP مبتنی بر سرامید می‌توانند به طور همزمان در همان وزیکول اختصاصی COPII به گلژی منتقل شوند (5).
در این مطالعه، ما مستقیماً این مکانیسم مبتنی بر لیپید را با استفاده از میکروسکوپ تصویربرداری کانفوکال با وضوح فوق‌العاده بالا (SCLIM) آزمایش کرده‌ایم، که یک تکنیک میکروسکوپی پیشرفته است که می‌تواند همزمان پروتئین‌های برچسب‌گذاری شده با فلورسانس را مشاهده کند. تصاویر سه رنگی و سه‌بعدی (3D) وضوح و سرعت بسیار بالایی در سلول‌های زنده دارند (21، 22).
ما ابتدا از فناوری SCLIM برای تعریف بیشتر چگونگی غربالگری GPI-AP طبیعی با گروه سرامید C26 از پروتئین‌های ترشح‌شده از غشای پس از خروج از ER در S. cerevisiae استفاده کردیم. به منظور بررسی طبقه‌بندی ER، از یک سیستم ژنتیکی استفاده کردیم که می‌تواند مستقیماً محموله تازه سنتز شده را که وارد ERES در داخل بدن می‌شود، تجسم کند (7، 23). به عنوان محموله، ما GPI-AP Gas1 مبتنی بر سرامید C26 که با پروتئین فلورسنت سبز (GFP) نشاندار شده است و پروتئین ترشح‌شده از غشای Mid2 که با پروتئین فلورسنت مادون قرمز نزدیک (iRFP) نشاندار شده است را انتخاب کردیم که هر دو غشای پلاسما را هدف قرار می‌دهند (24-26). در جهش‌یافته حساس به دما sec31-1، این دو محموله تحت یک پروموتر القا شده توسط گالاکتوز و یک نشانگر ERES ساختاری بیان می‌شوند. در دمای بسیار بالا (37 درجه سانتیگراد)، از آنجا که جهش sec31-1 بر عملکرد جزء پوششی COPII، Sec31، برای مهار جوانه‌زنی COPII و خروج ER تأثیر می‌گذارد، محموله‌های تازه سنتز شده در ER تجمع می‌یابند (23). پس از سرد شدن تا دمای پایین (24 درجه سانتیگراد)، سلول‌های جهش‌یافته sec31-1 از ناحیه ترشحی بازیابی شدند و محموله مصنوعی جدید انباشته شده شروع به خروج از ER کرد. تجسم CLIM نشان داد که بیشتر Gas1-GFP و Mid2-iRFP تازه سنتز شده پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد و سپس آزاد شدن در دمای 24 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، هنوز در ER سلول‌های جهش‌یافته sec31-1 تجمع یافته‌اند (شکل 1). از آنجایی که Mid2-iRFP در کل غشای ER توزیع شده است و Gas1-GFP در ناحیه غشای ER ناپیوسته متمرکز و جمع شده است، توزیع آنها کاملاً متفاوت است (شکل 1، A تا C و فیلم S1). علاوه بر این، همانطور که در شکل 1D نشان داده شده است، خوشه Gas1-GFP فاقد Mid2-iRFP است. این نتایج نشان می‌دهد که GPI-AP و پروتئین‌های غشایی در مراحل اولیه به نواحی مختلف غشای ER تفکیک شده‌اند. خوشه Gas1-GFP در مجاورت یک ERES خاص است که با پروتئین پوششی COPII Sec13 از mCherry برچسب‌گذاری شده است (شکل 1، E و F، و فیلم S1) (23).
سلول‌های sec31-1 ترشحات القا شده توسط گالاکتوز، یک زنجیره آسیل بلند (C26) سرامید GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP، سبز) و پروتئین غشایی Mid2-iRFP (TMP، آبی) را بیان می‌کنند و این برچسب‌گذاری ساختاری ERES Sec13-mCherry (ERES، سرخابی) به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد، به دمای 24 درجه سانتیگراد منتقل شد و 5 دقیقه بعد توسط SCLIM تصویربرداری شد. (A تا C) یک تصویر دو بعدی ادغام شده یا تکی از یک صفحه (A)، یک تصویر دو بعدی از 10 برش z (B) یا یک تصویر نیمکره سلولی سه بعدی از محموله و نشانگرهای ERES (C) را نشان می‌دهد. نوار مقیاس 1μm (A و B). واحد مقیاس 0.551μm (C) است. Gas1-GFP در نواحی یا خوشه‌های گسسته ER شناسایی شد، در حالی که Mid2-iRFP شناسایی و در سراسر غشای ER توزیع شد (C). (D) نمودار شدت فلورسانس نسبی Gas1-GFP و Mid2-iRFP را در خوشه Gas1-GFP در امتداد خط فلش ​​سفید (چپ) نشان می‌دهد. AU، واحد دلخواه. (E و F) نشان دهنده تصویر سه بعدی است که کالا و علامت ERES را ترکیب می‌کند. خوشه‌های Gas1-GFP در نزدیکی ERES خاص شناسایی شدند. واحد مقیاس 0.551μm است. (F) فلش سفید توپر خوشه Gas1-GFP مرتبط با ERES را نشان می‌دهد. پنل‌های میانی و راست تصویر سه بعدی بزرگ شده ادغام شده و نمای چرخیده خوشه Gas1-GFP انتخاب شده را نشان می‌دهند.
رابطه مکانی نزدیک بین خوشه Gas1-GFP و یک ERES خاص نشان می‌دهد که Gas1-GFP می‌تواند وارد ERES انتخابی شود، که با گزینش‌پذیری مورد استفاده Mid2-iRFP برای خروج از ER متفاوت است. برای بررسی این احتمال، نسبت ERES را فقط برای یک یا دو کالا کمّی کردیم (شکل 2، A تا C). دریافتیم که بیشتر ERESها (70٪) فقط حاوی یک نوع محموله هستند. تصویر پایین شکل 2C دو نمونه معمول از ERES را با فقط Gas1-GFP (شکل 1) یا فقط Mid2-iRFP (شکل 2) نشان می‌دهد. در مقابل، تقریباً 20٪ از ERESها حاوی دو محموله هستند که در یک منطقه همپوشانی دارند. مشخص شد که برخی از ERESها (10٪) حاوی دو نوع محموله هستند، اما در مناطق کاملاً متفاوتی جدا شده‌اند. بنابراین، این تجزیه و تحلیل آماری نشان می‌دهد که پس از صادرات ER، GPI-AP Gas1-GFP و محموله غشایی Mid2-iRFP به ERESهای مختلفی تقسیم می‌شوند (شکل 2D). این راندمان مرتب‌سازی با آنالیز بیوشیمیایی قبلی (6) و تعیین مورفولوژیکی (7) بسیار سازگار است. ما همچنین می‌توانیم رفتار محموله قرنطینه‌شده‌ای را که وارد ERES می‌شود مشاهده کنیم (شکل 2E و فیلم S2). شکل 2E نشان می‌دهد که تنها بخش کوچکی از Gas1-GFP (پانل 3) یا Mid2-iRFP (پانل 4) از یک طرف وارد ERES می‌شود و در یک ناحیه گسسته محصور می‌شود. پنل 5 از شکل 2E نشان می‌دهد که Gas1-GFP و Mid2-iRFP گاهی اوقات در همان ERES یافت می‌شوند، اما از طرف‌های مختلف وارد می‌شوند و در مناطق جداگانه‌ای متمرکز می‌شوند که ممکن است نشان دهنده وزیکول‌های COPII مختلف باشند. ما همچنین تأیید کردیم که جداسازی و طبقه‌بندی مشاهده شده GPI-AP Gas1 مبتنی بر سرامید C26 به عنوان ERES انتخابی، اختصاصی است زیرا یک محموله ترشح غشایی دیگر، پروتئین غشای پلاسمایی Axl2 با برچسب GFP (27)، رفتار مشابهی با Mid2-iRFP نشان می‌دهد. (تصویر S1 و فیلم S3). Axl2-GFP تازه سنتز شده مانند Mid2-iRFP از طریق غشای ER توزیع می‌شود (شکل‌های S1، A و B) و در بیشتر ERESها با Mid2-iRFP هم‌محلی است (شکل‌های S1، B تا D). پنل‌های 1 و 2 شکل 1. S1C دو نمونه معمول از ERES را نشان می‌دهد که در آن‌ها دو محموله غشایی با هم همپوشانی دارند. در این موارد، هر دو کالا با هم وارد ERES می‌شوند (شکل S1E، پنل 3 و فیلم S3).
سلول‌های sec31-1 که ترشحات القا شده با گالاکتوز را بیان می‌کنند، Gas1-GFP (GPI-AP، سبز) و Mid2-iRFP (TMP، آبی) و برچسب‌گذاری ساختاری ERES با Sec13-mCherry (ERES، سرخابی) در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای 24 درجه سانتیگراد، برای آزاد شدن بلوک ترشح به دمای 24 درجه سانتیگراد منتقل شدند و پس از 20 دقیقه با SCLIM تصویربرداری شدند. (A تا C) تصاویر طرح‌ریزی دوبعدی نماینده (A؛ نوار مقیاس، 1 میکرومتر) یا تصاویر نیمکره سلولی سه‌بعدی (B و C؛ واحد مقیاس، 0.456 میکرومتر) از محموله و 10 برش z مشخص شده توسط ERES. پنل پایینی در (B) و پنل در (C) تصاویر پردازش شده را نمایش می‌دهند تا فقط کالاهای موجود در ERES (سرخابی) [Gas1-GFP (خاکستری) و Mid2-iRFP (آبی روشن)] را نمایش دهند. (ج) فلش باز: ERES فقط یک قطعه محموله (1 تا 4) را حمل می‌کند. فلش خاکستری: ERES حاوی محموله تفکیک‌شده (5) است. فلش سفید توپر: ERES حاوی محموله‌های هم‌محل. در زیر: ERES تکی انتخاب‌شده فقط شامل Gas1-GFP (1) یا Mid2-iRFP (2) است. نوار مقیاس، 100 نانومتر. (د) کمی‌سازی فوتومیکروگراف شرح داده شده در (ج). میانگین درصد ERES که فقط شامل یک محموله (Gas1-GFP یا Mid2-iRFP)، محموله تفکیک‌شده و محموله همپوشانی است. در سه آزمایش مستقل، n=432 در 54 سلول. نوار خطا = SD. آزمون t جفت‌نشده دوطرفه. *** P = 0.0002. (ه) تصویر سه‌بعدی ERES انتخاب‌شده از محموله قرنطینه‌شده مشخص‌شده با (ج). Gas1-GFP (سبز) (3) یا Mid2-iRFP (آبی) (4) از یک طرف وارد ERES (سرخابی) می‌شود و به ناحیه کوچکی در داخل ERES محدود می‌شود. گاهی اوقات، هر دو نوع محموله از یک طرف وارد یک ERES (5) می‌شوند و در یک ناحیه ایزوله در ERES محدود می‌شوند. مقیاس، 100 نانومتر.
در مرحله بعد، ما این فرضیه را آزمایش کردیم که سرامید با زنجیره آسیل بلند (C26) موجود در غشای ER، خوشه‌بندی و دسته‌بندی خاص Gas1 را به ERES انتخابی هدایت می‌کند. برای این منظور، ما از یک سویه مخمر اصلاح‌شده GhLag1 استفاده کردیم که در آن دو سنتاز سرامید درون‌زا Lag1 و Lac1 با GhLag1 (همولوگ Lag1 پنبه) جایگزین شدند و در نتیجه یک سویه مخمر با غشای سلولی سویه سرامید کوتاه‌تر از نوع وحشی ایجاد شد (شکل 3A) (28). تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی (MS) نشان داد که در سویه‌های نوع وحشی، 95٪ از کل سرامید، سرامید با زنجیره بسیار بلند (C26) است، در حالی که در GhLag1، 85٪ از سرامید بسیار بلند (C18 و C16) است. تنها 2٪ از سرامید، سرامید با زنجیره بسیار بلند (C26) است. اگرچه سرامیدهای C18 و C16 سرامیدهای اصلی شناسایی شده در غشای GhLag1 تاکنون هستند، تجزیه و تحلیل MS همچنین تأیید کرد که لنگر GPI مربوط به Gas1-GFP بیان شده در سویه GhLag1 حاوی سرامید C26 است که با لیپیدهای نوع وحشی قابل مقایسه است. کیفیت یکسان است (شکل 3A) (26). بنابراین، این بدان معناست که آنزیم بازسازی کننده سرامید Cwh43 برای سرامید C26 بسیار انتخابی است، همانطور که در شکل 26 نشان داده شده است، ترجیحاً لنگر GPI را از مقدار کمی سرامید C26 در سویه GhLag1 ترکیب می‌کند. S2 (29). با این وجود، غشای سلولی GhLag1 اساساً فقط حاوی سرامید C18-C16 است، در حالی که Gas1-GFP هنوز سرامید C26 دارد. این واقعیت، این سویه را به ابزاری ایده‌آل برای حل خاص مشکل طول زنجیره آسیل سرامید غشایی در ER تبدیل می‌کند. نقش فرضی کلاس و مرتب‌سازی. سپس، ما ابتدا توانایی C26 Gas1-GFP را برای تجمع در خوشه‌ها در GhLag1 با آلل جهش‌یافته حساس به دما از sec31-1 از طریق میکروسکوپ فلورسانس معمولی بررسی کردیم، که در آن فقط زنجیره بلند (C18-C16) در سرامید غشای ER وجود دارد (شکل 3). ما مشاهده کردیم که در sec31-1، بیشتر Gas1-GFP در خوشه‌ها متمرکز شده است، در حالی که Gas1-GFP در sec31-1 GhLag1 با سرامید غشای ER بلند (C18-C16) عمدتاً خوشه‌ای نبوده و در کل غشای ER توزیع شده است. به طور دقیق، از آنجا که خوشه‌بندی مبتنی بر سرامید C26 ارتباط نزدیکی با ERES خاص دارد (شکل 1)، در مرحله بعد بررسی کردیم که آیا این فرآیند ممکن است شامل عملکرد مکانیسم پروتئین صادرات ER نیز باشد یا خیر. GPI-AP از یک سیستم COPII ویژه برای خروج ER استفاده می‌کند که به طور فعال توسط بازسازی ساختاری Ted1 در بخش گلیکان لنگر GPI تنظیم می‌شود (30، 31). سپس GPI-گلیکان نوترکیب توسط کمپلکس گیرنده محموله غشایی p24 شناسایی می‌شود که به نوبه خود به طور انتخابی Lst1 را جذب می‌کند، که یک ایزوفرم خاص از زیر واحد اصلی اتصال محموله COPII یعنی Sec24 است و تشکیل یک وزیکول COPII غنی از GPI-AP ضروری است (31-33). بنابراین، ما یک جهش دوگانه ساختیم که حذف این پروتئین‌های منفرد (جزء کمپلکس p24 یعنی Emp24، آنزیم بازسازی‌کننده GPI-گلیکان Ted1 و زیر واحد خاص COPII یعنی Lst1) را با سویه جهش‌یافته sec31-1 ترکیب کرد و آنها را مورد مطالعه قرار داد. آیا تشکیل GFP خوشه‌ای Gas1 امکان‌پذیر است (شکل 3). ما مشاهده کردیم که در sec31-1emp24Δ و sec31-1ted1Δ، Gas1-GFP عمدتاً خوشه‌ای نیست و در سراسر غشای ER توزیع شده است، همانطور که قبلاً در sec31-1 GhLag1 دیده شده بود، در حالی که در sec31-1lst1Δ، Gas1-GFP مانند sec31-1 است. این نتایج نشان می‌دهد که علاوه بر وجود سرامید C26 در غشای ER، خوشه‌بندی Gas1-GFP نیز نیاز به اتصال به کمپلکس p24 دارد و نیازی به جذب خاص Lst1 ندارد. سپس، ما این احتمال را بررسی کردیم که طول زنجیره سرامید در غشای ER می‌تواند اتصال Gas1-GFP به p24 را تنظیم کند. با این حال، ما دریافتیم که وجود سرامید C18-C16 در غشا، بر توانایی GPI-گلیکان‌های بازسازی شده توسط کمپلکس p24 (شکل‌های S3 و S4، A و B) یا اتصال به GPI-AP و صدور GPI-AP تأثیری ندارد. زیرگروه COPII Lst1 را فراخوانی کنید (شکل S4C). بنابراین، خوشه‌بندی وابسته به سرامید C26 نیازی به تعامل پروتئین با مکانیسم‌های مختلف پروتئین خروجی ER ندارد، اما از یک مکانیسم مرتب‌سازی جایگزین که توسط طول لیپید هدایت می‌شود، پشتیبانی می‌کند. سپس، ما بررسی کردیم که آیا طول زنجیره آسیل سرامید در غشای ER برای طبقه‌بندی مؤثر Gas1-GFP به عنوان ERES انتخابی مهم است یا خیر. از آنجایی که Gas1 در سویه GhLag1 با سرامید زنجیره کوتاه، ER را ترک کرده و وارد غشای پلاسمایی می‌شود (شکل S5)، ما معتقدیم که اگر مرتب‌سازی توسط طول زنجیره آسیل سرامید هدایت شود، Gas1 در سویه GhLag1 می‌تواند تغییر مسیر داده و عبور کند. کالاهای ERES با همان غشاء.
(الف) غشای سلولی GhLag1 عمدتاً حاوی سرامیدهای C18-C16 کوتاه‌تر است، در حالی که لنگر GPI مربوط به Gas1-GFP هنوز همان IPC C26 سلول‌های وحشی را دارد. بالا: آنالیز طول زنجیره آسیل سرامید در غشای سلولی سویه‌های وحشی (Wt) و GhLag1p توسط طیف‌سنجی جرمی (MS). داده‌ها نشان دهنده درصد کل سرامید هستند. میانگین سه آزمایش مستقل. نوار خطا = SD. آزمون t دو طرفه غیر جفت شده. **** P <0.0001. پنل پایین: آنالیز MS از طول زنجیره آسیل IPC موجود در لنگر GPI مربوط به Gas1-GFP (GPI-IPC) بیان شده در سویه‌های وحشی و GhLag1p. داده‌ها نشان دهنده درصد کل سیگنال IPC هستند. میانگین پنج آزمایش مستقل. نوار خطا = SD. آزمون t دو طرفه غیر جفت شده. ns، مهم نیست. P = 0.9134. (ب) تصاویر میکروسکوپی فلورسانس از سلول‌های sec31-1، sec31-1 GhLag1، sec31-1emp24Δ، sec31-1ted1Δ و sec31-1lst1Δ که Gas1-GFP القا شده توسط گالاکتوز را بیان می‌کنند، به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و پس از 24 درجه سانتیگراد برای انجام میکروسکوپ فلورسانس روتین منتقل شدند. فلش سفید: خوشه Gas1-GFP ER. فلش باز: Gas1-GFP خوشه‌بندی نشده در کل غشای ER توزیع شده است که رنگ‌آمیزی حلقه هسته‌ای مشخصه ER را نشان می‌دهد. نوار مقیاس، 5 میکرومتر. (ج) کمی‌سازی فتومیکروگراف شرح داده شده در (ب). میانگین درصد سلول‌های دارای ساختار Gas1-GFP نقطه‌ای. در سه آزمایش مستقل، n≥300 سلول. نوار خطا = SD. آزمون t دو طرفه غیر جفت شده. **** P <0.0001.
برای حل مستقیم این مشکل، ما تجسم SCLIM از Gas1-GFP و Mid2-iRFP را در GhLag1 با آلل جهش‌یافته حساس به دما sec31-1 انجام دادیم (شکل 4 و فیلم S4). پس از اینکه ER در دمای 37 درجه سانتیگراد حفظ و متعاقباً در دمای 24 درجه سانتیگراد آزاد شد، بیشتر Gas1-GFP تازه سنتز شده، همانطور که توسط میکروسکوپ‌های معمولی مشاهده شد (شکل 4، A و B)، در سراسر غشای ER خوشه‌بندی و توزیع نشد. علاوه بر این، درصد زیادی از ERES (67٪) شامل دو نوع محموله است که در آن قرار دارند (شکل 4D). پنل‌های 1 و 2 از شکل 4C دو نمونه معمول از ERES با همپوشانی Gas1-GFP و Mid2-GFP را نشان می‌دهند. علاوه بر این، هر دو کالا در یک ERES مشابه جذب شدند (شکل 4E، پنل 3 و فیلم S4). بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که طول زنجیره آسیل سرامید در غشای ER عامل تعیین‌کننده مهمی در تجمع و طبقه‌بندی پروتئین ER است.
سلول‌های Sec31-1 GhLag1 که ترشحات القا شده توسط گالاکتوز را بیان می‌کنند، Gas1-GFP (GPI-AP، سبز) و Mid2-iRFP (TMP، آبی) و Sec13-mCherry نشاندار شده با ERES ساختاری (ERES، سرخابی). در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. به مدت 30 دقیقه ادامه دهید، برای آزاد شدن ترشحات به 24 درجه سانتیگراد کاهش دهید و پس از 20 دقیقه با SCLIM تصویربرداری کنید. (A تا C) تصاویر طرح ریزی دو بعدی نماینده (A؛ نوار مقیاس، 1 میکرومتر) یا تصاویر نیمکره سلولی سه بعدی (B و C؛ واحد مقیاس، 0.45 میکرومتر) از 10 بخش z که توسط cargo و ERES مشخص شده‌اند. پنل پایینی در (B) و پنل در (C) تصاویر پردازش شده را نمایش می‌دهند تا فقط کالاهای موجود در ERES (سرخابی) [Gas1-GFP (خاکستری) و Mid2-iRFP (آبی روشن)] را نمایش دهند. (C) فلش پر شده با سفید: ERES، کالاها همپوشانی دارند. فلش باز: ERES فقط شامل یک مورد است. پنل پایین: ERES انتخاب شده دارای کالاهای همپوشانی (1 و 2) است که در (C) مشخص شده است. نوار مقیاس، 100 نانومتر. (D) کمی سازی فوتومیکروگراف شرح داده شده در (C). در واحدهای sec31-1 و sec31-1 GhLag1، فقط یک محموله (Gas1-GFP یا Mid2-iRFP) گنجانده شده است، و درصد متوسط ​​ERES برای محموله ایزوله و محموله همپوشانی. در سه آزمایش مستقل، n = 432 در 54 سلول (sec31-1) و n = 430 در 47 سلول (sec31-1 GhLag1). نوار خطا = SD. آزمون t جفت نشده دو طرفه. *** P = 0.0002 (sec31-1) و ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) تصویر سه بعدی ERES انتخاب شده با محموله همپوشانی (3) که در (C) مشخص شده است. Gas1-GFP (سبز) و Mid2-iRFP (آبی) از یک طرف به ERES (سرخابی) نزدیک می‌شوند و در همان ناحیه محدود شده ERES باقی می‌مانند. نوار مقیاس، ۱۰۰ نانومتر.
این مطالعه شواهد مستقیمی را در داخل بدن ارائه می‌دهد که محموله‌های پروتئینی مبتنی بر لیپید در مسیر ترشحی به مکان‌های خروجی انتخابی طبقه‌بندی می‌شوند و اهمیت طول زنجیره آسیل را برای گزینش‌پذیری طبقه‌بندی آشکار می‌کند. با استفاده از یک تکنیک میکروسکوپی قدرتمند و پیشرفته به نام SCLIM، ما Gas1-GFP تازه سنتز شده (یک GPI-AP اصلی غشای پلاسما با یک بخش لیپیدی سرامید زنجیره آسیل بسیار طولانی (C26)) را در مخمر نشان دادیم. مناطقی که در ERهای گسسته خوشه‌بندی شده‌اند با ERES خاص مرتبط هستند، در حالی که پروتئین‌های ترشح شده از طریق غشا در سراسر غشای ER توزیع شده‌اند (شکل 1). علاوه بر این، این دو نوع کالا به صورت انتخابی وارد ERES های مختلف می‌شوند (شکل 2). طول زنجیره آسیل سرامید سلولی در غشا از C26 به C18-C16 کاهش می‌یابد، خوشه Gas1-GFP به ناحیه گسسته ER منتقل می‌شود و Gas1-GFP برای خروج از ER با پروتئین غشایی از طریق همان ERES تغییر مسیر می‌دهد (شکل 3 و شکل 3). 4).
اگرچه GPI-AP از یک مکانیسم پروتئینی تخصصی برای خروج از ER استفاده می‌کند، اما ما دریافتیم که جداسازی وابسته به سرامید C26 به تعاملات پروتئینی افتراقی که ممکن است منجر به تخصصی شدن ERES شود، متکی نیست (شکل‌های S4 و S5). در عوض، یافته‌های ما از یک مکانیسم طبقه‌بندی جایگزین که توسط خوشه‌بندی پروتئین مبتنی بر لیپید و حذف متعاقب سایر محموله‌ها هدایت می‌شود، پشتیبانی می‌کند. مشاهدات ما نشان می‌دهد که ناحیه یا خوشه Gas1-GFP مرتبط با یک ERES خاص، فاقد پروتئین ترشح‌شده غشایی Mid2-iRFP است، که نشان می‌دهد خوشه GPI-AP وابسته به سرامید C26 ورود آنها را به ERES مربوطه تسهیل می‌کند و در عین حال، ترشحات غشایی را از ورود به این ERES خاص محروم می‌کند (شکل‌های 1 و 2). در مقابل، وجود سرامیدهای C18-C16 در غشای ER باعث نمی‌شود GPI-AP مناطق یا خوشه‌هایی را تشکیل دهد، بنابراین آنها پروتئین‌های ترشح‌شده غشایی را در همان ERES حذف یا جایگزین نمی‌کنند (شکل‌های 3 و 4). بنابراین، ما پیشنهاد می‌کنیم که سرامید C26 با تسهیل خوشه‌بندی پروتئین‌های مرتبط با ERES خاص، جداسازی و طبقه‌بندی را هدایت می‌کند.
چگونه می‌توان به این خوشه‌بندی وابسته به سرامید C26 در یک ناحیه خاص ER دست یافت؟ تمایل سرامید غشایی به جداسازی جانبی ممکن است باعث شود GPI-AP و سرامید C26 لیپیدهای کوچک و بلافاصله منظم را در محیط لیپیدی نامنظم‌تر غشای ER حاوی گلیسرولیپیدهای کوتاه‌تر و غیراشباع تشکیل دهند. خوشه‌های باکیفیت (17، 18). این خوشه‌های موقت کوچک می‌توانند پس از اتصال به کمپلکس p24، بیشتر به خوشه‌های بزرگتر و پایدارتر تبدیل شوند (34). مطابق با این، ما نشان دادیم که C26 Gas1-GFP برای تشکیل خوشه‌های قابل مشاهده بزرگتر، نیاز به تعامل با کمپلکس p24 دارد (شکل 3). کمپلکس p24 یک الیگومر هتروزیگوت متشکل از چهار پروتئین غشایی p24 مختلف در مخمر است (35)، که اتصال چند ظرفیتی را فراهم می‌کند، که می‌تواند منجر به اتصال متقاطع خوشه‌های کوچک GPI-AP شود و در نتیجه خوشه پایدار بزرگتری ایجاد کند (34). برهمکنش بین اکتودومین‌های پروتئینی GPI-APها نیز ممکن است در تجمع آنها نقش داشته باشد، همانطور که در طول انتقال گلژی آنها در سلول‌های اپیتلیال قطبی‌شده پستانداران نشان داده شده است (36). با این حال، هنگامی که سرامید C18-C16 در غشای ER وجود دارد، وقتی کمپلکس p24 به Gas1-GFP متصل می‌شود، خوشه‌های بزرگ و جداگانه تشکیل نمی‌شوند. مکانیسم اساسی ممکن است به خواص فیزیکی و شیمیایی خاص سرامید زنجیره آسیل بلند بستگی داشته باشد. مطالعات بیوفیزیکی غشاهای مصنوعی نشان می‌دهد که اگرچه سرامیدهای زنجیره آسیل بلند (C24) و کوتاه (C18-C16) می‌توانند باعث جداسازی فاز شوند، اما فقط سرامیدهای زنجیره آسیل بلند (C24) می‌توانند انحنای بالا و خمیدگی فیلم را برای تغییر شکل فیلم افزایش دهند. از طریق ارجاع متقابل (17، 37، 38). نشان داده شده است که مارپیچ غشایی TMED2، همولوگ انسانی Emp24، به طور انتخابی با اسفنگومیلین مبتنی بر سرامید C18 در لوبول‌های سیتوپلاسمی تعامل دارد (39). با استفاده از شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی (MD)، دریافتیم که سرامیدهای C18 و C26 هر دو در اطراف لوبول‌های سیتوپلاسمی مارپیچ غشایی Emp24 تجمع می‌یابند و ترجیحات مشابهی دارند (شکل S6). شایان ذکر است که این نشان می‌دهد که مارپیچ غشایی Emp24 می‌تواند منجر به توزیع نامتقارن لیپیدها در غشاء شود. این یک نتیجه اخیر بر اساس سلول‌های پستانداران است. شبیه‌سازی‌های MD مشابه نیز وجود لیپیدهای اتری را نشان می‌دهند (40). بنابراین، ما حدس می‌زنیم که سرامید C26 در دو لوبول ER26 به صورت موضعی غنی شده است. هنگامی که GPI-AP در لوبول‌های لومینال مستقیماً به p24 چند ظرفیتی متصل می‌شود و تجمع سرامید C26 در اطراف p24 در لوبول‌های سیتوپلاسمی، می‌تواند تجمع پروتئین همراه را افزایش دهد و انحنای غشاء از طریق انگشتان ایجاد شود (41)، که باعث می‌شود GPI-AP به نواحی گسسته مجاور ERES جدا شود، که این امر همچنین به نواحی بسیار خمیده غشای ER کمک می‌کند (42). گزارش‌های قبلی از مکانیسم پیشنهادی پشتیبانی می‌کنند (43، 44). اتصال چند ظرفیتی الیگولکتین‌ها، پاتوژن‌ها یا آنتی‌بادی‌ها به گلیکوسفینگولیپیدهای مبتنی بر سرامید (GSL) روی غشای پلاسما، تجمع بزرگ GSL را تحریک می‌کند، جداسازی فاز را افزایش می‌دهد و باعث تغییر شکل و درونی شدن غشاء می‌شود (44). ایوابوچی و غیره (43) مشخص شد که در حضور زنجیره‌های آسیل بلند (C24) اما نه کوتاه (C16)، لیگاند چند ظرفیتی متصل به لاکتوسیل سرامید GSL باعث تشکیل خوشه‌های بزرگ و فرورفتگی غشاء می‌شود و انتقال سیگنال سیتوپلاسمی با واسطه Lyn روی برگچه‌ها توسط زنجیره‌های آسیل در نوتروفیل‌های جفت شده به هم متصل می‌شود.
در سلول‌های اپیتلیال قطبی‌شده پستانداران، غلظت شبکه ضد گلژی (TGN) تا سطح غشای پلاسمایی رأسی، جداسازی و جداسازی GPI-AP را کنترل می‌کند (10، 45). این تجمع توسط الیگومریزاسیون GPI-AP هدایت می‌شود (36)، اما ممکن است به طول زنجیره سرامیدی که در مخمر یافت می‌شود نیز بستگی داشته باشد. اگرچه GPI-AP پستانداران دارای یک لنگر مبتنی بر لیپید اتر است و ساختار شیمیایی آن با سرامید زنجیره آسیل بسیار طولانی بسیار متفاوت است، یک مطالعه اخیر نشان داد که هر دو لیپید از نظر تکاملی دارای خواص و عملکرد فیزیکی و شیمیایی مشابهی هستند (40). بنابراین، بخش لیپید اتر در سلول‌های پستانداران ممکن است شبیه سرامید C26 در مخمر باشد و نقش آن ارتباط با سرامید زنجیره بلند در غشا برای ترویج تجمع و جداسازی GPI-AP است. اگرچه این احتمال هنوز نیاز به آزمایش مستقیم دارد، یافته‌های قبلی تأیید می‌کنند که انتقال سرامید با زنجیره آسیل بلند به جسم گلژی توسط پروتئین‌های انتقال سیتوپلاسمی انجام نمی‌شود، بلکه به سنتز لنگرهای GPI مانند مخمر بستگی دارد. بنابراین، به نظر می‌رسد مکانیسم محافظه‌کارانه تکاملی قادر است به طور انتخابی سرامید با زنجیره آسیل بسیار بلند و GPI-AP (13، 16، 20، 46، 47) را در همان وزیکول انتقالی به طور همزمان انتقال دهد.
در سیستم‌های سلول‌های اپیتلیال قطبی‌شده مخمر و پستانداران، تجمع و جداسازی GPI-AP از سایر پروتئین‌های غشای پلاسما، همگی قبل از رسیدن به سطح سلول رخ می‌دهند. پالادینو و همکارانش (48) دریافتند که در TGN سلول‌های اپیتلیال قطبی‌شده پستانداران، خوشه‌بندی GPI-AP نه تنها برای طبقه‌بندی انتخابی GPI-APها به غشای پلاسمایی رأسی ضروری است، بلکه سازماندهی خوشه‌بندی GPI-APها و فعالیت بیولوژیکی آنها را نیز تنظیم می‌کند. سطح سلول. در مخمر، این مطالعه نشان داد که خوشه GPI-AP وابسته به سرامید C26 روی ER می‌تواند سازماندهی خوشه و فعالیت عملکردی GPI-AP را روی غشای پلاسما تنظیم کند (24، 49). مطابق با این مدل، سلول‌های GhLag1 به مهارکننده‌های GPI یا داروهایی که بر یکپارچگی دیواره سلولی تأثیر می‌گذارند، حساسیت دارند (28) و نیاز به خوشه‌های عملکردی Gas1-GFP (49) سرامید نوک پیش‌بینی‌شده در جفت‌گیری سلول‌های مخمر، نشان‌دهنده G​​​ پیامدهای فیزیولوژیکی احتمالی سلول‌های hLag1 است. خطای GPI-AP. با این حال، آزمایش بیشتر اینکه آیا سازماندهی عملکردی سطح سلول از طریق یک روش مرتب‌سازی بر اساس طول لیپید از ER برنامه‌ریزی شده است یا خیر، موضوع تحقیقات آینده ما خواهد بود.
سویه‌های ساکارومایسس سرویزیه مورد استفاده در این کار در جدول S1 فهرست شده‌اند. سویه‌های MMY1583 و MMY1635 از SCLIM برای تصویربرداری از سلول‌های زنده در پس‌زمینه W303 ساخته شدند. این سویه‌ها که Sec13-mCherry را با برچسب پروتئین فلورسنت بیان می‌کنند، با استفاده از روشی مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با پلاسمید pFA6a به عنوان الگو ساخته شدند (23). سویه بیان‌کننده Mid2-iRFP که با پروتئین فلورسنت تحت کنترل پروموتر GAL1 نشاندار شده بود، به شرح زیر ساخته شد. تکثیر PCR توالی iRFP-KanMx از ناقل pKTiRFP-KAN (هدیه‌ای از E. O'Shea، شماره پلاسمید Addgene 64687؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ شناسه منبع تحقیق (RRID): Addgene_64687) و در انتهای C از Mid2 درون‌زا قرار داده شد. پس از تکثیر و کلون شدن توالی ژنوم Mid2-iRFP در پروموتر GAL1، این توالی در جایگاه Not I-Sac I پلاسمید ادغامی pRS306 ادغام شد. پلاسمید حاصل pRGS7 با Pst I خطی‌سازی شد تا در لوکوس URA3 ادغام شود.
ژن همجوشی Gas1-GFP تحت کنترل پروموتر GAL1 در پلاسمید سانترومر (CEN) بیان می‌شود که به شرح زیر ساخته شده است. توالی Gas1-GFP با PCR از پلاسمید pRS416-GAS1-GFP (24) (هدیه‌ای از L. Popolo) تکثیر و در جایگاه Xma I–Xho I پلاسمید CEN pBEVY-GL LEU2 (هدیه‌ای از C) کلون شد. میلر؛ شماره پلاسمید Addgene 51225؛ http://n2t.net/addgene: 51225؛ RRID: Addgene_51225). پلاسمید حاصل pRGS6 نامگذاری شد. ژن همجوشی Axl2-GFP نیز تحت کنترل پروموتر GAL1 ناقل pBEVY-GL LEU2 بیان می‌شود و ساختار آن به شرح زیر است. توالی Axl2-GFP از پلاسمید pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) با استفاده از PCR تکثیر و در جایگاه Bam HI-Pst I از ناقل pBEVY-GL LEU2 کلون شد. پلاسمید حاصل pRGS12 نامگذاری شد. توالی الیگونوکلئوتیدهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول S2 فهرست شده است.
این سویه با 0.2٪ آدنین و 2٪ گلوکز [YP-دکستروز (YPD)]، 2٪ رافینوز [YP-رافینوز] محیط کشت پروتئین p (YP) غنی از عصاره مخمر (1٪ عصاره مخمر و 2٪ پروتئین ept). (YPR)] یا 2٪ گالاکتوز [YP-گالاکتوز (YPG)] به عنوان منبع کربن، یا در یک محیط کشت حداقل مصنوعی (0.15٪ پایه نیتروژن مخمر و 0.5٪ سولفات آمونیوم) برای تکمیل اسیدهای آمینه و بازهای مناسب مورد نیاز برای تغذیه، و حاوی 2٪ گلوکز (محیط کشت حداقل گلوکز مصنوعی) یا 2٪ گالاکتوز (محیط کشت حداقل گالاکتوز مصنوعی) به عنوان منبع کربن، تکمیل شد.
برای تصویربرداری در زمان واقعی، سلول‌های جهش‌یافته حساس به دما sec31-1 که سازه را تحت پروموتر GAL1 بیان می‌کردند، در محیط کشت YPR در دمای 24 درجه سانتیگراد به مدت یک شب تا اواسط فاز لگاریتمی رشد داده شدند. پس از القا در YPG در دمای 24 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت، سلول‌ها به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد در SG انکوبه شدند و سپس برای آزاد شدن از بلوک ترشح به دمای 24 درجه سانتیگراد منتقل شدند. از کانکاناوالین A برای تثبیت سلول‌ها روی یک اسلاید شیشه‌ای استفاده شد و توسط SCLIM تصویربرداری شد. SCLIM ترکیبی از میکروسکوپ فلورسانس معکوس Olympus IX-71 و لنز روغنی دیافراگم عددی UPlanSApo 100×1.4 (Olympus)، اسکنر کانفوکال دیسک چرخان با سرعت بالا و نسبت سیگنال به نویز بالا (Yokogawa Electric)، طیف‌سنج سفارشی و خنک‌کننده سفارشی است. تقویت‌کننده تصویر سیستم (Hamamatsu Photonics) می‌تواند یک سیستم لنز بزرگنمایی با بزرگنمایی نهایی ×266.7 و یک دوربین دستگاه جفت‌شده با بار که الکترون‌ها را چند برابر می‌کند (Hamamatsu Photonics) (21) فراهم کند. اخذ تصویر توسط نرم‌افزار سفارشی (Yokogawa Electric) انجام می‌شود. برای تصاویر سه‌بعدی، ما از یک محرک پیزوالکتریک سفارشی برای ارتعاش عمودی لنز شیئی استفاده کردیم و قطعات نوری را با فاصله 100 نانومتر از هم در یک پشته جمع‌آوری کردیم. تصویر Z-stack به داده‌های وکسل سه‌بعدی تبدیل می‌شود و تابع گسترش نقطه‌ای نظری مورد استفاده برای میکروسکوپ کانفوکال دیسک چرخان برای پردازش دکانولوشن توسط نرم‌افزار Volocity (PerkinElmer) استفاده می‌شود. با استفاده از نرم‌افزار Volocity برای آستانه‌گذاری خودکار برای تحلیل هم‌مکانی، ERES شامل محموله اندازه‌گیری شد. تحلیل اسکن خطی با استفاده از نرم‌افزار MetaMorph (Molecular Devices) انجام شد.
برای تعیین معناداری آماری از نرم‌افزار GraphPad Prism استفاده کنید. برای آزمون t دوطرفه استیودنت و آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه معمولی (ANOVA)، تفاوت بین گروه‌ها با سطح معنی‌داری 0.05 (*) در نظر گرفته می‌شود.
برای میکروسکوپ فلورسانس Gas1-GFP، سلول‌های فاز لگاریتمی به مدت یک شب در YPD رشد داده شدند و با سانتریفیوژ جمع‌آوری شدند، دو بار با محلول نمکی فسفات بافر شسته شدند و حداقل 15 دقیقه روی یخ انکوبه شدند و سپس همانطور که قبلاً توضیح داده شد، زیر میکروسکوپ قرار گرفتند (چک (24). میکروسکوپ Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) مجهز به لنز شیئی، فیلتر L5 (GFP)، دوربین Hamamatsu و نرم‌افزار Application Suite X (LAS X) برای تصویربرداری استفاده شد.
نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه با بافر نمونه SDS در دمای 65 درجه سانتیگراد دناتوره شدند و سپس با الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید SDS (PAGE) از هم جدا شدند. برای آنالیز ایمونوبلاتینگ، 10 میکرولیتر نمونه در هر لاین بارگذاری شد. آنتی‌بادی اولیه: از آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوشی Anti-Gas1 با رقت 1:3000، آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوشی Anti-Emp24 با رقت 1:500 و آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوشی Anti-GFP (هدیه‌ای از H. Riezman) با رقت 1:3000 استفاده شد. آنتی‌بادی مونوکلونال موشی Anti-Pgk1 با رقت 1:5000 (هدیه‌ای از J. de la Cruz) استفاده شد. آنتی‌بادی ثانویه: ایمونوگلوبولین G (IgG) کونژوگه بزی ضد خرگوشی Horseradish Peroxidase (HRP) با رقت 1:3000 (Pierce) استفاده شد. IgG بز کونژوگه شده با HRP ضد موش با رقت 1:3000 (Pierce) استفاده شد. ناحیه پاسخ ایمنی با روش کمیلومینسانس معرف SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) مشاهده شد.
همانطور که در (31) توضیح داده شده است، یک آزمایش ایمونوپرسیپیتاسیون طبیعی بر روی بخش غنی‌شده ER انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌های مخمر را با بافر TNE [50 میلی‌مولار تریس-HCl (pH 7.5)، 150 میلی‌مولار NaCl، 5 میلی‌مولار EDTA، 1 میلی‌مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید و مخلوط مهارکننده پروتئاز] در طول موج 600 نانومتر (OD600) با چگالی نوری 100 دو بار بشویید. با مهره‌های شیشه‌ای شکسته شد و سپس بقایای سلولی و مهره‌های شیشه‌ای با سانتریفیوژ حذف شدند. سپس محلول رویی به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 17000 گرم سانتریفیوژ شد. رسوب در TNE دوباره به حالت تعلیق درآمد و ساپونین دیژیتال تا غلظت نهایی 1٪ اضافه شد. سوسپانسیون به مدت 1 ساعت با چرخش در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد و سپس اجزای نامحلول با سانتریفیوژ در سرعت 13000 گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه حذف شدند. برای ایمونوپرسیپیتاسیون Gas1-GFP، ابتدا نمونه را با دانه‌های آگارز خالی (ChromoTek) در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت انکوبه کنید و سپس با GFP-Trap_A (ChromoTek) در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت انکوبه کنید. دانه‌های ایمونوپرسیپیتاسیون شده پنج بار با TNE حاوی 0.2٪ دیگوکسیژنین شسته شدند، با بافر نمونه SDS شسته شدند، روی SDS-PAGE جدا شدند و با ایمونوبلاتینگ آنالیز شدند.
همانطور که در (31) توضیح داده شده است، تعیین اتصال عرضی روی بخش ER غنی‌شده انجام شد. به طور خلاصه، بخش ER غنی‌شده با 0.5 میلی‌مولار دی‌تیوبیس (سوکسینیمیدیل پروپیونات) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) انکوبه شد. واکنش اتصال عرضی با اضافه کردن گلیسین (غلظت نهایی 50 میلی‌مولار، 5 دقیقه، 20°C) خاموش شد.
همانطور که قبلاً توضیح داده شد (50)، آنالیز MS سرامید در سویه‌های وحشی و GhLag1 انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌ها در YPD در دمای 30 درجه سانتیگراد تا فاز نمایی (3 تا 4 واحد OD600 در میلی‌لیتر) رشد داده شدند و 25×107 سلول برداشت شد. متابولیسم آنها با اسید تری کلرواستیک خاموش می‌شود. از حلال استخراج [اتانول، آب، اتر، پیریدین و 4.2 نرمال هیدروکسید آمونیوم (15:15:5:1:0.018 v/v)] و 1.2 نانومول سرامید استاندارد داخلی C17 (860517، لیپید قطبی Avanti) با کیفیت استفاده کنید. از معرف مونومتیل‌آمین [متانول، آب، محلول n-بوتانول و متیل‌آمین (4:3:1:5 v/v)] برای انجام هیدرولیز قلیایی ملایم عصاره استفاده کنید و سپس از n-بوتانول اشباع شده با آب برای نمک‌زدایی استفاده کنید. در نهایت، عصاره در یک حلال حالت مثبت [کلروفرم/متانول/آب (2:7:1) + 5 میلی‌مولار آمونیوم استات] دوباره به حالت تعلیق درآمد و به طیف‌سنج جرمی تزریق شد. پایش چند واکنشی (MRM) برای شناسایی و تعیین مقدار مولکول‌های اسفنگولیپید انجام شد. طیف‌سنج جرمی چهارقطبی سوم TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) به یک منبع یون نانوجریان رباتیک Nanomate HD (Advion Biosciences، ایتاکا، نیویورک) برای تجزیه و تحلیل لیپید مجهز است. انرژی برخورد برای هر دسته سرامید بهینه شده است. داده‌های MS در حالت مثبت به دست آمد. برای هر تکرار بیولوژیکی، سیگنال لیپید میانگین سه اندازه‌گیری مستقل است.
همانطور که در (31) توضیح داده شده است، سلول‌های (800×107) بیان‌کننده Gas1-GFP تحت ایمونوپرسیپیتاسیون طبیعی قرار گرفتند. Gas1-GFP خالص‌شده با SDS-PAGE جدا شده و به غشای پلی‌وینیلیدین فلوراید (PVDF) منتقل شد. پروتئین با رنگ‌آمیزی PVDF با آمید بلک مشاهده شد. باند Gas1-GFP از PVDF بریده شد و 5 بار با متانول و یک بار با آب با درجه خلوص کروماتوگرافی مایع-MS (LC-MS) شسته شد. با انکوباسیون نوار غشا با 500 میکرولیتر NaOAc 0.3 مولار (pH 4.0)، بافر و 500 میکرولیتر مخلوط نیتریت سدیم 1 مولار تازه حل شده در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت، بخش لیپیدی از Gas1-GFP آزاد شده و لیز می‌شود و اینوزین فسفات سرامید بین گلوکزامین و اینوزیتول آزاد می‌شود (51). پس از آن، نوار غشا چهار بار با آب درجه LC-MS شسته شد، در دمای اتاق خشک شد و تا زمان تجزیه و تحلیل در اتمسفر نیتروژن در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. به عنوان شاهد، برای هر آزمایش از یک نمونه خالی از غشای PVDF استفاده شد. لیپید استخراج شده از Gas1-GFP سپس توسط MS همانطور که شرح داده شد (50) تجزیه و تحلیل شد. به طور خلاصه، نوارهای PVDF حاوی GPI-لیپید در 75 میکرولیتر حلال کپک منفی [کلروفرم/متانول (1:2) + 5 میلی مولار آمونیوم استات] دوباره به حالت تعلیق درآمدند و یونیزاسیون الکترواسپری (ESI)-MRM/MS گونه‌های اسفنگولیپید (TSQ Vantage) را پشت سر گذاشتند. در این حالت، داده‌های MS در حالت یون منفی به دست آمد.
همانطور که قبلاً ذکر شد، بخش لیپیدی لنگر GPI از GPI-AP نشاندار شده با [3H]-اینوزیتول جدا شد (16). لیپیدها با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک با استفاده از سیستم حلال (55:45:10 کلروفرم-متانول-0.25% KCl) جدا شده و با استفاده از FLA-7000 (فوجی فیلم) قابل مشاهده شدند.
سلول‌های بیان‌کننده Gas1-GFP (600×107) دو بار با بافر TNE به همراه بافر TNE شسته شدند و با مهره‌های شیشه‌ای شکسته شدند و سپس برای حذف بقایای سلولی و مهره‌های شیشه‌ای سانتریفیوژ شدند. سپس محلول رویی به مدت 1 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با سرعت 17000 گرم سانتریفیوژ شد. رسوب در TNE شسته شد و با 1 واحد PI-PLC (Invitrogen) در TNE حاوی 0.2٪ ساپونین دیجیتال به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از تیمار آنزیمی، غشاء با سانتریفیوژ در سرعت 17000 گرم در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت برداشته شد. برای ایمونوپرسیپیتاسیون Gas1-GFP، محلول رویی با GFP-Trap_A (ChromoTek) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت یک شب انکوبه شد. Gas1-GFP خالص‌شده که توسط SDS-PAGE جدا شده بود، با رنگ آبی درخشان کوماسی رنگ‌آمیزی شد. نوار رنگ‌آمیزی Gas1-GFP از رنگ خاکستری اطراف کانال بریده شد و سپس پس از آلکیلاسیون با یدواستامید و احیا با دیتیوتریتول، هضم درون ژلی با تریپسین انجام شد. پپتیدهای تریپتیک و پپتیدها را با GPI-گلیکان‌ها استخراج و خشک کنید. پپتید خشک شده در 20 میکرولیتر آب حل شد. بخشی (8 میکرولیتر) را به LC تزریق کنید. یک ستون اکتادسیل سیلان (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5؛ قطر داخلی 150 میلی‌متر × 1.0 میلی‌متر؛ Nomura Chemical، استان آیچی، ژاپن) برای جداسازی پپتیدها تحت شرایط گرادیان خاص استفاده شد. فاز متحرک حلال A (0.08٪ اسید فرمیک) و حلال B (0.15٪ اسید فرمیک در 80٪ استونیتریل) است. یک سیستم HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific، بوستون، ماساچوست) برای شستشوی ستون با حلال A در عرض 55 دقیقه با سرعت جریان 50 میکرولیتر در دقیقه به مدت 5 دقیقه استفاده شد و سپس غلظت حلال B به 40٪ افزایش یافت. ، ایالات متحده). محلول حاصل به طور مداوم به منبع یون ESI وارد شد و پپتیدهای تریپتیک و پپتیدهای حاوی GPI-گلیکان‌ها توسط LTQ Orbitrap XL (طیف‌سنج جرمی هیبرید تله یونی خطی-اوربیترپ؛ Thermo Fisher Scientific) تجزیه و تحلیل شدند. در تنظیمات MS، ولتاژ منبع مویرگی روی 4.5 کیلوولت تنظیم شد و دمای مویرگی انتقال در 300 درجه سانتیگراد نگه داشته شد. ولتاژ مویرگی و ولتاژ لنز لوله به ترتیب روی 15 ولت و 50 ولت تنظیم شدند. داده‌های طیف‌سنجی جرمی (MS) در حالت یون مثبت (وضوح ۶۰۰۰۰؛ دقت جرمی ۱۰ قسمت در میلیون) در محدوده جرمی ۳۰۰/m/z نسبت جرم/بار (m/z) ۳۰۰۰ به دست آمد. داده‌های MS/MS از طریق تله یونی در LTQ Orbitrap XL [سه رقم اول که داده‌ها به آنها بستگی دارند، تفکیک القایی برخورد (CID)] به دست می‌آیند.
شبیه‌سازی‌های MD با استفاده از نرم‌افزار GROMACS (52) و میدان نیروی MARTINI 2 (53-55) انجام شد. سپس از سازنده غشای CHARMM GUI (56، 57) برای ساخت یک لایه دوتایی حاوی دی اولئوئیل فسفاتیدیل کولین (DOPC) و Cer C18 یا DOPC و Cer C26 استفاده شد. توپولوژی و مختصات Cer C26 با حذف مهره‌های اضافی از دم اسفنگوزین از DXCE استخراج می‌شود. از فرآیند شرح داده شده در زیر برای متعادل کردن لایه دوتایی و اجرای آن استفاده کنید، سپس از آخرین مختصات سیستم برای ساخت سیستمی حاوی Emp24 استفاده کنید. دامنه غشایی مخمر Emp24 (باقیمانده‌های 173 تا 193) به عنوان یک مارپیچ α با استفاده از ساختار مولکولی ابزار بصری MD (VMD) (58) ساخته شد. سپس، پس از حذف لیپیدهای همپوشانی، پروتئین به صورت دانه‌ای درشت شده و با استفاده از CHARMM GUI به لایه دوتایی وارد شد. سیستم نهایی شامل ۱۲۰۲ DOPC و ۳۰۲ Cer C26 یا ۱۱۹۷ DOPC و ۲۹۵ Cer C18 و Emp24 است. سیستم را تا غلظت ۰.۱۵۰ مولار یونیزه کنید. چهار تکرار مستقل برای دو ترکیب دولایه انجام شد.
دولایه لیپیدی با استفاده از فرآیند CHARMM GUI متعادل می‌شود، که شامل کمینه‌سازی و سپس متعادل‌سازی ۴۰۵۰۰۰ مرحله است، که در آن محدودیت‌های موقعیت به تدریج کاهش یافته و حذف می‌شوند و گام زمانی از ۰.۰۰۵ پیکوثانیه به ۰.۰۲ پیکوثانیه افزایش می‌یابد. پس از تعادل، ۶ میکروثانیه با گام زمانی ۰.۰۲ پیکوثانیه تولید می‌کند. پس از قرار دادن Emp24، از همان فرآیند CHARMM GUI برای کمینه‌سازی و متعادل‌سازی سیستم استفاده کنید و سپس به مدت ۸ ثانیه در مرحله تولید اجرا کنید.
برای همه سیستم‌ها، در طول فرآیند تعادل، فشار توسط باروستات برندسن (59) و در طول فرآیند تولید، فشار توسط باروستات پارینلو-رحمان (60) کنترل می‌شود. در همه موارد، فشار متوسط ​​1 بار است و از یک طرح کوپلینگ فشار نیمه ایزوتروپیک استفاده می‌شود. در فرآیند تعادل و تولید، از یک ترموستات (61) با کالیبراسیون مجدد سرعت برای کوپلینگ دمای ذرات پروتئین، لیپید و حلال به ترتیب استفاده می‌شود. در طول کل عملیات، دمای هدف 310 کلوین است. برهمکنش غیرپیوندی با تولید یک لیست جفت‌سازی با استفاده از طرح ورلت با تلرانس بافر 0.005 محاسبه می‌شود. عبارت کولمب با استفاده از میدان واکنش و فاصله قطع 1.1 نانومتر محاسبه می‌شود. عبارت واندر والس از یک طرح قطع با فاصله قطع 1.1 نانومتر استفاده می‌کند و طرح قطع ورلت برای رانش پتانسیل استفاده می‌شود (62).
با استفاده از VMD، طول موج حد فاصل بین دانه‌های فسفات DOPC یا دانه‌های سرامید AM1 و پروتئین 0.7 نانومتر است و تعداد لیپیدهایی که با پروتئین تعامل دارند محاسبه می‌شود. طبق فرمول زیر، فاکتور تخلیه-غنی‌سازی (DE) را مانند (63) محاسبه کنید: فاکتور DE = (مقدار کل لیپیدها در پروتئین 0.7) در پروتئین 0.7 (مقدار Cer در کل لیپیدها)
مقدار گزارش شده به صورت میانگین بدست آمده است و میله‌های خطا چهار کپی مستقل از SE هستند. معناداری آماری عامل DE با آزمون t [(میانگینDE-فاکتور-1)/SE] محاسبه می‌شود. مقدار P را از توزیع یک‌طرفه محاسبه کنید.
از ابزار GROMACS برای محاسبه نقشه چگالی جانبی دوبعدی سیستم حاوی Emp24 در 250 نانوثانیه آخر ردیابی استفاده شد. برای بدست آوردن نقشه غنی‌سازی/تهی‌سازی سرامید، نقشه چگالی Cer بر مجموع نقشه Cer و DOPC تقسیم شده و سپس بر غلظت Cer در بدن تقسیم می‌شود. از همان مقیاس نقشه رنگی استفاده می‌شود.
برای مطالب تکمیلی این مقاله، لطفاً به http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 مراجعه کنید.
این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution-Non-Commercial توزیع شده است، که استفاده، توزیع و تکثیر در هر رسانه‌ای را مجاز می‌داند، مادامی که استفاده نهایی برای سود تجاری نباشد و فرض بر این باشد که اثر اصلی صحیح است. مرجع.
توجه: ما فقط از شما می‌خواهیم آدرس ایمیل خود را ارائه دهید تا شخصی که به صفحه توصیه می‌کنید بداند که می‌خواهید ایمیل را ببیند و اینکه هرزنامه نیست. ما هیچ آدرس ایمیلی را ثبت نخواهیم کرد.
این سوال برای بررسی اینکه آیا شما بازدیدکننده هستید یا خیر و جلوگیری از ارسال خودکار هرزنامه استفاده می‌شود.
سوفیا رودریگز-گالاردو، کازوئو کوروکاوا، سوزانا سابیدو-بوزو، آلخاندرو کورتز · گومز (الخاندرو کورتس-گومز)، آتسوکو ایکدا (آتسوکو ایکدا)، والریا زونی (والریا زونی)، آکسیلیادورا آگویلرا-رومرو، آناسریو لوپه‌رومرو، آناسر لوپه، آناژیو، واگا (میهو واگا)، میساکو آرمان (میساکو آرمان)، میاکو ریمان (میاکو ریمان)، پروو آکیرا، استفانو فانی، آکیهیکو ناکانو، مانوئل مونیز
تصویربرداری سه‌بعدی با وضوح بالا در زمان واقعی، اهمیت طول زنجیره سرامید را برای دسته‌بندی پروتئین در جایگاه‌های خروجی انتخابی نشان می‌دهد.
سوفیا رودریگز-گالاردو، کازوئو کوروکاوا، سوزانا سابیدو-بوزو، آلخاندرو کورتز · گومز (الخاندرو کورتس-گومز)، آتسوکو ایکدا (آتسوکو ایکدا)، والریا زونی (والریا زونی)، آکسیلیادورا آگویلرا-رومرو، آناسریو لوپه‌رومرو، آناسر لوپه، آناژیو، واگا (میهو واگا)، میساکو آرمان (میساکو آرمان)، میاکو ریمان (میاکو ریمان)، پروو آکیرا، استفانو فانی، آکیهیکو ناکانو، مانوئل مونیز
تصویربرداری سه‌بعدی با وضوح بالا در زمان واقعی، اهمیت طول زنجیره سرامید را برای دسته‌بندی پروتئین در جایگاه‌های خروجی انتخابی نشان می‌دهد.
©2020 انجمن آمریکایی برای پیشرفت علم. تمامی حقوق محفوظ است AAAS شریک HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER است. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.