از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
برخلاف مهره‌داران، تصور می‌شود که حشرات فاقد هورمون‌های استروئیدی جنسی متمایل به جنس نر هستند. در آنوفل گامبیا، به نظر می‌رسد که استروئید اکدیسون 20-هیدروکسی اکدیسون (20E) برای کنترل رشد تخم در هنگام سنتز توسط ماده‌ها تکامل یافته است2 و در هنگام انتقال جنسی توسط نرها، یک دوره مقاومت جفت‌گیری را القا می‌کند3. از آنجایی که رشد تخم و جفت‌گیری از ویژگی‌های تولید مثلی ضروری هستند، درک چگونگی ادغام این سیگنال‌های هورمونی توسط پشه‌های آنوفل ماده می‌تواند طراحی برنامه‌های جدید کنترل مالاریا را تسهیل کند. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که این عملکردهای تولید مثلی توسط استروئیدهای جنسی متمایز از طریق شبکه‌ای پیچیده از آنزیم‌های فعال‌کننده/غیرفعال‌کننده اکدیستروئید تنظیم می‌شوند. ما یک اکدیسون اکسید شده مخصوص نر، ​​3-دهیدرو-20E (3D20E) را شناسایی کردیم که با خاموش کردن پذیرش جنسی ماده پس از انتقال جنسی و فعال‌سازی توسط دفسفوریلاسیون، از والدین محافظت می‌کند. نکته قابل توجه این است که انتقال 3D20E همچنین بیان ژن‌های تولید مثلی را القا کرد که رشد تخم را در طول عفونت پلاسمودیوم حفظ می‌کنند و سلامت افراد آلوده را تضمین می‌کنند. ماده‌ها. 20E مشتق‌شده از ماده، پاسخ جنسی ایجاد نمی‌کند، اما به افراد جفت‌گیر اجازه می‌دهد پس از مهار کینازهای مهارکننده 20E، تخم‌گذاری کنند. شناسایی این هورمون استروئیدی مخصوص حشرات نر و نقش آن در تنظیم پذیرش جنسی، باروری و تعامل با پلاسمودیوم ماده، نشان‌دهنده پتانسیل کاهش موفقیت تولید مثلی پشه‌های ناقل مالاریا است.
موارد ابتلا به مالاریا و مرگ و میر ناشی از آن به دلیل مقاومت گسترده پشه‌های آنوفل، تنها ناقل انگل مالاریای انسانی، دوباره در حال افزایش است4. زیست‌شناسی جفت‌گیری این پشه‌ها هدف بسیار جذابی برای مداخلات جدید کنترل مالاریا است زیرا پشه‌های ماده فقط یک بار جفت‌گیری می‌کنند5؛ عقیم‌سازی این رویداد جفت‌گیری منفرد، پتانسیل زیادی برای کاهش جمعیت پشه‌ها در مزارع خواهد داشت.
زنان پس از دریافت هورمون‌های استروئیدی با تیتر بالا از مردان، از نظر جنسی ناتوان می‌شوند. مطالعات نشان داده‌اند که عامل ایجاد مشکل در جفت‌گیری بیشتر، 20-هیدروکسی‌اکدیسون (20E) است، هورمونی استروئیدی که بیشتر به عنوان تنظیم‌کننده چرخه پوست‌اندازی در مرحله لاروی شناخته می‌شود. توانایی نرها در سنتز و انتقال 20E به طور خاص در گونه‌های آنوفل که بخشی از زیرجنس Cellia7 هستند، تکامل یافته است که در آفریقا توزیع شده و شامل خطرناک‌ترین ناقلان مالاریا، از جمله آنوفل گامبیا، می‌شود. این امر به ویژه قابل توجه است زیرا در این گونه‌ها، ماده‌ها نیز پس از هر وعده غذایی خون، 20E تولید می‌کنند و 20E چرخه اووژنز را هدایت می‌کند (به مرجع 8 مراجعه کنید). با این حال، اطلاعات کمی در مورد نحوه ادغام سیگنال‌های ماده‌ها از دو منبع مختلف اکدیسون (انتقال نر و القای تغذیه از خون) بدون به خطر انداختن توانایی خود در جفت‌گیری وجود دارد. در واقع، اگر 20E تولید شده توسط ماده‌ها باعث عدم تحمل جنسی شود، این امر منجر به ناباروری در افراد تغذیه‌کننده از باکره می‌شود که یک پدیده بسیار رایج است. رفتار در این پشه‌ها5.
یک توضیح احتمالی این است که نرهای A. gambiae یک اکدیسون اصلاح‌شده مخصوص نر را منتقل می‌کنند که آبشار سیگنالینگ را در دستگاه تناسلی ماده فعال می‌کند و منجر به بی‌ثباتی جفت‌گیری می‌شود. با این حال، اگرچه مهره‌داران هورمون‌های استروئیدی متعددی مانند استروژن و آندروژن دارند (در مرجع 9 بررسی شده است)، تا آنجا که ما می‌دانیم، استروئیدهای آندروژنی در حشرات شناسایی نشده‌اند.
ما در جستجوی استروئیدهای اصلاح‌کننده احتمالی، اقدام به تعیین مجموعه هورمون‌های استروئیدی در غده فرعی نر (MAG) در گونه بالغ جنسی A. gambiae کردیم. با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا همراه با طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (HPLC-MS/MS) به جای روش کم‌اختصاصیت‌تر قبلی، اکدیزون (E) و 20E را در این بافت شناسایی کردیم که نتایج قبلی را تأیید می‌کرد. با این حال، نمونه تحت سلطه استروئیدهای فسفریله شده اکسید شده بود که با فرمول 3-دهیدرو-20E-22-فسفات (3D20E22P)12 مطابقت دارد (شکل 1). سایر اشکال شامل 3-دهیدرو-20E (3D20E) و 20E-22-فسفات (20E22P) است. شدت سیگنال HPLC-MS/MS مربوط به 3D20E22P دو مرتبه بزرگتر از فرم دفسفریله شده آن، 3D20E، و سه مرتبه بزرگتر از E و 20E بود (شکل 1). اگرچه در سایر قسمت‌های بدن و دستگاه تناسلی تحتانی (LRT؛ داده‌های گسترده شکل 1a). ما همچنین اکدی‌استروییدها را در نرها و ماده‌های تازه بسته شده (<1 روزه) تجزیه و تحلیل کردیم و 3D20E و 3D20E22P را فقط در MAG شناسایی کردیم. E، 20E و 20E22P در هر دو جنس وجود داشتند (داده‌های گسترده شکل 1b). این داده‌ها نشان می‌دهد که نرهای بالغ A. gambiae تیترهای بالایی از هورمون‌های اصلاح‌کننده را در MAGهای خود تولید می‌کنند که توسط ماده‌ها سنتز نمی‌شوند.
MAG و LRT ماده (شامل دهلیزها، کیسه‌های منی و پاروواریوم) از نرهای باکره ۴ روزه (۴ روزه) و ماده‌های باکره و جفت‌گیری شده (۰.۵، ۳ و ۱۲ اسب بخار در دقیقه) تشریح شدند. اکدیسون در این بافت‌ها با HPLC-MS/MS (میانگین ± میانگین؛ آزمون t جفت نشده، دو طرفه، نرخ کشف کاذب (FDR) اصلاح شده؛ NS، معنی‌دار نیست؛ *P < 0.05، **P < 0.01) تجزیه و تحلیل شد. 3D20E: ۳ ساعت در مقابل ۰.۵ ساعت، P = 0.035؛ ۱۲ ساعت در مقابل ۳ ساعت، P = 0.0015؛ ۱۲ ساعت در مقابل ۰.۵ ساعت، P = 0.030. 3D20E22P: ۳ ساعت در مقابل ۰.۵ ساعت، P = 0.25؛ ۱۲ ساعت در مقابل ۳ ساعت، P = 0.0032؛ ۱۲ ساعت در مقابل ۰.۵ ساعت، P = 0.015). داده‌ها از سه تکرار بیولوژیکی هستند. ناحیه پیک برای هر اکدیسون مورد نظر محاسبه و با تعداد پشه‌ها نرمال‌سازی شد. اکدیسون با رنگ‌های زیر نمایش داده شده است: E، سبز؛ 20E، نارنجی؛ 20E22P، بنفش؛ 3D20E، آبی؛ 3D20E22P، صورتی. تصویر داخل کادر، مقیاس روی محور y را افزایش می‌دهد تا سطوح پایین‌تر اکدیسون را نشان دهد.
برای بررسی اینکه آیا 3D20E22P و 3D20E در طول جفت‌گیری منتقل می‌شوند، ما LRT های ماده را در نقاط زمانی مختلف پس از جفت‌گیری تشریح کردیم. اگرچه اکدیزون در باکره‌ها یافت نشد، اما مقادیر قابل توجهی از 3D20E22P را در LRT بلافاصله پس از جفت‌گیری (0.5 ساعت پس از جفت‌گیری، hpm) مشاهده کردیم که با گذشت زمان کاهش یافت، در حالی که سطح 3D20E به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 1). با استفاده از 3D20E سنتز شده شیمیایی به عنوان استاندارد، مشخص کردیم که سطح این هورمون استروئیدی در LRT های جفت‌گیری حداقل 100 برابر بیشتر از 20E است (جدول داده‌های گسترده 1). بنابراین، 3D20E22P اکدیزون اصلی نر است که در طول جفت‌گیری به LRT ماده منتقل می‌شود و شکل دفسفریله شده آن، 3D20E، اندکی پس از جفت‌گیری بسیار فراوان می‌شود. این نشان دهنده نقش مهم اکدیزون دوم در زیست‌شناسی پس از جفت‌گیری ماده است.
پس از تولید یک مجموعه داده جدید توالی‌یابی RNA (RNA-seq) (شکل 2a)، با استفاده از یک خط لوله بیوانفورماتیک سفارشی، ما به دنبال اکدیسون کیناز (EcK)، اکدیسون اکسیداز (EO) و ژن فسفاتاز اصلاح‌شده 20E اکدیسون کدکننده EPP بودیم. EPP در بافت‌های تولیدمثلی بیان می‌شود. ما یک ژن کاندید EPP و دو ژن بالقوه EcK (EcK1 و EcK2) را شناسایی کردیم، اما نتوانستیم یک ژن کاندید EO خوب پیدا کنیم. نکته قابل توجه این است که ژن‌های EPP منفرد در سطوح بالا (صدک 98.9) در MAGهای گامبیایی بیان شدند، اما در LRTهای ماده بیان نشدند (شکل 2b)، برخلاف انتظارات ما، زیرا دفسفوریلاسیون 3D20E22P در این بافت ماده رخ داده است. بنابراین، ما معتقدیم که EPP نر ممکن است در طول جفت‌گیری منتقل شود. در واقع، ما از برچسب‌گذاری ایزوتوپ پایدار در داخل بدن برای پوشاندن پروتئین ماده پس از جفت‌گیری استفاده کردیم، آنزیمی که توسط MS در دهلیز ماده شناسایی شد. (شکل 2c و جدول تکمیلی 1). وجود EPP در MAG و LRT ماده جفت‌گیری کرده (اما نه باکره) نیز با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی تأیید شد (شکل 2d).
الف) یک خط لوله بیوانفورماتیک سفارشی برای جستجوی بافت‌های تولید مثلی هر جنس برای ژن‌های کدکننده EcKs، EOs و EPPs. اعداد کنار فلش‌ها تعداد کاندیداهای نر و ماده را در هر مرحله نشان می‌دهند. این تجزیه و تحلیل یک ژن EPP (EPP) و یک ژن EcK (EcK1) را شناسایی کرد که در نرها بیان می‌شوند، و یک ژن EcK (EcK2) که در هر دو جنس بیان می‌شود اما ژن کاندید EO را ارائه نمی‌دهد. ب) نقشه حرارتی مقایسه بیان ژن کاندید در بافت‌های آنوفل گامبیا و آنوفل آلبیکنس باکره (V) و جفت‌گیری (M). Spca، لقاح؛ MAGs، غدد ضمیمه در نرها؛ سایر قسمت‌های بدن، از جمله سینه‌ها، بال‌ها، پاها، بدن چربی و اندام‌های داخلی در هر دو جنس، و تخمدان‌ها در ماده‌ها. EcK2 به میزان زیادی در MAG و دهلیز گامبیا بیان می‌شود، در حالی که EPP فقط در MAG یافت می‌شود. ج، تجزیه و تحلیل پروتئومیک انتقال گروه انزال نر به دهلیز ماده در 3، 12 و 24 ساعت در دقیقه، که 67 پروتئین فراوان را نشان می‌دهد. ماده‌ها با رژیم غذایی حاوی 15N برای برچسب‌گذاری (و پوشاندن) همه پروتئین‌ها پرورش داده شدند. نرهای بدون برچسب با ماده‌های برچسب‌گذاری شده جفت‌گیری شدند و LRTهای ماده در 3، 12 و 24 ساعت در دقیقه برای تجزیه و تحلیل پروتئومیک تشریح شدند (برای لیست کامل پروتئین‌های انزال به جدول تکمیلی 1 مراجعه کنید). در داخل، EPP، Eck1 و EcK2 در MAG نرهای باکره با تجزیه و تحلیل پروتئومیک این بافت‌ها شناسایی شدند. د، EPP با وسترن بلات در MAG و LRT ماده‌های جفت‌گیری شده شناسایی شد، اما در ماده‌های باکره یا مردان یا بقیه بدن زنان. غشاها به طور همزمان با آنتی‌بادی‌های ضد اکتین (کنترل بارگیری) و ضد EPP بررسی شدند. همه مردان باکره هستند. برای داده‌های منبع ژل به شکل تکمیلی ۱ مراجعه کنید. وسترن بلات دو بار با نتایج مشابه انجام شد.
فعالیت فسفوفسفاتاز اکدی‌استروییدی EPP پس از انکوباسیون با HPLC-MS/MS با 3D20E22P جدا شده از MAG تأیید شد (داده‌های تکمیلی شکل 2a). علاوه بر این، هنگامی که EPP را با تداخل با واسطه RNA (RNAi) خاموش کردیم، کاهش شدیدی در فعالیت فسفاتاز در بافت‌های تولید مثلی این نرها مشاهده کردیم (شکل 3a) و ماده‌هایی که با نرهای خاموش شده با EPP جفت‌گیری کردند، علیرغم خاموشی جزئی ژن، نسبت A کمتری از 3D20E دفسفریله شده (شکل 3b) را نشان دادند (داده‌های تکمیلی شکل 2b، c). در مقابل، ما تغییرات قابل توجهی در نسبت 20E22P/20E در همان پشه‌ها مشاهده نکردیم، که ممکن است نشان دهد که این آنزیم مختص 3D20E22P است (شکل 3b).
الف) کاهش فعالیت فسفاتاز در MAG ناشی از خاموش کردن EPP با استفاده از RNA دو رشته‌ای EPP (dsEPP) یا RNA دو رشته‌ای GFP (dsGFP). در هر تکرار از بیست مخزن MAG استفاده شد (P = 0.0046، آزمون t جفت‌شده، دوطرفه)، که با نقاط جداگانه نشان داده شده‌اند. ب) ماده‌های جفت‌شده با نرهای خاموش‌شده با EPP، نسبت به‌طور قابل‌توجهی پایین‌تری از 3D20E دفسفریله‌شده در 3 ساعت در دقیقه داشتند (P = 0.0043، آزمون t جفت‌نشده، دوطرفه)، در حالی که سطح 20E تحت تأثیر قرار نگرفت (P = 0.063، جفت‌نشده). آزمون t، دوطرفه). داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار از سه گروه ۱۳، ۱۶ و ۱۹ تایی ماده ارائه شده‌اند. ج. ماده‌هایی که با نرهای خاموش‌شده با EPP جفت‌گیری کردند، میزان جفت‌گیری مجدد به‌طور قابل‌توجهی بالاتری داشتند (P = 0.0002، آزمون دقیق فیشر، دوطرفه). ماده‌ها ابتدا مجبور به جفت‌گیری شدند تا از وضعیت جفت‌گیری آنها اطمینان حاصل شود؛ ۲ روز بعد، آنها با سایر پشه‌های نر حامل اسپرم تراریخته تماس گرفته شدند تا میزان جفت‌گیری مجدد با استفاده از تشخیص کمی PCR ژن تراریخته ارزیابی شود. ماده‌های تغذیه‌شده با خون که با پشه‌های نر خاموش‌شده با EPP جفت‌گیری کردند، باروری به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافت (P < 0.0001؛ آزمون من-ویتنی، دوطرفه) و تعداد تخم‌ها اندکی کاهش یافت (P = 0.088، آزمون من-ویتنی، دوطرفه)، در حالی که میزان تخم‌ریزی تحت تأثیر قرار نگرفت (P = 0.94، آزمون دقیق فیشر، دوطرفه). در تمام پنل‌ها، n نشان‌دهنده تعداد نمونه‌های پشه مستقل از نظر بیولوژیکی است. NS، معنی‌دار نیست. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001.
در مرحله بعد، ما ارزیابی کردیم که آیا دفسفوریلاسیون اکدیسون برای القای مقاومت جفت‌گیری در ماده‌ها مهم است یا خیر. نکته قابل توجه این است که ماده‌هایی که با نرهای فاقد EPP جفت‌گیری کردند، در مواجهه با نرهای اضافی (تراریخته) با فراوانی بسیار بالاتری (44.9٪) نسبت به ماده‌های کنترل (10.4٪) دوباره جفت‌گیری کردند (شکل 3c). ما همچنین کاهش قابل توجهی در باروری (شکل 3d، چپ) و کاهش جزئی در تعداد تخم‌های گذاشته شده توسط این ماده‌ها (شکل 3d، وسط) مشاهده کردیم، در حالی که درصد تخم‌های گذاشته شده توسط ماده‌ها (پاسخ دیگری که در ماده‌ها با جفت‌گیری ایجاد می‌شود) تحت تأثیر قرار نگرفت (شکل 3d، راست). با توجه به اختصاصی بودن مشاهده شده EPP برای 3D20E22P، این نتایج نشان می‌دهد که فعال شدن 3D20E توسط EPP منتقل شده در طول جفت‌گیری ممکن است نقش مهمی در خاموش کردن پذیرش ماده برای جفت‌گیری بیشتر داشته باشد، رفتاری که قبلاً به انتقال جنسی 20E نسبت داده می‌شد. بنابراین، این هورمون مخصوص نر نیز به شدت بر باروری زنان تأثیر می‌گذارد.
در مرحله بعد، ما فعالیت‌های 20E و 3D20E را در آزمایش‌های تزریق در باکره‌های بالغ از نظر جنسی با استفاده از 3D20E سنتز شده شیمیایی (شکل 4a-c) و 20E موجود در بازار مقایسه کردیم. مشاهده کردیم که 3D20E در خاموش کردن حساسیت ماده به جفت‌گیری در هر دو غلظت (شکل 4d) به طور قابل توجهی مؤثرتر از 20E بود. نکته قابل توجه این است که نیمی از سطح فیزیولوژیکی 3D20E در LRT (1066 پیکوگرم پس از تزریق در مقابل 2022 پیکوگرم پس از جفت‌گیری) نسبتی از ماده‌های مقاوم را ایجاد کرد که 20 برابر بیشتر از سطح فیزیولوژیکی 20E (361 پیکوگرم پس از تزریق) 24 ساعت پس از تزریق در بالاترین غلظت 18 پیکوگرم پس از جفت‌گیری بود. جدول داده‌های گسترده ۱). این نتیجه با این تصور که انتقال جنسی ۲۰E باعث دوره‌های مقاومت جفت‌گیری نمی‌شود، سازگار است و همچنین به ۳D20E به عنوان یک عامل اصلی در تضمین رابطه والد-فرزندی اشاره می‌کند. ۳D20E همچنین در سنجش‌های تخم‌گذاری در ماده‌های باکره به طور قابل توجهی فعال‌تر از ۲۰E بود (شکل ۴e)، که نشان می‌دهد نرخ تخم‌گذاری طبیعی که ما پس از خاموشی جزئی EPP مشاهده کردیم، به دلیل وجود فعالیت باقیمانده ۳D20E است که هنوز توسط عوامل ماده ناشی از جفت‌گیری تولید می‌شود.
(الف، ب) 3D20E به صورت شیمیایی از 20E (الف) با تبدیل/راندمان بسیار بالا سنتز شده است (داده‌ها به صورت میانگین ± میانگین از سه واکنش سنتز مستقل ارائه شده‌اند) (ب).ج، طیف جرمی (نیمه پایینی) دقیقاً با اکدیسون موجود در LRT ماده جفت‌گیری شده (نیمه بالایی) مطابقت دارد. د، در مقایسه با 20E (0.63 میکروگرم، P = 0.02؛ 0.21 میکروگرم، P < 0.0001؛ آزمون دقیق فیشر، دو طرفه) و 10٪ اتانول (0.63 میکروگرم، P < 0.0001؛ 0.21 میکروگرم، P < 0.0001؛ آزمون دقیق فیشر، دو طرفه)، در حالی که 20E فقط در دوزهای بالاتر (0.63 میکروگرم، P = 0.0002؛ 0.21 میکروگرم، P = 0.54؛ آزمون دقیق فیشر) به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل بود. آزمایش، دو طرفه).e، تزریق 3D20E میزان تخم‌ریزی به طور قابل توجهی بالاتری را در ماده‌های باکره نسبت به گروه کنترل اتانول 10٪ ایجاد کرد (0.21 میکروگرم، P < 0.0001؛ 0.13 میکروگرم، P = 0.0003؛ آزمایش دقیق فیشر، دو طرفه)، در حالی که 20E در مقایسه با گروه کنترل فقط در دوزهای بالاتر (0.21 میکروگرم، P = 0.022؛ 0.13 میکروگرم، P = 0.0823؛ آزمایش دقیق فیشر، دو طرفه). 3D20E میزان تخم‌ریزی به طور قابل توجهی بالاتری را نسبت به 20E در دوزهای بالاتر ایجاد کرد (0.21 میکروگرم، P = 0.0019؛ 0.13 میکروگرم، P = 0.075؛ آزمایش دقیق فیشر، دو طرفه). در تمام پانل‌ها، n نشان دهنده تعداد نمونه‌های پشه مستقل از نظر بیولوژیکی است. NS، معنی‌دار نیست.*P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001. داده‌ها از سه تکرار حاصل شده‌اند.
در مطالعات قبلی، ما مشخص کردیم که انتقال جنسی هورمون‌های استروئیدی باعث بیان MISO (محرک تخمک‌گذاری ناشی از جفت‌گیری ۱۱)، یک ژن تولید مثلی ماده که از ماده‌های A. gambiae در برابر عفونت P. falciparum محافظت می‌کند، می‌شود. هزینه‌های بهداشتی ناشی از ۱۳، کشنده‌ترین انگل مالاریای انسانی. با توجه به اهمیت MISO برای تناسب اندام تولید مثلی آنوفل‌ها در مناطق بومی مالاریا، تصمیم گرفتیم مشخص کنیم که کدام هورمون ۳D20E یا ۲۰E بیان این ژن را تحریک می‌کند. ما دریافتیم که در حالی که تزریق ۲۰E به طور خاص یا قوی‌تر برخی از گیرنده‌های هورمون هسته‌ای (HR)، مانند HR3 و HR4، و اهداف استروئیدی پایین‌دست معمولی، مانند ژن‌های زرده‌ساز Vg14، ۱۵، ۱۶ را القا می‌کند، MISO به طور قوی‌تری توسط ۳D20E القا می‌شود (داده‌های گسترده شکل ۳). بنابراین، به نظر می‌رسد انتقال جنسی این هورمون استروئیدی آندروژنی مکانیسم‌هایی را القا می‌کند که ماده‌ها را از هزینه‌های ناشی از عفونت انگلی محافظت می‌کند. علاوه بر این، 3D20E به طور متفاوتی بر هر دو ایزوفرم گیرنده EcR تأثیر می‌گذارد، EcR-A را القا و EcR-B را سرکوب می‌کند و به طور قوی‌تری سایر ژن‌های القاکننده جفت‌گیری، از جمله HPX15 را که بر باروری ماده تأثیر می‌گذارد، تحریک می‌کند. این می‌تواند ناباروری قابل توجه مشاهده شده در ماده‌های جفت‌گیری شده با نرهای خاموش شده توسط EPP را توضیح دهد (داده‌های تکمیلی شکل 3). این داده‌ها نشان‌دهنده وجود مسیرهای پایین‌دستی است که ترجیحاً توسط دو هورمون اکدیسون فعال می‌شوند و ممکن است زمینه‌ساز عملکرد خاص جنسی باشند.
در مرحله بعد، ما عملکرد دو ژن EcK شناسایی شده در خط لوله بیوانفورماتیک خود را آزمایش کردیم. خاموش کردن EcK1 یا EcK2 منجر به مرگ و میر قابل توجهی در نرها شد (داده‌های تکمیلی شکل 4a)، که نشان می‌دهد فسفوریلاسیون اکدیسون و در نتیجه غیرفعال شدن، برای بقا مهم است. از آنجا که EcK2 در سطوح بالاتری نسبت به EcK1 بیان شد و توسط پروتئومیکس در MAGها شناسایی شد (شکل 2b، c و جدول تکمیلی 2)، ما فعالیت اکدیستروئید کیناز آن را با انکوباسیون آن با 20E تأیید کردیم که منجر به فسفوریلاسیون 20E22P شد (داده‌های تکمیلی شکل 2).4b). هنگام استفاده از 3D20E به عنوان سوبسترا، ما قادر به تشخیص محصول فسفریله شده 3D20E22P نبودیم (داده‌های تکمیلی شکل 4c)، که نشان می‌دهد 20E به جای 3D20E ممکن است هدف ترجیحی EcK2 باشد.
طبق تجزیه و تحلیل RNA-seq ما، EcK2 همچنین در LRT ماده‌های باکره به میزان زیادی بیان می‌شد، جایی که پس از جفت‌گیری خاموش می‌شد (شکل 2b). ما این داده‌ها را تأیید کردیم و مشخص کردیم که بیان EcK2 تحت تأثیر خونخواری قرار نمی‌گیرد (داده‌های تکمیلی شکل 5a). با گسترش آزمایش‌های اولیه MS خود، مشخص کردیم که اوج 20E22P ارتباط نزدیکی با اوج 20E (22-26 ساعت پس از خونخواری؛ داده های تکمیلی شکل 5b) دارد. خاموش شدن EcK2 در ماده‌های باکره منجر به افزایش 3 برابری نسبت نسبی 20E به 20E22P در 26 ساعت پس از خونخواری شد (شکل‌های داده تکمیلی 2c و 5c)، که تأیید می‌کند EcK2 همچنین 20E را در ماده‌ها فسفریله می‌کند. نکته قابل توجه این است که باکره‌های فاقد EcK2، پذیرش جنسی کامل را حفظ کردند (داده‌های تکمیلی شکل 5d، e)، که بیشتر نشان می‌دهد که تولید 20E در ماده‌ها دوره‌های مقاومت به جفت‌گیری را القا می‌کنند. با این حال، این ماده‌ها در مقایسه با گروه کنترل، میزان تخم‌گذاری را به طور قابل توجهی افزایش دادند، به طوری که بیش از 30٪ از باکره‌ها تخم می‌گذارند (داده‌های تکمیلی شکل 5f). اگر تزریق RNA دو رشته‌ای Eck2 (dsEcK2) پس از خونخواری انجام می‌شد، تخم‌ریزی رخ نمی‌داد، که در آن نقطه اوج 20E به دلیل بلع خون کاهش یافته بود. به طور کلی، این نتایج از مدلی پشتیبانی می‌کنند که 20E تولید شده پس از مکیدن خون می‌تواند باعث تخم‌ریزی شود، اما تنها زمانی که بلوک تخم‌ریزی (EcK2 و احتمالاً سایر عوامل) توسط جفت‌گیری خاموش شود. نه تزریق 20E و نه 3D20E بیان EcK2 را در باکره‌ها مهار نکردند (داده‌های تکمیلی شکل 5g)، که نشان می‌دهد عوامل دیگری واسطه مهار این کیناز هستند. با این حال، سطح 20E پس از خونخواری برای القای ناراحتی در جفت‌گیری کافی نبود، اما به طور مؤثر توسط تیترهای بالای 3D20E منتقل شده از طریق رابطه جنسی ایجاد شد.
نتایج ما بینش‌های مهمی در مورد مکانیسم‌های تنظیم موفقیت تولید مثلی A. gambiae ارائه می‌دهد. مدلی پدیدار شده است که در آن نرها برای سنتز تیترهای بالای 3D20E، یک اکدیسون اصلاح‌شده مخصوص نر که با بی‌حس کردن ماده‌ها به جفت‌گیری بیشتر، نسب را تضمین می‌کند، تکامل یافته‌اند. در عین حال، این ناقل‌های مالاریا همچنین یک سیستم کارآمد برای فعال کردن 3D20E در ماده‌ها در پاسخ به انتقال جنسی EPP مخصوص نر، ​​تکامل یافته‌اند. تا آنجا که ما می‌دانیم، این اولین نمونه از یک سیستم هورمون استروئیدی تحت سلطه نر و ماده است که عملکردی منحصر به فرد و حیاتی را در حشرات انجام می‌دهد. عملکرد اکدیسون مخصوص نر فرض شده است اما به طور قطعی اثبات نشده است. به عنوان مثال، یک فرضیه تا حد زیادی رد شده 18 این است که این عملکردها ممکن است توسط پیش‌ساز 20E E1 انجام شود. به خوبی شناخته شده است که در دروزوفیلا، تک شوهری با انتقال جنسی پپتیدهای جنسی کوچک 19،20 که با نورون‌های عصب‌دهنده دستگاه تولید مثل ماده از طریق پپتید جنسی خاص تعامل دارند، آغاز می‌شود. گیرنده‌ها۲۱،۲۲. برای تعیین آبشارهای سیگنالینگ پایین‌دست که توسط 3D20E در ماده‌های A. gambiae کنترل می‌شوند و تعیین اینکه آیا این آبشارها می‌توانند بین پشه‌ها و دروزوفیلا حفظ شوند، کار بیشتری لازم است.
با توجه به نقش مهم 3D20E بر باروری و رفتار ماده که در مطالعه ما شناسایی شده است، مسیرهایی که منجر به سنتز و فعال‌سازی 3D20E می‌شوند، فرصت‌های جدیدی را برای استراتژی‌های کنترل پشه در آینده، مانند تولید نرهای عقیم رقابتی در استراتژی‌های فناوری حشرات عقیم، برای آزادسازی در طبیعت یا تقلید از 3D20E در بازی باکره، ارائه می‌دهند. عملکرد اختصاصی نر 3D20E ممکن است زمانی تکامل یافته باشد که A. gambiae و سایر گونه‌های Cellia توانایی انعقاد مایع منی خود را به صورت شاخه‌های جفت‌گیری به دست آوردند، زیرا این امر امکان انتقال کارآمد تعداد زیادی هورمون و آنزیم‌های فعال‌کننده هورمون را فراهم می‌کند. به نوبه خود، تکامل 3D20E با اجرای تک‌شوهری، مکانیسمی را برای ماده‌ها (از طریق بیان بالای MISO) فراهم می‌کند تا تناسب اندام تولید مثلی خود را در مناطقی با شیوع بالای مالاریا بهبود بخشند، که به طور غیرمستقیم به انتقال پلاسمودیوم کمک می‌کند. با توجه به اینکه نشان داده شده است که 20E ماده تأثیرات عمیقی بر بقا و رشد P. falciparum در پشه‌های آنوفل ماده دارد،24 مسیرهای هورمون استروئیدی نر و ماده اکنون جنبه‌های کلیدی پشه-انگل هستند. تعاملات
سویه‌های A. gambiae G3 تحت شرایط استاندارد حشرات (دمای 26-28 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 65-80٪، دوره نوری 12:12 ساعت روشنایی/تاریکی) پرورش داده شدند. لاروها با غذای پودری ماهی (TetraMin Tropical Flakes، Koi Pellets و Tetra Pond Sticks با نسبت 7:7:2) تغذیه شدند. پشه‌های بالغ به طور آزاد با محلول دکستروز 10٪ و خون انسان (اجزای خون مورد مطالعه) به صورت هفتگی تغذیه شدند. پشه‌های باکره با جداسازی جنس‌ها در مرحله شفیرگی پس از بررسی انتهای بدن با میکروسکوپ به دست آمدند. نرهای حامل ترانسژن DsRed قبلاً شرح داده شده‌اند.
آزمایش‌های جفت‌گیری اجباری طبق پروتکل‌های قبلاً شرح داده شده انجام شد. برای جفت‌گیری طبیعی، ماده‌های باکره ۴ روزه به مدت دو شب با نسبت ۱:۳ با نرهای باکره بالغ از نظر جنسی نگهداری شدند. برای آزمایش‌هایی که در آن‌ها به نرها dsEPP تزریق شد، نگهداری همزمان در قفس با روزهای ۳-۴ پس از تزریق همزمان شد، زمانی که فعالیت فسفاتاز به حداکثر میزان خود رسید (داده‌های تکمیلی شکل ۲b).
بافت‌های پشه، اجساد باقی‌مانده (بقیه بدن) یا کل بدن در متانول ۱۰۰٪ تشریح و با دستگاه همگن‌ساز (دانه‌های شیشه‌ای ۲ میلی‌متری، ۲۴۰۰ دور در دقیقه، ۹۰ ثانیه) همگن شدند. مقدار بافت و حجم متانول به شرح زیر بود: بقیه بدن، ۵۰ در ۱۰۰۰ میکرولیتر؛ MAG، ۵۰-۱۰۰ در ۸۰ میکرولیتر؛ LRT ماده، ۲۵-۵۰ در ۸۰ میکرولیتر. رسوب تحت استخراج متانول دوم با همان حجم متانول قرار گرفت. بقایای سلولی با سانتریفیوژ حذف شد. متانول حاصل از هر دو استخراج با هم ترکیب و تحت جریان نیتروژن خشک شد، سپس در حجم‌های زیر از متانول ۸۰٪ در آب دوباره به حالت تعلیق درآمد: بقیه بدن، ۵۰ میکرولیتر؛ MAGها و LRT ماده، ۳۰ میکرولیتر.
نمونه‌ها با استفاده از طیف‌سنج جرمی (ID-X، Thermo Fisher) متصل به دستگاه LC (Vanquish، Thermo Fisher) آنالیز شدند. 5 میکرولیتر از نمونه به ستون 3 میکرومتری، 100 × 4.6 میلی‌متری (Inspire C8، Dikma) که در دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شد، تزریق شد. فازهای متحرک برای LC، A (آب، 0.1٪ اسید فرمیک) و B (استونیتریل، 0.1٪ اسید فرمیک) بودند. شیب LC به شرح زیر بود: 5٪ B به مدت 1 دقیقه، سپس در طول 11 دقیقه به 100٪ B افزایش یافت. پس از 8 دقیقه در 100٪، ستون را به مدت 4 دقیقه در 5٪ B دوباره به تعادل برسانید. سرعت جریان 0.3 میلی‌لیتر در دقیقه بود. یونیزاسیون در منبع MS با یونیزاسیون الکترواسپری گرم شده در حالت‌های مثبت و منفی انجام می‌شود.
طیف‌سنج جرمی داده‌ها را در محدوده m/z از 350 تا 680 با وضوح 60000 در حالت کامل MS اندازه‌گیری می‌کند. داده‌های MS/MS روی [M + H]+ (همه اهداف)، [M - H2O + H]+ (همه اهداف) و [M - H]- (اهداف فسفریله شده) به دست آمد. از داده‌های MS/MS برای تأیید خواص اکدیسون اهدافی که هیچ استانداردی برای آنها در دسترس نبود، استفاده شد. برای شناسایی اکدیاستروئیدهای غیر هدفمند، داده‌های MS/MS برای همه پیک‌های HPLC با فراوانی نسبی >15٪ تجزیه و تحلیل شدند. با استفاده از منحنی‌های استاندارد ایجاد شده از استانداردهای خالص (20E، 3D20E) برای محاسبه مقادیر مطلق یا رقت‌های یک نمونه خاص (همه اهداف دیگر) برای محاسبه معادل آنها با مقادیر یافت شده در یک نر، کمیت‌سنجی انجام شد. برای 3D20E، کمیت‌سنجی با استفاده از مجموع ترکیبات افزایشی زیر انجام شد: [M + TFA]-، [M + COOH]-، [M + Na]+، [M + Cl]-، [M + NO3]-. داده‌ها استخراج و با استفاده از Tracefinder (نسخه 4.1) تعیین مقدار شدند. داده‌های MS/MS با استفاده از Xcalibur (نسخه 4.4) تجزیه و تحلیل شدند. طیف‌های MS مربوط به E، 20E و 3D20E با استانداردهای مربوطه مقایسه شدند. 3D20E22P با مشتق‌سازی با معرف Girard تجزیه و تحلیل شد. 20E22P با نسبت m/z تجزیه و تحلیل شد.
3D20E22P از MAG خالص‌سازی شد. خالص‌سازی در مقیاس تحلیلی با استفاده از یک کروماتوگراف مایع با کارایی بالا (Acquity، Waters) با یک آشکارساز جرمی چهارقطبی (QDa، Acquity، Waters) تحت شرایط LC مشابه آنالیز HPLC-MS/MS انجام شد. جمع‌آوری کسر زمانی آغاز شد که m/z مربوط به 3D20E22P در همان زمان بازداری که قبلاً تعیین شده بود، شناسایی شد. سپس خلوص ترکیبات استخراج شده توسط HPLC-MS/MS همانطور که در بالا توضیح داده شد، بررسی شد.
RNA کل از 10 تا 12 بافت تولید مثلی یا سایر قسمت‌های بدن (بدون سر) با استفاده از معرف TRI (Thermo Fisher) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. RNA با TURBO DNase (Thermo Fisher) تیمار شد. cDNA با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس ویروس لوسمی موشی مولونی (M-MLV RT؛ Thermo Fisher) طبق دستورالعمل سازنده سنتز شد. پرایمرهای مربوط به PCR کمی رونویسی معکوس (RT-qPCR؛ جدول داده‌های گسترده 2) قبلاً منتشر شده24 یا با استفاده از Primer-BLAST26 طراحی شده‌اند، با اولویت محصولاتی با اندازه 70 تا 150 جفت باز و اتصالات اگزون-اگزون یا پرایمرهای جفت پرایمر، اگزون‌ها را از هم جدا می‌کنند. نمونه‌های cDNA از سه تا چهار تکرار بیولوژیکی برای RT-qPCR چهار برابر در آب رقیق شدند. تعیین کمیت در واکنش‌های تکرار 15 میکرولیتری حاوی 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher)، پرایمرها و 5 میکرولیتر cDNA رقیق شده انجام شد. واکنش‌ها بر روی سیستم PCR زمان واقعی QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) اجرا شدند و داده‌ها با استفاده از Design and Analysis (نسخه 2.4.3) جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل شدند. همانطور که در این مطالعه نشان داده شد، مقادیر نسبی نسبت به ژن ریبوزومی RpL19 (AGAP004422) نرمال‌سازی شدند، که بیان آن با تغذیه از خون 27 یا جفت‌گیری 3 تغییر معنی‌داری نکرد.
کیفیت RNA با استفاده از یک دستگاه بیوآنالیزر Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent) بررسی شد. کتابخانه‌های جفت‌شده Illumina در موسسه Broad MIT و هاروارد تهیه و اجرا شدند. توالی‌یابی با استفاده از HISAT2 (نسخه 2.0.5) با پارامترهای پیش‌فرض، با ژنوم A. gambiae (سویه PEST، نسخه 4.12) هم‌تراز شد. توالی‌یابی‌هایی که امتیاز کیفیت نقشه‌برداری (MAPQ) آنها کمتر از 30 بود، با استفاده از Samtools (نسخه 1.3.1) حذف شدند. تعداد توالی‌یابی‌های نقشه‌برداری‌شده به ژن‌ها با استفاده از htseq-count (نسخه 0.9.1) با پارامترهای پیش‌فرض شمارش شد. تعداد توالی‌یابی‌های نرمال‌شده محاسبه و بیان افتراقی ژن با استفاده از بسته DESeq2 (نسخه 1.28.1) در R (نسخه 4.0.3) تجزیه و تحلیل شد.
کاندیداهای ژن اصلاح‌کننده اکدیسون ابتدا با جستجوی ژنوم A. gambiae با استفاده از الگوریتم PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) و با استفاده از مقادیر پیش‌فرض پارامترها با توالی‌های پروتئینی پرس‌وجوی زیر شناسایی شدند: از Bombyx mori (شماره دسترسی NP_001038956.1)، Musca domestica (شماره دسترسی XP_005182020.1، XP_005175332.1 و XP_011294434.1) و Microplitis demolitor (شماره دسترسی XP_008552646.1 و XP_008552645.1) EcK از B. mori (شماره دسترسی NP_001036900)، Drosophila melanogaster (شماره دسترسی... NP_651202)، Apis mellifera (شماره دسترسی XP_394838) و Acyrthosiphon pisum (شماره دسترسی XP_001947166)؛ و EPP از B. mori (شماره دسترسی XP_001947166) NP_001177919.1 و NP_001243996.1) و EO از D. melanogaster (شماره دسترسی NP_572986.1) (مرحله 1). در مرحله بعد، فیلتر کردن نتایج بر اساس بیان بالای mRNA (بیش از 100 قطعه/کیلوباز اگزون در هر میلیون خوانش نقشه‌برداری شده (FPKM) یا بیش از 85٪) در بافت تولید مثلی (LRT یا MAG ماده) در گامبیا (مرحله 2). برای بهبود اختصاصیت، آنزیم‌های کاندیدی را انتخاب کردیم که در بافت تولیدمثلی A. albimanus، گونه‌ای از آنوفل که در طول جفت‌گیری اکدیسون را سنتز یا منتقل نمی‌کند، نیز بیان می‌شوند. ژن‌های کاندید بر اساس بیان کم (<100 FPKM یا <85th percentile) در بافت تولیدمثلی A. albimanus فیلتر شدند (مرحله 3). به عنوان فیلتر نهایی (مرحله 4)، ژن‌های کاندید باید حداقل یکی از موارد زیر را برآورده کنند: (1) طبق تجزیه و تحلیل ژن‌های با بیان متفاوت، پس از جفت‌گیری به طور قابل توجهی افزایش بیان داشته باشند (P < 0.05) و (2) در بافت‌های غیرتولیدمثلی (<85٪ یا <100 FPKM).
ما روش‌های قبلاً شرح داده شده ۲۸، ۲۹، ۳۰ را برای دستیابی به برچسب‌گذاری ایزوتوپی کل ارگانیسم اصلاح کردیم. به طور خلاصه، ساکارومایسس سرویزیه نوع II وحشی (YSC2، سیگما) در محیط کشت پایه نیتروژن مخمر (BD Difco، DF0335) حاوی (وزنی/حجمی) ۲٪ گلوکز (G7528، سیگما)، ۱.۷٪ محیط کشت بدون اسید آمینه و سولفات آمونیوم) و ۵٪ سولفات آمونیوم ۱۵N (NLM-713، >۹۹٪، آزمایشگاه‌های ایزوتوپ کمبریج) به عنوان تنها منبع نیتروژن آزمایش شد. مخمر با سانتریفیوژ بازیابی شد و لاروهای پشه تا زمان شفیرگی به طور آزاد تغذیه شدند. برای جلوگیری از مرگ و میر سن چهارم، پودر ماهی (۰.۵ میلی‌گرم در هر ۳۰۰ لارو) به آنها اضافه شد. سپس فقط ماده‌ها در آزمایش‌های جفت‌گیری با نرهای بدون برچسب برای تجزیه و تحلیل پروتئوم نر منتقل شده در طول جفت‌گیری استفاده شدند.
ماده‌های باکره‌ی 4 تا 6 روزه که با 15N برچسب‌گذاری شده بودند، مجبور به جفت‌گیری با نرهای باکره‌ی بدون برچسب و هم‌سن خود شدند. جفت‌گیری موفقیت‌آمیز با تشخیص شاخه‌های جفت‌گیری زیر میکروسکوپ اپی‌فلورسانس تأیید شد. در ساعت‌های 3، 12 و 24 ساعت در دقیقه، دهلیزهای 45 تا 55 ماده‌ی جفت‌گیری شده در 50 میکرولیتر بافر بی‌کربنات آمونیوم (pH 7.8) تشریح و با هاون همگن شدند. همگنات سانتریفیوژ شد و محلول رویی با 50 میکرولیتر 0.1٪ RapiGest (186001860، Waters) در 50 میلی‌مولار بی‌کربنات آمونیوم مخلوط شد. محلول رویی و رسوب هر نمونه روی یخ خشک منجمد شده و یک شب به آزمایشگاه MacCoss در دانشگاه واشنگتن ارسال شد، جایی که آماده‌سازی نمونه برای LC-MS/MS تکمیل شد. رسوب را در 50 میکرولیتر 0.1٪ RapiGest دوباره به حالت تعلیق درآورید. در 50 میلی‌مولار بی‌کربنات آمونیوم و سونیکات در حمام آب. غلظت پروتئین رسوب و محلول رویی با استفاده از روش سنجش BCA اندازه‌گیری شد، نمونه‌ها با 5 میلی‌مولار دی‌تیوتریتول (DTT؛ سیگما) کاهش داده شدند، با 15 میلی‌مولار یدواستامید (سیگما) آلکیله شدند و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد (1:0.50) با نسبت تریپسینیزاسیون: تریپسین: سوبسترا انکوبه شدند. RapiGest با افزودن 200 میلی‌مولار HCl لیز شد و سپس به مدت 45 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد تا بقایای مواد از بین برود. نمونه‌ها با استخراج فاز جامد دو حالته (کارتریج‌های Oasis MCX، واترز) شسته شدند و در اسید فرمیک 0.1٪ برای غلظت نهایی پروتئین 0.33 میکروگرم دوباره به حالت تعلیق درآمدند. µl-1. پروتئوم‌های MAG بدون برچسب به طور مشابه از نرهای باکره مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای هر نمونه دو تکرار تحلیلی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سپس، 1 میکروگرم از هر کدام با استفاده از یک ستون 75 میکرومتری سیلیس ذوب شده 25 سانتی‌متری با یک تله فریت سیلیس ذوب شده 4 سانتی‌متری Kasil1 (PQ) پر شده با رزین فاز معکوس Jupiter C12 (Phenomenex) و کروماتوگرافی مایع 180 دقیقه‌ای تجزیه و تحلیل شد. هضم نمونه - MS/MS بر روی طیف‌سنج جرمی Q-Exactive HF (Thermo Fisher) با سیستم nanoACQUITY UPLC (Waters) اجرا شد. داده‌های مربوط به اکتساب داده‌ها که برای هر اجرا تولید شده بودند، با استفاده از Proteowizard (نسخه 3.0.20287) و با استفاده از Comet31 (نسخه 3.2) در برابر پایگاه داده FASTA حاوی توالی‌های پروتئینی از Anopheles gambiae (VectorBase نسخه 54)، Anopheles coluzzi به فرمت mzML تبدیل شدند. جستجو بر روی Mali-NIH (VectorBase نسخه 54)، Saccharomyces cerevisiae (Uniprot، مارس 2021)، A. gambiae RNA-seq و ترجمه‌های سه فریمی از آلاینده‌های شناخته شده انسانی انجام شد. FDR های منطبق با نقشه پپتید با استفاده از Percolator32 (نسخه 3.05) با آستانه 0.01 تعیین شدند و پپتیدها با استفاده از صرفه‌جویی در پروتئین در Limelight33 به شناسایی پروتئین‌ها مونتاژ شدند. (نسخه 2.2.0). فراوانی نسبی پروتئین با استفاده از ضریب فراوانی طیفی نرمال‌شده (NSAF) که برای هر پروتئین در هر اجرا محاسبه شده بود، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تخمین زده شد. NSAF نسبت به هر پروتئین در نمونه‌های دو تکرار بیولوژیکی مختلف میانگین‌گیری شد. برچسب‌گذاری 15N با موفقیت پروتئوم ماده را پوشاند، اگرچه مقدار کمی پروتئین بدون برچسب را می‌توان از باکره‌های برچسب‌گذاری شده تشخیص داد. ما تشخیص کاهش پروتئین نر (1-5 طیف) را در نمونه‌های خام ماده فقط در اجراهای فنی ثبت کردیم، جایی که نمونه‌های خام پس از نمونه‌های نر/جفت‌گیری، در نتیجه "انتقال" HPLC، انجام شدند. پروتئین‌های گاه به گاه یافت شده به عنوان "آلاینده" از باکره‌های برچسب‌گذاری شده در جدول تکمیلی 1 فهرست شده‌اند.
دو پپتید آنتی‌ژنیک، QTTDRVAPAPDQQQ (درون ایزوتایپ PA) و MESDGTTPSGDSEQ (درون ایزوتایپ PA و PB) در Genscript. این دو پپتید با هم ترکیب شدند، سپس به پروتئین حامل KLH متصل شده و به خرگوش‌های نیوزیلندی تزریق شدند. خرگوش‌ها پس از تزریق چهارم قربانی شدند و IgG کل با خالص‌سازی میل ترکیبی جدا شد. IgG از خرگوشی که بیشترین اختصاصیت را برای EPP داشت، برای وسترن بلات بیشتر استفاده شد.
برای وسترن بلات، MAG (n = 10، که n نشان دهنده تعداد نمونه‌های پشه از نظر بیولوژیکی مستقل است) و LRT ماده (n = 30) از نرهای باکره 4 روزه و ماده‌های باکره یا جفت‌گیری اجباری (<10 پس از جفت‌گیری)، بافر استخراج پروتئین (50 میلی‌مولار Tris، pH 8.0؛ 1٪ NP-40؛ 0.25٪ سدیم دئوکسی کولات؛ 150 میلی‌مولار NaCl؛ 1 میلی‌مولار EDTA؛ 1 × کوکتل مهارکننده پروتئاز (Roche)) به طور جداگانه اضافه شد. نمونه‌ها بلافاصله پس از تشریح با یک مهره‌زن (مهره‌های شیشه‌ای 2 میلی‌متری، 2400 دور در دقیقه، 90 ثانیه) همگن شدند. بقایای نامحلول با سانتریفیوژ در 20000 گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد حذف شدند. پروتئین‌ها با روش برادفورد (Bio-Rad) تعیین مقدار شدند. سپس، 20 میکروگرم پروتئین MAG، 40 میکروگرم پروتئین LRT و 20 میکروگرم از پروتئین فله باقیمانده دناتوره شده و با استفاده از بافر MOPS توسط 10٪ Bis-Tris NuPAGE جدا شدند. پروتئین‌ها با استفاده از سیستم انتقال iBlot2 (Thermo Fisher) به غشاهای پلی‌وینیلیدین فلوراید منتقل شدند. غشاها دو بار در 1 × PBS-T (0.1٪ Tween-20 در PBS) شسته شدند و سپس به مدت 1 ساعت در بافر مسدودکننده Odyssey (Li-Cor) در دمای 22 درجه سانتیگراد مسدود شدند. غشاها یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی‌بادی اولیه پلی‌کلونال خرگوشی سفارشی ضد EPP (1:700 در بافر مسدودکننده) و آنتی‌بادی اولیه مونوکلونال موشی ضد اکتین MAC237 (Abeam; 1:4000) تکان داده شدند. غشاها با PBS-T شسته شده و سپس با آنتی‌بادی‌های ثانویه (donkey anti-rabbit 800CW و goat anti-rat 680LT (Li-Cor)، هر دو 1:20000) در بافر مسدودکننده انکوبه شدند. حاوی 0.01% SDS و 0.2% Tween-20 به مدت 1 ساعت در دمای 22 درجه سانتیگراد. غشاها با PBS-T شسته شده و با اسکنر Odyssey CLx تصویربرداری شدند. تصاویر در Image Studio (نسخه 5.2) جمع آوری و پردازش شدند. باند خاصی مربوط به ایزوفرم EPP-RA (82 کیلو دالتون) شناسایی نشد.
نواحی کدکننده EPP (به صورت ایزوفرم AGAP002463-RB حاوی دامنه هیستیدین فسفاتاز، جستجوی دامنه حفاظت‌شده NCBI 34) و EcK2 (AGAP002181) در پلاسمید pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) کلون شدند. آغازگرها در جدول داده‌های گسترده ۲ فهرست شده‌اند. هشت پیوند دهنده GS4 (به صورت پشت سر هم) قبل از برچسب 6xHis انتهای C از ساختار pET-21a(+)-EcK2 قرار داده شدند. پروتئین‌های نوترکیب با استفاده از واکنش سنتز پروتئین E. coli بدون سلول NEBExpress (New England BioLabs) تولید شدند. پروتئین‌های نوترکیب با استفاده از ستون‌های اسپین NEBExpress Ni (New England BioLabs) خالص‌سازی شدند. پروتئین کنترل دی هیدروفولات ردوکتاز (DHFR) با استفاده از الگوی DNA از کیت سنتز پروتئین E. coli بدون سلول NEBExpress تولید شد. پروتئین‌ها در 50٪ گلیسرول در PBS در دمای -20 درجه سانتیگراد تا 3 ماه نگهداری شدند.
فعالیت فسفاتاز EPP و عصاره‌های بافتی با استفاده از 4-نیتروفنیل فسفات (pNPP؛ سیگما-آلدریچ) اندازه‌گیری شد. بافر واکنش حاوی 25 میلی‌مولار تریس، 50 میلی‌مولار اسید استیک، 25 میلی‌مولار بیس-تریس، 150 میلی‌مولار NaCl، 0.1 میلی‌مولار EDTA و 1 میلی‌مولار DTT بود. بافت در بافر واکنش همگن شد و بقایای سلولی با سانتریفیوژ حذف شد. واکنش را با اضافه کردن آنزیم یا عصاره بافتی به بافر واکنش حاوی 2.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر-1 pNPP آغاز کنید. مخلوط واکنش در دمای اتاق و تاریکی انکوبه شد و مقدار pNP تبدیل شده از pNPP با اندازه‌گیری جذب در طول موج 405 نانومتر در زمان‌های مختلف تعیین شد.
برای فعالیت EcK در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، پروتئین با 0.2 میلی‌گرم 20E یا 3D20E در 200 میکرولیتر بافر (pH 7.5) حاوی 10 میلی‌مولار HEPES–NaOH، 0.1٪ BSA، 2 میلی‌مولار ATP و 10 میلی‌مولار MgCl2 به مدت 2 ساعت در دمای 27 درجه سانتیگراد انکوبه شد. واکنش با اضافه کردن 800 میکرولیتر متانول متوقف شد، سپس به مدت 1 ساعت در دمای 20- درجه سانتیگراد خنک شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 20000 گرم سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی با HPLC-MS/MS تجزیه و تحلیل شد. برای غیرفعال کردن حرارتی پروتئین‌های مورد استفاده در گروه کنترل، پروتئین‌ها به مدت 20 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد در 50٪ گلیسرول در PBS انکوبه شدند.
برای فعالیت EPP در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، پروتئین با 3D20E22P (معادل مقدار موجود در 18 جفت MAG، خالص‌سازی شده با HPLC-MS/MS) در 100 میکرولیتر بافر (pH 7.5) حاوی 25 میلی‌مولار Tris، 50 میلی‌مولار اسید استیک، 25 میلی‌مولار Bis-Tris، 150 میلی‌مولار NaCl، 0.1 میلی‌مولار EDTA و 1 میلی‌مولار DTT به مدت 3 ساعت در دمای 27 درجه سانتیگراد انکوبه شد. واکنش با اضافه کردن 400 میکرولیتر متانول متوقف شد و به مدت 1 ساعت در دمای 20- درجه سانتیگراد خنک شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 20000 گرم سانتریفیوژ شد. محلول رویی با HPLC-MS/MS آنالیز شد.
قطعات PCR برای EPP (362 جفت باز)، EcK1 (AGAP004574، 365 جفت باز) و EcK2 (556 جفت باز) از cDNA تهیه شده از اجساد پشه‌های بدون سر با جنس‌های مختلط تکثیر شدند. قطعه PCR مربوط به کنترل eGFP (495 جفت باز) از pCR2.1-eGFP که قبلاً توضیح داده شده بود، تکثیر شد؛ آغازگرهای PCR در جدول داده‌های گسترده ۲ فهرست شده‌اند. قطعه PCR بین پروموترهای معکوس T7 روی پلاسمید pL4440 قرار داده شد. سازه‌های پلاسمیدی از E. coli مستعد NEB 5-α (New England Biolabs) بازیابی و قبل از استفاده با تعیین توالی DNA تأیید شدند (برای توالی درج به داده‌های تکمیلی ۱ مراجعه کنید). آغازگرهای منطبق با پروموتر T7 (جدول داده‌های گسترده ۲) برای تکثیر قطعه درج شده از پلاسمید مبتنی بر pL4440 استفاده شدند. اندازه محصول PCR با الکتروفورز ژل آگارز تأیید شد. dsRNA با استفاده از کیت رونویسی Megascript T7 (Thermo Fisher) از الگوهای PCR رونویسی و طبق دستورالعمل سازنده با تغییراتی که قبلاً توضیح داده شده بود، خالص‌سازی شد.
برای تزریق dsRNA، 1380 نانوگرم از dsRNA (dsGFP، dsEcK1، dsEcK2، dsEPP) با غلظت 10 نانوگرم در لیتر به داخل قفسه سینه نرها یا ماده‌های بالغ (Nanoject III، Drummond) ظرف 1 روز پس از خروج از رحم تزریق شد. سطوح مهار ژن در حداقل سه تکرار بیولوژیکی با استخراج RNA، سنتز cDNA و RT-qPCR تعیین شد. برای تزریق اکدیسون، به ماده‌های باکره 4 روزه یا باکره 6 روزه که از خون تغذیه شده بودند، 0.13، 0.21 یا 0.63 میکروگرم از 20E یا 3D20E (Nanoject III، Drummond) به ترتیب با غلظت‌های 1.3، 2.1، بسته به طرح آزمایش یا 6.3 نانوگرم در لیتر تزریق شد. 100 نانوگرم 10٪ (حجم/حجم) اتانول تزریق کنید. در آب؛ ۱۰۰ نانولیتر از 3D20E22P در ۱۰٪ اتانول (معادل ۷۵٪ مقدار موجود در یک جفت MAG). پشه‌ها به طور تصادفی به گروه تزریق اختصاص داده شدند.
برای سنجش تخم‌ریزی، پشه‌های ماده ۳ روزه به طور آزاد با خون انسان تغذیه شدند. پشه‌های نیمه‌خورده یا گرسنه را حذف کنید. بسته به نوع درمان، پشه‌های ماده حداقل ۴۸ ساعت پس از خون‌خواری به مدت چهار شب در فنجان‌های تخم‌ریزی جداگانه قرار داده شدند. تخم‌ها زیر استریوسکوپ (Stemi 508, Zeiss) شمارش شدند. برای ماده‌های جفت‌گیری کرده، تخم‌هایی که به لارو تبدیل شدند، بارور در نظر گرفته شدند.
برای آزمایش‌های جفت‌گیری، به ماده‌ها بسته به نوع تیمار، حداقل ۲ روز فرصت داده شد تا در برابر جفت‌گیری مقاومت نشان دهند و متعاقباً نرهای هم‌سن با گونه وحشی به همان قفس معرفی شدند. دو شب بعد، وزیکول‌های لقاح‌یافته ماده تشریح شدند و DNA ژنومی با انجماد-ذوب و سونیکاسیون در بافر حاوی ۱۰ میلی‌مولار Tris-HCl، ۱ میلی‌مولار EDTA و ۲۵ میلی‌مولار NaCl (pH 8.2) آزاد شد. نمونه‌ها به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد با پروتئیناز K (۰.۸۶ میکروگرم در میکرولیتر) انکوبه شدند و سپس ۱۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد قرار گرفتند. نمونه‌های خام DNA ژنومی ۱۰ برابر رقیق شدند و تحت تشخیص qPCR توالی‌های کروموزوم Y قرار گرفتند. آغازگرها در جدول داده‌های گسترده ۲ فهرست شده‌اند. عدم وجود توالی کروموزوم Y نشان دهنده عدم جفت‌گیری است.
برای سنجش جفت‌گیری مجدد، ماده‌های جفت‌گیری اجباری از نظر وجود پلاگ‌های جفت‌گیری برای تأیید وضعیت جفت‌گیری بررسی شدند و 2 روز به آنها فرصت داده شد تا در غیاب نرها، همانطور که قبلاً توضیح داده شد (36)، مقاومت به جفت‌گیری ایجاد شود. نرهای حامل اسپرم تراریخته DsRed سپس به قفس‌های ماده‌ها وارد شدند. دو شب بعد، وزیکول‌های لقاح از ماده‌ها جدا شدند و DNA ژنومی همانطور که در بالا توضیح داده شد، تهیه شد و تحت تشخیص qPCR تراریخته DsRed قرار گرفتند. آغازگرها در جدول داده‌های گسترده 2 فهرست شده‌اند. عدم وجود تراریخته DsRed نشان داد که هیچ جفت‌گیری مجددی رخ نداده است.
3D20E همانطور که قبلاً توضیح داده شد، سنتز شد (37). به طور خلاصه، 10 میلی‌گرم 20E (سیگما-آلدریچ) در 10 میلی‌لیتر آب حل شد و سپس 30 میلی‌گرم پلاتین سیاه (به شکل پودر، سیگما-آلدریچ) اضافه شد. جریان ملایمی از O2 به طور مداوم به مخلوط واکنش اضافه شد که در دمای اتاق هم زده شد. پس از 6 ساعت، 30 میلی‌لیتر متانول برای توقف واکنش اضافه شد. مخلوط سانتریفیوژ شد تا ذرات کاتالیزور حذف شوند. محلول رویی در دمای اتاق در خلاء تبخیر شد تا خشک شود. محصول واکنش خشک شده در اتانول و متانول 10٪ برای تزریق جهت آنالیز HPLC-MS/MS حل شد. نرخ تبدیل (از 20E به 3D20E) تقریباً 97٪ بود (شکل 4b) و طیف MS 3D20E سنتز شده با طیف موجود در ماده‌های جفت‌گیری شده مطابقت داشت (شکل 4c).
راهنما شامل جزئیات خاصی از آزمون‌های آماری انجام شده است. از GraphPad (نسخه 9.0) برای انجام آزمون دقیق فیشر، آزمون منتل-کاکس و آزمون تی استیودنت استفاده شد. آزمون‌های Cochran-Mantel-Haenszel با استفاده از یک اسکریپت R سفارشی (موجود در https://github.com/duopeng/mantelhaen.test) انجام شدند. توزیع داده‌ها برای نرمال بودن با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk با آستانه معنی‌داری 0.05 آزمایش شد. هنگامی که داده‌ها در آزمون نرمال بودن شکست خوردند، آزمون Mann-Whitney انجام شد. داده‌های بقا با استفاده از آزمون Mantel-Cox تجزیه و تحلیل شدند. از بسته DESeq2 (نسخه 1.28.1) برای انجام تجزیه و تحلیل بیان افتراقی سطح ژن RNA-seq استفاده شد. نوار افقی روی نمودار نشان دهنده میانه است. مقدار معنی‌داری P = 0.05 به عنوان آستانه برای همه آزمون‌ها استفاده شد.
برای اطلاعات بیشتر در مورد طرح مطالعه، به چکیده گزارش تحقیقات طبیعت که به این مقاله لینک شده است، مراجعه کنید.
داده‌های پروتئومیکس MS از طریق مخزن PRIDE Partner (https://www.ebi.ac.uk/pride/) با شناسه مجموعه داده PXD032157 در کنسرسیوم ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ذخیره شدند.
مجموعه داده‌های RNA-seq در کتابخانه جامع بیان ژن (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) تحت رکورد سریالی GSE198665 ذخیره شده است.
مجموعه داده‌های اضافی تولید شده و/یا تجزیه و تحلیل شده در طول مطالعه حاضر، در صورت درخواست منطقی، ممکن است از نویسندگان مربوطه دریافت شود. این مقاله داده‌های منبع را ارائه می‌دهد.
دی لاف، آ. اکدیستروئیدها: استروئیدهای جنسی حشرات نادیده گرفته شده؟ نر: جعبه سیاه. علوم حشرات. 13، 325–338 (2006).
ردفرن، CPF 20-هیدروکسی اکدیسون و رشد تخمدان در آنوفل استفنز. مجله فیزیولوژی حشرات. 28، 97–109 (1982).