نشان داده شده است که اسید پروپیونیک (PPA)، یک عامل ضد قارچ و افزودنی غذایی رایج، باعث رشد عصبی غیرطبیعی در موش‌ها همراه با اختلال عملکرد دستگاه گوارش می‌شود که ممکن است ناشی از دیسبیوز روده باشد. ارتباطی بین قرار گرفتن در معرض PPA غذایی و دیسبیوز میکروبیوتای روده پیشنهاد شده است، اما به طور مستقیم بررسی نشده است. در اینجا، ما تغییرات مرتبط با PPA در ترکیب میکروبیوتای روده را که ممکن است منجر به دیسبیوز شود، بررسی کردیم. میکروبیوم‌های روده موش‌هایی که با رژیم غذایی بدون درمان (9 نفر) و رژیم غذایی غنی از PPA (13 نفر) تغذیه می‌شدند، با استفاده از توالی‌یابی متاژنومیک دوربرد برای ارزیابی تفاوت‌ها در ترکیب میکروبی و مسیرهای متابولیک باکتریایی، توالی‌یابی شدند. PPA غذایی با افزایش فراوانی گونه‌های قابل توجه، از جمله چندین گونه باکتروئید، پرووتلا و رومینکوکوس، که اعضای آنها قبلاً در تولید PPA دخیل بوده‌اند، مرتبط بود. میکروبیوم‌های موش‌های در معرض PPA همچنین مسیرهای بیشتری مربوط به متابولیسم لیپید و بیوسنتز هورمون استروئیدی داشتند. نتایج ما نشان می‌دهد که PPA می‌تواند میکروبیوتای روده و مسیرهای متابولیکی مرتبط با آن را تغییر دهد. این تغییرات مشاهده‌شده نشان می‌دهد که مواد نگهدارنده‌ای که به عنوان مواد بی‌خطر برای مصرف طبقه‌بندی می‌شوند، می‌توانند بر ترکیب میکروبیوتای روده و به نوبه خود، بر سلامت انسان تأثیر بگذارند.
میکروبیوم انسان اغلب به عنوان "آخرین عضو بدن" شناخته می‌شود و نقش حیاتی در سلامت انسان دارد (Baquero and Nombela, 2012). به طور خاص، میکروبیوم روده به دلیل تأثیر گسترده در کل سیستم و نقش آن در بسیاری از عملکردهای ضروری شناخته شده است. باکتری‌های همزیست در روده به وفور یافت می‌شوند، جایگاه‌های اکولوژیکی متعددی را اشغال می‌کنند، از مواد مغذی استفاده می‌کنند و با عوامل بیماری‌زای بالقوه رقابت می‌کنند (Jandhyala et al., 2015). اجزای باکتریایی متنوع میکروبیوتای روده قادر به تولید مواد مغذی ضروری مانند ویتامین‌ها و تقویت هضم هستند (Rowland et al., 2018). همچنین نشان داده شده است که متابولیت‌های باکتریایی بر رشد بافت تأثیر می‌گذارند و مسیرهای متابولیکی و ایمنی را تقویت می‌کنند (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). ترکیب میکروبیوم روده انسان بسیار متنوع است و به عوامل ژنتیکی و محیطی مانند رژیم غذایی، جنسیت، داروها و وضعیت سلامتی بستگی دارد (Kumbhare et al., 2019).
رژیم غذایی مادر یک جزء حیاتی در رشد جنین و نوزاد و منبع احتمالی ترکیباتی است که ممکن است بر رشد تأثیر بگذارند (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). یکی از این ترکیبات مورد توجه، اسید پروپیونیک (PPA)، یک محصول جانبی اسید چرب با زنجیره کوتاه است که از تخمیر باکتریایی و یک افزودنی غذایی به دست می‌آید (den Besten et al., 2013). PPA دارای خواص ضد باکتری و ضد قارچی است و بنابراین به عنوان نگهدارنده غذا و در کاربردهای صنعتی برای مهار رشد کپک و باکتری استفاده می‌شود (Wemmenhove et al., 2016). PPA اثرات متفاوتی در بافت‌های مختلف دارد. در کبد، PPA با تأثیر بر بیان سیتوکین در ماکروفاژها، اثرات ضد التهابی دارد (Kawasoe et al., 2022). این اثر تنظیمی در سایر سلول‌های ایمنی نیز مشاهده شده است که منجر به کاهش التهاب می‌شود (Haase et al., 2021). با این حال، اثر متضاد در مغز مشاهده شده است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که قرار گرفتن در معرض PPA باعث ایجاد رفتار شبه اوتیسم در موش‌ها می‌شود (El-Ansary و همکاران، ۲۰۱۲). مطالعات دیگر نشان داده‌اند که PPA می‌تواند گلیوز را القا کند و مسیرهای التهابی را در مغز فعال کند (Abdelli و همکاران، ۲۰۱۹). از آنجا که PPA یک اسید ضعیف است، می‌تواند از طریق اپیتلیوم روده به جریان خون نفوذ کند و بنابراین از موانع محدودکننده‌ای از جمله سد خونی-مغزی و همچنین جفت عبور کند (Stinson و همکاران، ۲۰۱۹)، که اهمیت PPA را به عنوان یک متابولیت تنظیمی تولید شده توسط باکتری‌ها برجسته می‌کند. اگرچه نقش بالقوه PPA به عنوان یک عامل خطر برای اوتیسم در حال حاضر در دست بررسی است، اما اثرات آن بر افراد مبتلا به اوتیسم ممکن است فراتر از القای تمایز عصبی باشد.
علائم گوارشی مانند اسهال و یبوست در بیماران مبتلا به اختلالات عصبی-رشدی شایع است (Cao و همکاران، 2021). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که میکروبیوم بیماران مبتلا به اختلالات طیف اوتیسم (ASD) با افراد سالم متفاوت است، که نشان‌دهنده وجود اختلال در میکروبیوتای روده است (Finegold و همکاران، 2010). به طور مشابه، ویژگی‌های میکروبیوم بیماران مبتلا به بیماری‌های التهابی روده، چاقی، بیماری آلزایمر و غیره نیز با افراد سالم متفاوت است (Turnbaugh و همکاران، 2009؛ Vogt و همکاران، 2017؛ Henke و همکاران، 2019). با این حال، تا به امروز، هیچ رابطه علیتی بین میکروبیوم روده و بیماری‌ها یا علائم عصبی برقرار نشده است (Yap و همکاران، 2021)، اگرچه تصور می‌شود چندین گونه باکتریایی در برخی از این بیماری‌ها نقش دارند. برای مثال، Akkermansia، Bacteroides، Clostridium، Lactobacillus، Desulfovibrio و سایر جنس‌ها در میکروبیوتای بیماران مبتلا به اوتیسم فراوان‌تر هستند (Tomova و همکاران، 2015؛ Golubeva و همکاران، 2017؛ Cristiano و همکاران، 2018؛ Zurita و همکاران، 2020). نکته قابل توجه این است که گونه‌های عضو برخی از این جنس‌ها دارای ژن‌های مرتبط با تولید PPA هستند (Reichardt و همکاران، 2014؛ Yun و Lee، 2016؛ Zhang و همکاران، 2019؛ Baur و Dürre، 2023). با توجه به خواص ضد میکروبی PPA، افزایش فراوانی آن ممکن است برای رشد باکتری‌های تولیدکننده PPA مفید باشد (Jacobson و همکاران، 2018). بنابراین، یک محیط غنی از PFA ممکن است منجر به تغییراتی در میکروبیوتای روده، از جمله پاتوژن‌های دستگاه گوارش شود که ممکن است عوامل بالقوه‌ای باشند که منجر به علائم گوارشی می‌شوند.
یک سوال اصلی در تحقیقات میکروبیوم این است که آیا تفاوت در ترکیب میکروبی، علت یا نشانه بیماری‌های زمینه‌ای است. اولین قدم برای روشن شدن رابطه پیچیده بین رژیم غذایی، میکروبیوم روده و بیماری‌های عصبی، ارزیابی اثرات رژیم غذایی بر ترکیب میکروبی است. برای این منظور، ما از توالی‌یابی متاژنومیک با خوانش طولانی برای مقایسه میکروبیوم‌های روده فرزندان موش‌هایی که با رژیم غذایی غنی از PPA یا فاقد PPA تغذیه می‌شدند، استفاده کردیم. فرزندان با همان رژیم غذایی مادرانشان تغذیه شدند. ما فرض کردیم که رژیم غذایی غنی از PPA منجر به تغییراتی در ترکیب میکروبی روده و مسیرهای عملکردی میکروبی، به ویژه آنهایی که مربوط به متابولیسم PPA و/یا تولید PPA هستند، می‌شود.
این مطالعه از موش‌های تراریخته FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (آزمایشگاه‌های جکسون) استفاده کرد که پروتئین فلورسنت سبز (GFP) را تحت کنترل پروموتر GFAP اختصاصی گلیا، طبق دستورالعمل‌های کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه مرکزی فلوریدا (UCF-IACUC) (شماره مجوز استفاده از حیوانات: PROTO202000002) بیش از حد بیان می‌کنند. پس از از شیر گرفتن، موش‌ها به صورت جداگانه در قفس‌هایی با ۱ تا ۵ موش از هر جنس در هر قفس نگهداری شدند. موش‌ها به صورت آزاد با یک رژیم غذایی کنترل خالص (رژیم غذایی استاندارد اصلاح‌شده با برچسب باز، ۱۶ کیلوکالری٪ چربی) یا یک رژیم غذایی حاوی پروپیونات سدیم (رژیم غذایی استاندارد اصلاح‌شده با برچسب باز، ۱۶ کیلوکالری٪ چربی، حاوی ۵۰۰۰ ppm پروپیونات سدیم) تغذیه شدند. مقدار پروپیونات سدیم استفاده شده معادل ۵۰۰۰ میلی‌گرم PFA در کیلوگرم وزن کل غذا بود. این بالاترین غلظت PPA است که برای استفاده به عنوان نگهدارنده غذا تأیید شده است. برای آماده شدن برای این مطالعه، موش‌های والد به مدت ۴ هفته قبل از جفت‌گیری با هر دو رژیم غذایی تغذیه شدند و در طول بارداری مادران نیز ادامه یافت. موش‌های زاده [۲۲ موش، ۹ موش کنترل (۶ نر، ۳ ماده) و ۱۳ موش PPA (۴ نر، ۹ ماده)] از شیر گرفته شدند و سپس به مدت ۵ ماه با همان رژیم غذایی مادران ادامه یافتند. موش‌های زاده در ۵ ماهگی کشته شدند و محتویات مدفوع روده آنها جمع‌آوری و در ابتدا در لوله‌های میکروسانتریفیوژ ۱.۵ میلی‌لیتری در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری و سپس به فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد منتقل شدند تا DNA میزبان تخلیه و اسیدهای نوکلئیک میکروبی استخراج شود.
DNA میزبان طبق یک پروتکل اصلاح‌شده (Charalampous و همکاران، 2019) حذف شد. به طور خلاصه، محتویات مدفوع به 500 میکرولیتر InhibitEX (Qiagen، Cat#/ID: 19593) منتقل و به صورت منجمد نگهداری شد. در هر استخراج، حداکثر 1-2 پلت مدفوعی را فرآوری کنید. سپس محتویات مدفوع با استفاده از یک هاون پلاستیکی در داخل لوله به صورت مکانیکی همگن شدند تا به صورت دوغاب درآیند. نمونه‌ها را به مدت 5 دقیقه یا تا زمانی که نمونه‌ها پلت شوند، در 10000 RCF سانتریفیوژ کنید، سپس مایع رویی را آسپیره کرده و پلت را در 250 میکرولیتر 1× PBS دوباره به حالت تعلیق درآورید. 250 میکرولیتر محلول ساپونین 4.4٪ (TCI، شماره محصول S0019) به عنوان شوینده برای شل کردن غشاهای سلولی یوکاریوتی به نمونه اضافه کنید. نمونه‌ها به آرامی مخلوط شدند تا یکدست شوند و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. در مرحله بعد، برای از بین بردن سلول‌های یوکاریوتی، 350 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز به نمونه اضافه شد، به مدت 30 ثانیه انکوبه شد و سپس 12 میکرولیتر 5 مولار NaCl اضافه شد. سپس نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه در 6000 RCF سانتریفیوژ شدند. محلول رویی را آسپیره کرده و رسوب را در 100 میکرولیتر 1X PBS دوباره به حالت تعلیق درآورید. برای حذف DNA میزبان، 100 میکرولیتر بافر HL-SAN (12.8568 گرم NaCl، 4 میلی‌لیتر 1M MgCl2، 36 میلی‌لیتر آب بدون نوکلئاز) و 10 میکرولیتر آنزیم HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202) اضافه کنید. نمونه‌ها با پیپتینگ کاملاً مخلوط شده و به مدت 30 دقیقه با سرعت 800 دور در دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد روی دستگاه Eppendorf™ ThermoMixer C انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، به مدت 3 دقیقه در 6000 RCF سانتریفیوژ شده و دو بار با 800 میکرولیتر و 1000 میکرولیتر 1X PBS شسته شدند. در نهایت، رسوب را در 100 میکرولیتر 1X PBS دوباره به حالت تعلیق درآورید.
DNA کل باکتری با استفاده از کیت خالص‌سازی DNA ژنومی Monarch ساخت شرکت New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) جداسازی شد. روش کار استاندارد ارائه شده همراه با کیت کمی تغییر یافته است. قبل از عملیات برای شستشوی نهایی، آب بدون نوکلئاز را در دمای 60 درجه سانتیگراد انکوبه کرده و نگه دارید. 10 میکرولیتر پروتئیناز K و 3 میکرولیتر RNase A به هر نمونه اضافه کنید. سپس 100 میکرولیتر بافر لیز سلولی اضافه کرده و به آرامی مخلوط کنید. سپس نمونه‌ها در Eppendorf™ ThermoMixer C در دمای 56 درجه سانتیگراد و سرعت 1400 دور در دقیقه به مدت حداقل 1 ساعت و حداکثر 3 ساعت انکوبه شدند. نمونه‌های انکوبه شده به مدت 3 دقیقه در 12000 RCF سانتریفیوژ شدند و مایع رویی هر نمونه به یک لوله میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی‌لیتری جداگانه حاوی 400 میکرولیتر محلول اتصال منتقل شد. سپس لوله‌ها به مدت ۵ تا ۱۰ ثانیه با فواصل ۱ ثانیه‌ای ورتکس پالسی شدند. کل محتوای مایع هر نمونه (تقریباً ۶۰۰ تا ۷۰۰ میکرولیتر) را به یک کارتریج فیلتر که در یک لوله جمع‌آوری جریان‌دار قرار داده شده بود، منتقل کنید. لوله‌ها به مدت ۳ دقیقه در ۱۰۰۰ RCF سانتریفیوژ شدند تا اتصال اولیه DNA انجام شود و سپس به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ RCF سانتریفیوژ شدند تا مایع باقیمانده حذف شود. ستون نمونه به یک لوله جمع‌آوری جدید منتقل و سپس دو بار شسته شد. برای اولین شستشو، ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو به هر لوله اضافه کنید. لوله را ۳ تا ۵ بار وارونه کنید و سپس به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ RCF سانتریفیوژ کنید. مایع را از لوله جمع‌آوری دور بریزید و کارتریج فیلتر را دوباره در همان لوله جمع‌آوری قرار دهید. برای شستشوی دوم، ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو را بدون وارونه کردن به فیلتر اضافه کنید. نمونه‌ها به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ RCF سانتریفیوژ شدند. فیلتر را به یک لوله 1.5 میلی‌لیتری LoBind® منتقل کنید و 100 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز از قبل گرم شده اضافه کنید. فیلترها به مدت 1 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند و سپس به مدت 1 دقیقه در 12000 RCF سانتریفیوژ شدند. DNA شسته شده در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
غلظت DNA با استفاده از فلورومتر Qubit™ 4.0 تعیین مقدار شد. DNA با استفاده از کیت حساسیت بالای Qubit™ 1X dsDNA (شماره کاتالوگ Q33231) طبق دستورالعمل سازنده تهیه شد. توزیع طول قطعات DNA با استفاده از Aglient™ 4150 یا 4200 TapeStation اندازه‌گیری شد. DNA با استفاده از معرف‌های DNA ژنومی Agilent™ (شماره کاتالوگ 5067-5366) و نوار اسکرین DNA ژنومی (شماره کاتالوگ 5067-5365) تهیه شد. آماده‌سازی کتابخانه با استفاده از کیت بارکدگذاری PCR سریع Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. DNA با استفاده از یک توالی‌یاب ONT GridION™ Mk1 با یک سلول جریان Min106D (R 9.4.1) توالی‌یابی شد. تنظیمات توالی‌یابی عبارت بودند از: توالی‌یابی پایه با دقت بالا، حداقل مقدار q برابر با ۹، تنظیم بارکد و اصلاح بارکد. نمونه‌ها به مدت ۷۲ ساعت توالی‌یابی شدند و پس از آن داده‌های توالی‌یابی پایه برای پردازش و تجزیه و تحلیل بیشتر ارسال شدند.
پردازش بیوانفورماتیک با استفاده از روش‌های شرح داده شده قبلی انجام شد (Greenman و همکاران، 2024). فایل‌های FASTQ به‌دست‌آمده از توالی‌یابی برای هر نمونه به دایرکتوری‌هایی تقسیم شدند. قبل از تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک، داده‌ها با استفاده از خط لوله زیر پردازش شدند: ابتدا، فایل‌های FASTQ نمونه‌ها در یک فایل FASTQ واحد ادغام شدند. سپس، خوانش‌های کوتاه‌تر از 1000 جفت باز با استفاده از Filtlong نسخه 0.2.1 فیلتر شدند و تنها پارامتر تغییر یافته -min_length 1000 بود (Wick، 2024). قبل از فیلتر کردن بیشتر، کیفیت خوانش با استفاده از NanoPlot نسخه 1.41.3 با پارامترهای زیر کنترل شد: -fastq -plots dot -N50 -o(De Coster and Rademakers, 2023). ریدها با استفاده از minimap2 نسخه 2.24-r1122 با ژنوم مرجع موش GRCm39 (GCF_000001635.27) هم‌تراز شدند تا ریدهای آلوده به میزبان با پارامترهای زیر حذف شوند: -L -ax map-ont(لی، ۲۰۱۸). فایل‌های هم‌ترازی تولید شده با استفاده از samtools view -b (Danecek و همکاران، ۲۰۲۱) در samtools نسخه ۱.۱۶.۱ به فرمت BAM تبدیل شدند. سپس خوانش‌های ناهم‌تراز با استفاده از samtools view -b -f 4 شناسایی شدند که نشان می‌دهد این خوانش‌ها متعلق به ژنوم میزبان نیستند. خوانش‌های ناهم‌تراز با استفاده از samtools bam2fq با پارامترهای پیش‌فرض به فرمت FASTQ تبدیل شدند. NanoPlot با استفاده از تنظیماتی که قبلاً توضیح داده شد، دوباره روی خوانش‌های فیلتر شده بعدی اجرا شد. پس از فیلتر کردن، داده‌های متاژنومیک با استفاده از metaflye نسخه ۲.۸.۲-b1689 با پارامترهای زیر جمع‌آوری شدند: –nano-raw–meta (Kolmogorov و همکاران، 2020). پارامترهای باقی مانده را در مقادیر پیش‌فرض خود رها کنید. پس از مونتاژ، خوانش‌های فیلتر شده با استفاده از minimap2 به مونتاژ نگاشت شدند و از پارامتر -ax map-ont برای تولید یک فایل هم‌ترازی با فرمت SAM استفاده شد. این مونتاژ ابتدا با استفاده از racon نسخه 1.4.20 با پارامترهای زیر اصلاح شد: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser و همکاران، 2017). پس از تکمیل racon، با استفاده از medaka نسخه 1.7.2 و با استفاده از medaka_consesus، با تمام پارامترها به جز پارامتر -m در مقادیر پیش‌فرض خود، اصلاح بیشتری شد. پارامتر -m روی r941_min_hac_g507 تنظیم شده است تا شیمی سلول جریان و فراخوانی پایه با دقت بالا که برای داده‌های ما استفاده می‌شود را مشخص کند (nanoporetech/medaka، 2024). داده‌های فیلتر شده (که از این پس به عنوان داده‌های میکروبی نامیده می‌شوند) و مجموعه نهایی تمیز شده برای تجزیه و تحلیل‌های بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.
برای طبقه‌بندی طبقه‌بندی، داده‌های خوانده شده و کانتیگ‌های مونتاژ شده با استفاده از Kraken2 نسخه 2.1.2 طبقه‌بندی شدند (Wood و همکاران، 2019). به ترتیب گزارش‌ها و فایل‌های خروجی را برای داده‌های خوانده شده و مجموعه‌ها ایجاد کنید. از گزینه –use-names برای تجزیه و تحلیل داده‌های خوانده شده و مجموعه‌ها استفاده کنید. گزینه‌های –gzip-compressed و –paired برای بخش‌های خوانده شده مشخص شده‌اند. فراوانی نسبی گونه‌ها در متاژنوم‌ها با استفاده از Bracken نسخه 2.8 تخمین زده شد (Lu و همکاران، 2017). ما ابتدا یک پایگاه داده kmer حاوی 1000 باز با استفاده از bracken-build با پارامترهای زیر ایجاد کردیم: -d-k 35 -l 1000 پس از ساخته شدن، bracken بر اساس گزارش تولید شده توسط kraken2 اجرا می‌شود و داده‌ها را با استفاده از گزینه‌های زیر فیلتر می‌کند: -d -I -O-پ ۱۰۰۰ -ل

در میان آنها، P، G یا S بسته به سطح طبقه‌بندی مورد تجزیه و تحلیل انتخاب می‌شود. برای به حداقل رساندن تأثیر طبقه‌بندی‌های مثبت کاذب، حداقل آستانه فراوانی نسبی 1e-4 (1/10,000 خوانش) در نظر گرفته شد. قبل از تجزیه و تحلیل آماری، فراوانی‌های نسبی گزارش شده توسط Bracken (fraction_total_reads) با استفاده از تبدیل نسبت لگاریتمی مرکزی (CLR) تبدیل شدند (Aitchison, 1982). روش CLR برای تبدیل داده‌ها انتخاب شد زیرا نسبت به مقیاس ثابت است و برای مجموعه داده‌های غیر پراکنده کافی است (Gloor et al., 2017). تبدیل CLR از لگاریتم طبیعی استفاده می‌کند. داده‌های شمارش گزارش شده توسط Bracken با استفاده از عبارت لگاریتمی نسبی (RLE) نرمال‌سازی شدند (Anders and Huber, 2010). ارقام با استفاده از ترکیبی از matplotlib نسخه 3.7.1، seaborn نسخه 3.7.2 و لگاریتم‌های متوالی تولید شدند (Gloor et al., 2017). 0.12.2 و مقادیر ثابت v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). نسبت باسیلوس/باکتروئیدت برای هر نمونه با استفاده از شمارش نرمال شده باکتری‌ها محاسبه شد. مقادیر گزارش شده در جداول تا 4 رقم اعشار گرد شده‌اند. شاخص تنوع سیمپسون با استفاده از اسکریپت alpha_diversity.py ارائه شده در بسته KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022) محاسبه شد. گزارش براکن در اسکریپت ارائه شده است و شاخص سیمپسون "Si" برای پارامتر -an ارائه شده است. تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی به عنوان میانگین تفاوت‌های CLR ≥ 1 یا ≤ -1 تعریف شدند. میانگین تفاوت CLR ±1 نشان دهنده افزایش 2.7 برابری در فراوانی یک نوع نمونه است. علامت (+/-) نشان می‌دهد که آیا تاکسون به ترتیب در نمونه PPA و نمونه کنترل فراوان‌تر است یا خیر. اهمیت با استفاده از آزمون Mann-Whitney U تعیین شد (Virtanen و همکاران، 2020). از Statsmodels نسخه 0.14 (Benjamini و Hochberg، 1995؛ Seabold و Perktold، 2010) استفاده شد و روش Benjamini-Hochberg برای اصلاح آزمایش‌های چندگانه اعمال شد. مقدار p تعدیل‌شده ≤ 0.05 به عنوان آستانه تعیین اهمیت آماری استفاده شد.
حاشیه‌نویسی ژن و تخمین فراوانی نسبی با استفاده از نسخه اصلاح‌شده پروتکل شرح داده شده توسط مارانگا و همکاران (Maranga و همکاران، 2023) انجام شد. ابتدا، کانتیگ‌های کوتاه‌تر از 500 جفت باز با استفاده از SeqKit نسخه 2.5.1 (Shen و همکاران، 2016) از تمام مجموعه‌ها حذف شدند. سپس مجموعه‌های انتخاب شده در یک متاژنوم پان ترکیب شدند. چارچوب‌های خواندن باز (ORF) با استفاده از Prodigal نسخه 1.0.1 (نسخه موازی Prodigal نسخه 2.6.3) با پارامترهای زیر شناسایی شدند: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett و همکاران، 2012؛ Jaenicke، 2024). سپس فایل‌های نوکلئوتیدی حاصل با استفاده از پایتون فیلتر شدند تا تمام ژن‌های ناقص حذف شوند. سپس از CD-HIT نسخه 4.8.1 برای خوشه‌بندی ژن‌ها با پارامترهای زیر استفاده شد: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu و همکاران، ۲۰۱۲). از کاتالوگ ژن غیر تکراری تولید شده برای تخمین فراوانی ژن و حاشیه نویسی استفاده شد. فراوانی نسبی ژن با استفاده از KMA نسخه ۱.۴.۹ تخمین زده شد (Clausen و همکاران، ۲۰۱۸). ابتدا، یک فایل شاخص با استفاده از شاخص KMA با پارامترهای زیر ایجاد کنید: -i -Oسپس، با استفاده از شاخص تولید شده به همراه خوانش‌های میکروبی برای هر نمونه، همانطور که در بخش Bioinformatics Pipeline توضیح داده شده است، KMA با پارامترهای زیر اجرا شد: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. سپس، تعداد ژن‌ها با استفاده از CLR نرمال‌سازی شد و از کلاس تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) از Sci-kit learn استفاده شد (Pedregosa و همکاران، ۲۰۱۱). حاشیه‌نویسی ژن پیش‌بینی‌شده با استفاده از اسکریپت emapper.py از eggNOG نسخه ۲.۱.۱۲ و پایگاه داده eggNOG نسخه ۵.۰.۲ با پارامترهای زیر بر روی کاتالوگ ژن غیر تکراری انجام شد: –typepe CDS –cpu 24 -i– کاتالوگ داده‌ها–go_evidence غیر الکترونیکی – خروجی– دایرکتوری خروجی–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra و همکاران، 2021). نتایج KMA برای انتخاب ژن‌هایی با پوشش الگوی کافی و هویت الگویی (≥ 90%) و فراوانی (عمق ≥ 3) غربالگری شدند. نتایج عمق KMA با استفاده از CLR همانطور که در بالا توضیح داده شد، تبدیل شدند. سپس نتایج KMA با شناسه‌های کانتیگ حاصل از حاشیه‌نویسی عملکردی و نتایج طبقه‌بندی با استفاده از منبع کانتیگ برای هر ژن مقایسه شدند. همانند گونه‌ها، تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی ژن به عنوان ژن‌هایی با میانگین تفاوت CLR ≥ 1 یا ≤ -1 تعریف شدند، با علامت (+/-) که نشان می‌دهد ژن به ترتیب در نمونه‌های PPA یا کنترل فراوان‌تر بوده است.
ژن‌ها ابتدا بر اساس شناسه‌های ارتولوگ (KO) دایره‌المعارف ژن‌ها و ژنوم‌های کیوتو (KEGG) که توسط eggNOG برای مقایسه فراوانی مسیرهای ژنی اختصاص داده شده بودند، گروه‌بندی شدند. ژن‌های بدون حذف یا ژن‌هایی با چندین حذف قبل از تجزیه و تحلیل حذف شدند. سپس میانگین فراوانی هر KO در هر نمونه محاسبه و تجزیه و تحلیل آماری انجام شد. ژن‌های متابولیسم PPA به عنوان هر ژنی که در ستون KEGG_Pathway یک ردیف ko00640 به آن اختصاص داده شده بود، تعریف شدند که نشان دهنده نقشی در متابولیسم پروپیونات طبق KEGG است. ژن‌های شناسایی شده مرتبط با تولید PPA در جدول تکمیلی 1 فهرست شده‌اند (Reichardt و همکاران، 2014؛ Yang و همکاران، 2017). آزمایش‌های جایگشت برای شناسایی ژن‌های متابولیسم و ​​تولید PPA که در هر نوع نمونه به طور قابل توجهی فراوان‌تر بودند، انجام شد. هزار جایگشت برای هر ژن مورد تجزیه و تحلیل انجام شد. مقدار p برابر با 0.05 به عنوان حد آستانه برای تعیین اهمیت آماری استفاده شد. حاشیه‌نویسی‌های عملکردی بر اساس حاشیه‌نویسی‌های ژن‌های نماینده در هر خوشه، به ژن‌های منفرد درون یک خوشه اختصاص داده شدند. گونه‌های مرتبط با متابولیسم PPA و/یا تولید PPA را می‌توان با تطبیق شناسه‌های کانتیگ در فایل‌های خروجی Kraken2 با همان شناسه‌های کانتیگ حفظ شده در طول حاشیه‌نویسی عملکردی با استفاده از eggNOG شناسایی کرد. آزمون معناداری با استفاده از آزمون Mann-Whitney U که قبلاً توضیح داده شد، انجام شد. اصلاح برای آزمایش‌های چندگانه با استفاده از روش Benjamini-Hochberg انجام شد. مقدار p کمتر یا مساوی 0.05 به عنوان حد آستانه برای تعیین معناداری آماری استفاده شد.
تنوع میکروبیوم روده موش‌ها با استفاده از شاخص تنوع سیمپسون ارزیابی شد. هیچ تفاوت معنی‌داری بین نمونه‌های کنترل و PPA از نظر تنوع جنس و گونه مشاهده نشد (مقدار p برای جنس: 0.18، مقدار p برای گونه: 0.16) (شکل 1). سپس ترکیب میکروبی با استفاده از تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) مقایسه شد. شکل 2 خوشه‌بندی نمونه‌ها را بر اساس شاخه آنها نشان می‌دهد که نشان می‌دهد تفاوت‌هایی در ترکیب گونه‌ای میکروبیوم‌ها بین نمونه‌های PPA و کنترل وجود دارد. این خوشه‌بندی در سطح جنس کمتر مشهود بود، که نشان می‌دهد PPA بر باکتری‌های خاصی تأثیر می‌گذارد (شکل تکمیلی 1).
شکل 1. تنوع آلفای جنس‌ها و ترکیب گونه‌ای میکروبیوم روده موش. نمودارهای جعبه‌ای شاخص‌های تنوع سیمپسون جنس‌ها (A) و گونه‌ها (B) را در نمونه‌های PPA و کنترل نشان می‌دهند. معناداری با استفاده از آزمون U مان-ویتنی تعیین شد و تصحیح چندگانه با استفاده از روش بنجامینی-هاچبرگ انجام شد. ns، مقدار p معنی‌دار نبود (p>0.05).
شکل 2. نتایج تحلیل مؤلفه‌های اصلی ترکیب میکروبیوم روده موش در سطح گونه. نمودار تحلیل مؤلفه‌های اصلی، توزیع نمونه‌ها را بر اساس دو مؤلفه اصلی اول آنها نشان می‌دهد. رنگ‌ها نوع نمونه را نشان می‌دهند: موش‌های در معرض PPA بنفش و موش‌های کنترل زرد هستند. مؤلفه‌های اصلی 1 و 2 به ترتیب روی محور x و محور y رسم شده‌اند و به صورت نسبت واریانس توضیح داده شده آنها بیان شده‌اند.
با استفاده از داده‌های شمارش تبدیل‌شده RLE، کاهش معنی‌داری در نسبت میانه باکتریودت‌ها/باسیل‌ها در موش‌های کنترل و PPA مشاهده شد (کنترل: 9.66، PPA: 3.02؛ p-value = 0.0011). این تفاوت به دلیل فراوانی بیشتر باکتریودت‌ها در موش‌های PPA در مقایسه با گروه کنترل بود، اگرچه این تفاوت معنی‌دار نبود (میانگین CLR کنترل: 5.51، میانگین CLR PPA: 6.62؛ p-value = 0.054)، در حالی که فراوانی باکتریودت‌ها مشابه بود (میانگین CLR کنترل: 7.76، میانگین CLR PPA: 7.60؛ p-value = 0.18).
تجزیه و تحلیل فراوانی اعضای طبقه‌بندی‌شده‌ی میکروبیوم روده نشان داد که ۱ شاخه و ۷۷ گونه بین نمونه‌های PPA و نمونه‌های کنترل تفاوت معنی‌داری داشتند (جدول تکمیلی ۲). فراوانی ۵۹ گونه در نمونه‌های PPA به طور قابل توجهی بیشتر از نمونه‌های کنترل بود، در حالی که فراوانی تنها ۱۶ گونه در نمونه‌های کنترل بیشتر از نمونه‌های PPA بود (شکل ۳).
شکل 3. فراوانی افتراقی گونه‌ها در میکروبیوم روده موش‌های PPA و گروه کنترل. نمودارهای آتشفشانی تفاوت در فراوانی جنس‌ها (A) یا گونه‌ها (B) بین نمونه‌های PPA و گروه کنترل را نشان می‌دهند. نقاط خاکستری نشان دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در فراوانی گونه‌ها هستند. نقاط رنگی نشان دهنده تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی هستند (مقدار p ≤ 0.05). 20 گونه برتر با بیشترین تفاوت در فراوانی بین انواع نمونه‌ها به ترتیب با رنگ قرمز و آبی روشن (نمونه‌های کنترل و PPA) نشان داده شده‌اند. نقاط زرد و بنفش حداقل 2.7 برابر بیشتر در نمونه‌های کنترل یا PPA نسبت به گروه کنترل فراوان بودند. نقاط سیاه نشان دهنده گونه‌هایی با فراوانی‌های قابل توجه متفاوت هستند، با میانگین تفاوت‌های CLR بین -1 و 1. مقادیر P با استفاده از آزمون Mann-Whitney U محاسبه و برای آزمایش‌های متعدد با استفاده از روش Benjamini-Hochberg اصلاح شدند. میانگین تفاوت‌های CLR پررنگ نشان دهنده تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی است.
پس از تجزیه و تحلیل ترکیب میکروبی روده، ما یک حاشیه‌نویسی عملکردی از میکروبیوم انجام دادیم. پس از فیلتر کردن ژن‌های کم‌کیفیت، در مجموع 378355 ژن منحصر به فرد در تمام نمونه‌ها شناسایی شد. فراوانی تبدیل‌شده‌ی این ژن‌ها برای تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) استفاده شد و نتایج، درجه بالایی از خوشه‌بندی انواع نمونه‌ها را بر اساس پروفایل‌های عملکردی آنها نشان داد (شکل 4).
شکل ۴. نتایج PCA با استفاده از پروفایل عملکردی میکروبیوم روده موش. نمودار PCA توزیع نمونه‌ها را بر اساس دو مؤلفه اصلی اول آنها نشان می‌دهد. رنگ‌ها نوع نمونه را نشان می‌دهند: موش‌های در معرض PPA بنفش و موش‌های کنترل زرد هستند. مؤلفه‌های اصلی ۱ و ۲ به ترتیب روی محور x و محور y رسم شده‌اند و به صورت نسبت واریانس توضیح داده شده آنها بیان می‌شوند.
در مرحله بعد، فراوانی ژن‌های KEGG ناک‌اوت‌شده را در انواع مختلف نمونه بررسی کردیم. در مجموع ۳۶۴۸ ژن ناک‌اوت منحصر به فرد شناسایی شد که از این تعداد، ۱۹۶ ژن در نمونه‌های کنترل و ۱۰۶ ژن در نمونه‌های PPA به طور قابل توجهی فراوان‌تر بودند (شکل ۵). در مجموع ۱۴۵ ژن در نمونه‌های کنترل و ۶۱ ژن در نمونه‌های PPA شناسایی شد که فراوانی آنها به طور قابل توجهی متفاوت بود. مسیرهای مربوط به متابولیسم لیپید و آمینوساکارید در نمونه‌های PPA به طور قابل توجهی غنی‌تر بودند (جدول تکمیلی ۳). مسیرهای مربوط به متابولیسم نیتروژن و سیستم‌های رله گوگرد در نمونه‌های کنترل به طور قابل توجهی غنی‌تر بودند (جدول تکمیلی ۳). فراوانی ژن‌های مربوط به متابولیسم آمینوساکارید/نوکلئوتید (ko:K21279) و متابولیسم اینوزیتول فسفات (ko:K07291) در نمونه‌های PPA به طور قابل توجهی بیشتر بود (شکل ۵). نمونه‌های کنترل به طور قابل توجهی ژن‌های بیشتری مربوط به متابولیسم بنزوات (ko:K22270)، متابولیسم نیتروژن (ko:K00368) و گلیکولیز/گلوکونئوژنز (ko:K00131) داشتند (شکل 5).
شکل 5. فراوانی افتراقی KOها در میکروبیوم روده موش‌های PPA و کنترل. نمودار آتشفشانی تفاوت‌ها در فراوانی گروه‌های عاملی (KOها) را نشان می‌دهد. نقاط خاکستری نشان‌دهنده KOهایی هستند که فراوانی آنها بین انواع نمونه‌ها تفاوت معنی‌داری نداشت (p-value > 0.05). نقاط رنگی نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی هستند (p-value ≤ 0.05). 20 KO با بیشترین تفاوت در فراوانی بین انواع نمونه‌ها به ترتیب با رنگ قرمز و آبی روشن نشان داده شده‌اند که مربوط به نمونه‌های کنترل و PPA هستند. نقاط زرد و بنفش نشان‌دهنده KOهایی هستند که به ترتیب حداقل 2.7 برابر بیشتر در نمونه‌های کنترل و PPA فراوان بودند. نقاط سیاه نشان‌دهنده KOهایی با فراوانی‌های قابل توجه متفاوت هستند که میانگین تفاوت CLR آنها بین -1 و 1 است. مقادیر P با استفاده از آزمون Mann-Whitney U محاسبه و برای مقایسه‌های چندگانه با استفاده از روش Benjamini-Hochberg تنظیم شدند. NaN نشان می‌دهد که KO به مسیری در KEGG تعلق ندارد. مقادیر تفاوت میانگین CLR پررنگ نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی هستند. برای اطلاعات دقیق در مورد مسیرهایی که KO های ذکر شده به آنها تعلق دارند، به جدول تکمیلی 3 مراجعه کنید.
در میان ژن‌های حاشیه‌نویسی‌شده، فراوانی ۱۶۰۱ ژن بین انواع نمونه‌ها به‌طور قابل‌توجهی متفاوت بود (p ≤ ۰.۰۵)، ​​به‌طوری‌که هر ژن حداقل ۲.۷ برابر فراوان‌تر بود. از این ژن‌ها، ۴ ژن در نمونه‌های کنترل فراوان‌تر و ۱۵۹۷ ژن در نمونه‌های PPA فراوان‌تر بودند. از آنجا که PPA دارای خواص ضدمیکروبی است، فراوانی ژن‌های متابولیسم و ​​تولید PPA را بین انواع نمونه‌ها بررسی کردیم. در میان ۱۳۳۲ ژن مرتبط با متابولیسم PPA، ۲۷ ژن در نمونه‌های کنترل به‌طور قابل‌توجهی فراوان‌تر و ۱۲ ژن در نمونه‌های PPA فراوان‌تر بودند. در میان ۲۲۳ ژن مرتبط با تولید PPA، ۱ ژن در نمونه‌های PPA به‌طور قابل‌توجهی فراوان‌تر بود. شکل ۶A فراوانی بیشتر ژن‌های دخیل در متابولیسم PPA را بیشتر نشان می‌دهد، با فراوانی به‌طور قابل‌توجهی بالاتر در نمونه‌های کنترل و اندازه‌های اثر بزرگ، در حالی که شکل ۶B ژن‌های منفرد با فراوانی به‌طور قابل‌توجهی بالاتر مشاهده‌شده در نمونه‌های PPA را برجسته می‌کند.
شکل 6. فراوانی افتراقی ژن‌های مرتبط با PPA در میکروبیوم روده موش. نمودارهای آتشفشانی تفاوت در فراوانی ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA (A) و تولید PPA (B) را نشان می‌دهند. نقاط خاکستری نشان دهنده ژن‌هایی هستند که فراوانی آنها بین انواع نمونه‌ها تفاوت معنی‌داری نداشت (p-value > 0.05). نقاط رنگی نشان دهنده تفاوت‌های معنی‌دار در فراوانی هستند (p-value ≤ 0.05). 20 ژن با بیشترین تفاوت در فراوانی به ترتیب با رنگ قرمز و آبی روشن (نمونه‌های کنترل و PPA) نشان داده شده‌اند. فراوانی نقاط زرد و بنفش حداقل 2.7 برابر بیشتر از نمونه‌های کنترل بود. نقاط سیاه نشان دهنده ژن‌هایی با فراوانی‌های به طور قابل توجهی متفاوت هستند، با میانگین تفاوت‌های CLR بین -1 و 1. مقادیر P با استفاده از آزمون Mann-Whitney U محاسبه و برای مقایسه‌های چندگانه با استفاده از روش Benjamini-Hochberg اصلاح شدند. ژن‌ها با ژن‌های نماینده در کاتالوگ ژن‌های غیر تکراری مطابقت دارند. نام ژن‌ها شامل نماد KEGG است که نشان دهنده یک ژن KO است. تفاوت‌های میانگین CLR پررنگ نشان‌دهنده فراوانی‌های متفاوت و معنادار است. خط تیره (-) نشان می‌دهد که هیچ نمادی برای ژن در پایگاه داده KEGG وجود ندارد.
گونه‌های دارای ژن‌های مرتبط با متابولیسم و/یا تولید PPA با تطبیق هویت طبقه‌بندی کانتیگ‌ها با شناسه کانتیگ ژن شناسایی شدند. در سطح جنس، ۱۳۰ جنس دارای ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA و ۶۱ جنس دارای ژن‌های مرتبط با تولید PPA شناسایی شدند (جدول تکمیلی ۴). با این حال، هیچ جنس تفاوت معنی‌داری در فراوانی نشان نداد (p > 0.05).
در سطح گونه، مشخص شد که ۱۴۴ گونه باکتریایی دارای ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA و ۶۸ گونه باکتریایی دارای ژن‌های مرتبط با تولید PPA هستند (جدول تکمیلی ۵). در میان متابولیزه‌کننده‌های PPA، هشت باکتری افزایش قابل توجهی در فراوانی بین انواع نمونه‌ها نشان دادند و همگی تغییرات قابل توجهی در اثر خود نشان دادند (جدول تکمیلی ۶). همه متابولیزه‌کننده‌های PPA شناسایی شده با تفاوت‌های قابل توجه در فراوانی، در نمونه‌های PPA فراوان‌تر بودند. طبقه‌بندی در سطح گونه، نمایندگانی از جنس‌هایی را نشان داد که بین انواع نمونه‌ها تفاوت معنی‌داری نداشتند، از جمله چندین گونه Bacteroides و Ruminococcus، و همچنین Duncania dubois، Myxobacterium enterica، Monococcus pectinolyticus و Alcaligenes polymorpha. در میان باکتری‌های تولیدکننده PPA، چهار باکتری تفاوت قابل توجهی در فراوانی بین انواع نمونه‌ها نشان دادند. گونه‌هایی که تفاوت قابل توجهی در فراوانی داشتند شامل Bacteroides novorossi، Duncania dubois، Myxobacterium enteritidis و Ruminococcus bovis بودند.
در این مطالعه، ما اثرات قرار گرفتن در معرض PPA را بر میکروبیوتای روده موش‌ها بررسی کردیم. PPA می‌تواند پاسخ‌های متفاوتی را در باکتری‌ها ایجاد کند زیرا توسط گونه‌های خاصی تولید می‌شود، توسط گونه‌های دیگر به عنوان منبع غذایی استفاده می‌شود یا اثرات ضد میکروبی دارد. بنابراین، افزودن آن به محیط روده از طریق مکمل غذایی ممکن است بسته به تحمل، حساسیت و توانایی استفاده از آن به عنوان منبع غذایی، اثرات متفاوتی داشته باشد. گونه‌های باکتریایی حساس ممکن است حذف شوند و با گونه‌هایی که در برابر PPA مقاوم‌تر هستند یا قادر به استفاده از آن به عنوان منبع غذایی هستند، جایگزین شوند که منجر به تغییراتی در ترکیب میکروبیوتای روده می‌شود. نتایج ما تفاوت‌های قابل توجهی را در ترکیب میکروبی نشان داد اما هیچ تاثیری بر تنوع کلی میکروبی نداشت. بیشترین اثرات در سطح گونه مشاهده شد، به طوری که بیش از 70 گونه از نظر فراوانی بین نمونه‌های PPA و نمونه‌های کنترل تفاوت معنی‌داری داشتند (جدول تکمیلی 2). ارزیابی بیشتر ترکیب نمونه‌های در معرض PPA، ناهمگونی بیشتر گونه‌های میکروبی را در مقایسه با نمونه‌های در معرض قرار نگرفته نشان داد، که نشان می‌دهد PPA ممکن است ویژگی‌های رشد باکتری‌ها را افزایش داده و جمعیت‌های باکتریایی را که می‌توانند در محیط‌های غنی از PPA زنده بمانند، محدود کند. بنابراین، PPA ممکن است به طور انتخابی تغییراتی را القا کند تا اینکه باعث اختلال گسترده در تنوع میکروبیوتای روده شود.
پیش از این نشان داده شده بود که نگهدارنده‌های غذایی مانند PPA فراوانی اجزای میکروبیوم روده را بدون تأثیر بر تنوع کلی تغییر می‌دهند (Nagpal و همکاران، 2021). در اینجا، ما برجسته‌ترین تفاوت‌ها را بین گونه‌های Bacteroidetes در شاخه Bacteroidetes (که قبلاً با نام Bacteroidetes شناخته می‌شد) مشاهده کردیم که در موش‌های در معرض PPA به طور قابل توجهی غنی شده بودند. افزایش فراوانی گونه‌های Bacteroides با افزایش تخریب مخاط همراه است که ممکن است خطر عفونت را افزایش داده و التهاب را تشدید کند (Cornick و همکاران، 2015؛ Desai و همکاران، 2016؛ Penzol و همکاران، 2019). یک مطالعه نشان داد که موش‌های نر نوزادی که با Bacteroides fragilis درمان شده‌اند، رفتارهای اجتماعی شبیه به اختلال طیف اوتیسم (ASD) از خود نشان می‌دهند (Carmel و همکاران، 2023) و مطالعات دیگر نشان داده‌اند که گونه‌های Bacteroides می‌توانند فعالیت ایمنی را تغییر داده و منجر به کاردیومیوپاتی التهابی خودایمنی شوند (Gil-Cruz و همکاران، 2019). گونه‌های متعلق به جنس‌های Ruminococcus، Prevotella و Parabacteroides نیز در موش‌های در معرض PPA به طور قابل توجهی افزایش یافتند (Coretti و همکاران، ۲۰۱۸). برخی از گونه‌های Ruminococcus از طریق تولید سیتوکین‌های پیش التهابی با بیماری‌هایی مانند بیماری کرون مرتبط هستند (Henke و همکاران، ۲۰۱۹)، در حالی که گونه‌های Prevotella مانند Prevotella humani با بیماری‌های متابولیکی مانند فشار خون بالا و حساسیت به انسولین مرتبط هستند (Pedersen و همکاران، ۲۰۱۶؛ Li و همکاران، ۲۰۱۷). در نهایت، ما دریافتیم که نسبت Bacteroidetes (که قبلاً با نام Firmicutes شناخته می‌شد) به Bacteroidetes در موش‌های در معرض PPA به طور قابل توجهی کمتر از موش‌های کنترل بود که به دلیل فراوانی کل بیشتر گونه‌های Bacteroidetes بود. پیش از این نشان داده شده است که این نسبت، شاخص مهمی برای هموستاز روده است و اختلال در این نسبت با انواع بیماری‌ها (Turpin و همکاران، ۲۰۱۶؛ Takezawa و همکاران، ۲۰۲۱؛ An و همکاران، ۲۰۲۳)، از جمله بیماری‌های التهابی روده (Stojanov و همکاران، ۲۰۲۰) مرتبط بوده است. در مجموع، به نظر می‌رسد گونه‌های شاخه Bacteroidetes بیشترین تأثیر را از افزایش PPA در رژیم غذایی می‌پذیرند. این ممکن است به دلیل تحمل بیشتر به PPA یا توانایی استفاده از PPA به عنوان منبع انرژی باشد، که نشان داده شده است حداقل برای یک گونه، Hoylesella enocea، صادق است (Hitch و همکاران، ۲۰۲۲). از طرف دیگر، قرار گرفتن مادر در معرض PPA ممکن است با حساس‌تر کردن روده فرزندان موش به کلونیزاسیون Bacteroidetes، رشد جنین را افزایش دهد. با این حال، طراحی مطالعه ما اجازه چنین ارزیابی را نداد.
ارزیابی محتوای متاژنومیک تفاوت‌های قابل توجهی را در فراوانی ژن‌های مرتبط با متابولیسم و ​​تولید PPA نشان داد، به طوری که موش‌های در معرض PPA فراوانی بیشتری از ژن‌های مسئول تولید PPA را نشان دادند، در حالی که موش‌های بدون مواجهه با PPA فراوانی بیشتری از ژن‌های مسئول متابولیسم PAA را نشان دادند (شکل 6). این نتایج نشان می‌دهد که تأثیر PPA بر ترکیب میکروبی ممکن است صرفاً به دلیل استفاده از آن نباشد، در غیر این صورت فراوانی ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA باید فراوانی بیشتری را در میکروبیوم روده موش‌های در معرض PPA نشان می‌داد. یک توضیح این است که PPA در درجه اول از طریق اثرات ضد میکروبی خود و نه از طریق استفاده از آن توسط باکتری‌ها به عنوان یک ماده مغذی، فراوانی باکتری‌ها را واسطه‌گری می‌کند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که PPA رشد سالمونلا تیفی موریوم را به صورت وابسته به دوز مهار می‌کند (Jacobson و همکاران، 2018). قرار گرفتن در معرض غلظت‌های بالاتر PPA ممکن است باکتری‌هایی را انتخاب کند که در برابر خواص ضد میکروبی آن مقاوم هستند و لزوماً قادر به متابولیسم یا تولید آن نیستند. برای مثال، چندین گونه پاراباکتروئیدس فراوانی قابل توجهی بالاتری در نمونه‌های PPA نشان دادند، اما هیچ ژنی مرتبط با متابولیسم یا تولید PPA شناسایی نشد (جداول تکمیلی 2، 4 و 5). علاوه بر این، تولید PPA به عنوان یک محصول جانبی تخمیر به طور گسترده در بین باکتری‌های مختلف توزیع شده است (Gonzalez-Garcia و همکاران، 2017). تنوع باکتریایی بیشتر ممکن است دلیل فراوانی بیشتر ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA در نمونه‌های کنترل باشد (Averina و همکاران، 2020). علاوه بر این، پیش‌بینی شد که تنها 27 (2.14٪) از 1332 ژن، ژن‌هایی باشند که منحصراً با متابولیسم PPA مرتبط هستند. بسیاری از ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA در سایر مسیرهای متابولیکی نیز دخیل هستند. این امر همچنین نشان می‌دهد که فراوانی ژن‌های دخیل در متابولیسم PPA در نمونه‌های کنترل بیشتر بوده است. این ژن‌ها ممکن است در مسیرهایی عمل کنند که منجر به استفاده یا تشکیل PPA به عنوان یک محصول جانبی نمی‌شوند. در این مورد، تنها یک ژن مرتبط با تولید PPA تفاوت‌های قابل توجهی در فراوانی بین انواع نمونه‌ها نشان داد. برخلاف ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA، ژن‌های نشانگر برای تولید PPA انتخاب شدند زیرا مستقیماً در مسیر باکتریایی تولید PPA دخیل هستند. در موش‌های در معرض PPA، مشخص شد که فراوانی و ظرفیت تولید PPA در همه گونه‌ها به طور قابل توجهی افزایش یافته است. این پیش‌بینی را تأیید می‌کند که PPAها تولیدکنندگان PPA را انتخاب می‌کنند و بنابراین پیش‌بینی می‌کنند که ظرفیت تولید PPA افزایش می‌یابد. با این حال، فراوانی ژن لزوماً با بیان ژن همبستگی ندارد. بنابراین، اگرچه فراوانی ژن‌های مرتبط با متابولیسم PPA در نمونه‌های کنترل بیشتر است، اما میزان بیان ممکن است متفاوت باشد (Shi et al., 2014). برای تأیید رابطه بین شیوع ژن‌های تولیدکننده PPA و تولید PPA، مطالعات بیان ژن‌های دخیل در تولید PPA مورد نیاز است.
حاشیه‌نویسی عملکردی متاژنوم‌های PPA و کنترل، برخی تفاوت‌ها را نشان داد. تجزیه و تحلیل PCA از محتوای ژن، خوشه‌های مجزایی را بین نمونه‌های PPA و کنترل نشان داد (شکل 5). خوشه‌بندی درون نمونه‌ای نشان داد که محتوای ژن کنترل متنوع‌تر است، در حالی که نمونه‌های PPA با هم خوشه‌بندی شدند. خوشه‌بندی بر اساس محتوای ژن با خوشه‌بندی بر اساس ترکیب گونه‌ها قابل مقایسه بود. بنابراین، تفاوت در فراوانی مسیر با تغییرات در فراوانی گونه‌ها و سویه‌های خاص درون آنها سازگار است. در نمونه‌های PPA، دو مسیر با فراوانی قابل توجه بالاتر مربوط به متابولیسم قند آمینه/نوکلئوتید (ko:K21279) و مسیرهای متعدد متابولیسم لیپید (ko:K00647، ko:K03801؛ جدول تکمیلی 3) بودند. ژن‌های مرتبط با ko:K21279 با جنس Bacteroides، یکی از جنس‌هایی که تعداد گونه‌های قابل توجه بیشتری در نمونه‌های PPA دارد، مرتبط هستند. این آنزیم می‌تواند با بیان پلی‌ساکاریدهای کپسولی از پاسخ ایمنی فرار کند (Wang et al., 2008). این ممکن است دلیل افزایش باکتریودت‌های مشاهده شده در موش‌های در معرض PPA باشد. این امر، افزایش سنتز اسیدهای چرب مشاهده شده در میکروبیوم PPA را تکمیل می‌کند. باکتری‌ها از مسیر FASIIko:K00647 (fabB) برای تولید اسیدهای چرب استفاده می‌کنند که ممکن است بر مسیرهای متابولیکی میزبان تأثیر بگذارد (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020) و تغییرات در متابولیسم لیپید ممکن است در رشد عصبی نقش داشته باشد (Yu et al., 2020). مسیر دیگری که فراوانی آن در نمونه‌های PPA افزایش یافته است، بیوسنتز هورمون استروئیدی بود (ko:K12343). شواهد فزاینده‌ای وجود دارد که نشان می‌دهد رابطه معکوسی بین توانایی میکروبیوتای روده برای تأثیرگذاری بر سطح هورمون‌ها و تحت تأثیر قرار گرفتن توسط هورمون‌ها وجود دارد، به طوری که افزایش سطح استروئید ممکن است پیامدهای سلامتی در پایین‌دست داشته باشد (Tetel et al., 2018).
این مطالعه بدون محدودیت‌ها و ملاحظات نیست. یک تمایز مهم این است که ما ارزیابی‌های فیزیولوژیکی از حیوانات انجام ندادیم. بنابراین، نمی‌توان مستقیماً نتیجه‌گیری کرد که آیا تغییرات در میکروبیوم با هر بیماری مرتبط است یا خیر. نکته دیگر این است که موش‌های این مطالعه با همان رژیم غذایی مادرانشان تغذیه شدند. مطالعات آینده ممکن است مشخص کند که آیا تغییر از رژیم غذایی غنی از PPA به رژیم غذایی بدون PPA اثرات آن را بر میکروبیوم بهبود می‌بخشد یا خیر. یکی از محدودیت‌های مطالعه ما، مانند بسیاری دیگر، اندازه نمونه محدود است. اگرچه می‌توان نتیجه‌گیری‌های معتبری گرفت، اما اندازه نمونه بزرگتر قدرت آماری بیشتری را هنگام تجزیه و تحلیل نتایج فراهم می‌کند. ما همچنین در مورد نتیجه‌گیری در مورد ارتباط بین تغییرات در میکروبیوم روده و هر بیماری محتاط هستیم (Yap و همکاران، 2021). عوامل مخدوش‌کننده از جمله سن، جنسیت و رژیم غذایی می‌توانند به طور قابل توجهی بر ترکیب میکروارگانیسم‌ها تأثیر بگذارند. این عوامل ممکن است تناقضات مشاهده شده در مقالات مربوط به ارتباط میکروبیوم روده با بیماری‌های پیچیده را توضیح دهند (Johnson و همکاران، 2019؛ Lagod and Naser، 2023). برای مثال، نشان داده شده است که اعضای جنس Bacteroidetes در حیوانات و انسان‌های مبتلا به ASD افزایش یا کاهش یافته‌اند (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). به طور مشابه، مطالعات ترکیب روده در بیماران مبتلا به بیماری‌های التهابی روده، هم افزایش و هم کاهش را در گونه‌های مشابه نشان داده‌اند (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). برای محدود کردن تأثیر سوگیری جنسیتی، سعی کردیم از نمایش برابر جنسیت‌ها اطمینان حاصل کنیم تا تفاوت‌ها به احتمال زیاد ناشی از رژیم غذایی باشند. یکی از چالش‌های حاشیه‌نویسی عملکردی، حذف توالی‌های ژنی اضافی است. روش خوشه‌بندی ژن ما به 95٪ یکسانی توالی و 85٪ شباهت طولی و همچنین 90٪ پوشش هم‌ترازی برای حذف خوشه‌بندی کاذب نیاز دارد. با این حال، در برخی موارد، COGهایی با حاشیه‌نویسی‌های یکسان (مثلاً MUT) مشاهده کردیم (شکل 6). مطالعات بیشتری برای تعیین اینکه آیا این ارتولوگ‌ها متمایز هستند، با جنس‌های خاص مرتبط هستند یا اینکه این محدودیتی در رویکرد خوشه‌بندی ژن است، مورد نیاز است. یکی دیگر از محدودیت‌های حاشیه‌نویسی عملکردی، طبقه‌بندی نادرست احتمالی است؛ ژن باکتریایی mmdA یک آنزیم شناخته شده است که در سنتز پروپیونات نقش دارد، اما KEGG آن را با مسیر متابولیکی پروپیونات مرتبط نمی‌کند. در مقابل، ارتولوگ‌های scpB و mmcD مرتبط هستند. تعداد زیاد ژن‌ها بدون حذفیات مشخص ممکن است منجر به عدم توانایی در شناسایی ژن‌های مرتبط با PPA هنگام ارزیابی فراوانی ژن شود. مطالعات آینده از تجزیه و تحلیل متاترنسکریپتوم بهره‌مند خواهند شد، که می‌تواند درک عمیق‌تری از ویژگی‌های عملکردی میکروبیوتای روده ارائه دهد و بیان ژن را به اثرات بالقوه پایین‌دستی مرتبط کند. برای مطالعات مربوط به اختلالات عصبی-رشدی خاص یا بیماری‌های التهابی روده، ارزیابی‌های فیزیولوژیکی و رفتاری حیوانات برای ارتباط تغییرات در ترکیب میکروبیوم با این اختلالات مورد نیاز است. مطالعات اضافی در مورد پیوند میکروبیوم روده به موش‌های بدون میکروب نیز برای تعیین اینکه آیا میکروبیوم عامل بیماری است یا ویژگی آن، مفید خواهد بود.
به طور خلاصه، ما نشان دادیم که PPA غذایی به عنوان عاملی در تغییر ترکیب میکروبیوتای روده عمل می‌کند. PPA یک ماده نگهدارنده مورد تایید FDA است که به طور گسترده در غذاهای مختلف یافت می‌شود و در صورت قرار گرفتن طولانی مدت در معرض آن، می‌تواند منجر به اختلال در فلور طبیعی روده شود. ما تغییراتی در فراوانی چندین باکتری یافتیم که نشان می‌دهد PPA می‌تواند بر ترکیب میکروبیوتای روده تأثیر بگذارد. تغییرات در میکروبیوتا می‌تواند منجر به تغییر در سطوح برخی از مسیرهای متابولیکی شود که می‌تواند منجر به تغییرات فیزیولوژیکی مرتبط با سلامت میزبان شود. مطالعات بیشتری برای تعیین اینکه آیا اثرات PPA غذایی بر ترکیب میکروبی می‌تواند منجر به دیسبیوز یا سایر بیماری‌ها شود، مورد نیاز است. این مطالعه پایه و اساس مطالعات آینده در مورد چگونگی تأثیر اثرات PPA بر ترکیب روده بر سلامت انسان را فراهم می‌کند.
مجموعه داده‌های ارائه شده در این مطالعه در مخازن آنلاین موجود است. نام مخزن و شماره دسترسی عبارتند از: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/، PRJNA1092431.
این مطالعه حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی دانشگاه مرکزی فلوریدا (UCF-IACUC) تأیید شده است (شماره مجوز استفاده از حیوانات: PROTO202000002). این مطالعه با قوانین، مقررات محلی و الزامات سازمانی مطابقت دارد.
NG: مفهوم‌سازی، گردآوری داده‌ها، تحلیل رسمی، تحقیق، روش‌شناسی، نرم‌افزار، مصورسازی، نگارش (پیش‌نویس اصلی)، نگارش (بررسی و ویرایش). LA: مفهوم‌سازی، گردآوری داده‌ها، روش‌شناسی، منابع، نگارش (بررسی و ویرایش). SH: تحلیل رسمی، نرم‌افزار، نگارش (بررسی و ویرایش). SA: تحقیق، نگارش (بررسی و ویرایش). داور ارشد: تحقیق، نگارش (بررسی و ویرایش). SN: مفهوم‌سازی، مدیریت پروژه، منابع، نظارت، نگارش (بررسی و ویرایش). TA: مفهوم‌سازی، مدیریت پروژه، نظارت، نگارش (بررسی و ویرایش).
نویسندگان اعلام کردند که هیچ گونه حمایت مالی برای تحقیق، تألیف و/یا انتشار این مقاله دریافت نکرده‌اند.
نویسندگان اعلام می‌کنند که این تحقیق در غیاب هرگونه روابط تجاری یا مالی که می‌تواند به عنوان تضاد منافع بالقوه تعبیر شود، انجام شده است. قابل اجرا نیست.
تمام نظرات بیان شده در این مقاله صرفاً نظرات نویسندگان است و لزوماً منعکس کننده دیدگاه‌های مؤسسات، ناشران، ویراستاران یا داوران آنها نیست. هیچ یک از محصولات ارزیابی شده در این مقاله یا هرگونه ادعایی که توسط تولیدکنندگان آنها مطرح شده است، توسط ناشر تضمین یا تأیید نشده است.
مطالب تکمیلی این مقاله را می‌توانید به صورت آنلاین در آدرس زیر بیابید: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS، Samsam A، Nasser SA (2019). اسید پروپیونیک با تنظیم مسیر PTEN/AKT در اختلالات طیف اوتیسم، باعث گلیوز و التهاب عصبی می‌شود. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
ایچیسون، جی. (1982). تحلیل آماری داده‌های ترکیبی. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44، 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
آن جی، کوون اچ، کیم وای جی (2023). نسبت فیرمیکوت‌ها/باکتروئیدت‌ها به عنوان یک عامل خطر برای سرطان سینه. مجله پزشکی بالینی، 12، 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
آندرس اس.، هوبر دبلیو. (2010). تحلیل بیان افتراقی داده‌های شمارش توالی. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
آنجلیس، MD، پیکولو، M.، وانینی، L.، سیراگوسا، S.، جیاکومو، AD، سرازانتی، DI، و همکاران. (2013). میکروبیوتای مدفوع و متابولوم در کودکان مبتلا به اوتیسم و ​​اختلال رشد فراگیر که در غیر این صورت مشخص نشده است. PloS One 8، e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
آورینا او. وی.، کووتون ای. اس.، پلیاکووا اس. آی.، ساویلووا ای. ام.، ربریکوف دی. وی.، دانیلنکو وی. ان. (۲۰۲۰). ویژگی‌های نورومتابولیک باکتریایی میکروبیوتای روده در کودکان خردسال مبتلا به اختلالات طیف اوتیسم. مجله میکروبیولوژی پزشکی ۶۹، ۵۵۸–۵۷۱. doi: 10.1099/jmm.0.001178
باکرو اف.، نومبلا کی. (۲۰۱۲). میکروبیوم به عنوان یک اندام انسانی. میکروبیولوژی و عفونت بالینی ۱۸، ۲–۴. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T.، Dürre P. (2023). بینش‌های جدید در مورد فیزیولوژی باکتری‌های تولیدکننده اسید پروپیونیک: Anaerotignum propionicum و Anaerotignum neopropionicum (که قبلاً Clostridium propionicum و Clostridium neopropionicum نامیده می‌شدند). میکروارگانیسم‌ها 11، 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW، Spencer TE، Wu G، Cudd TA، Meininger SJ (2004). تغذیه مادر و رشد جنین. J Nutr. 134، 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., and Hochberg, J. (1995). کنترل نرخ مثبت کاذب: یک رویکرد عملی و کارآمد برای آزمایش چندگانه. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x