متابولیت‌های تعدیل‌کننده سیستم ایمنی از ویژگی‌های کلیدی ریزمحیط تومور (TME) هستند، اما به جز چند مورد استثنا، هویت آنها تا حد زیادی ناشناخته مانده است. در اینجا، ما تومورها و سلول‌های T تومورها و آسیت بیماران مبتلا به کارسینوم سروز درجه بالا (HGSC) را تجزیه و تحلیل کردیم تا متابولوم این بخش‌های مختلف TME را آشکار کنیم. آسیت و سلول‌های توموری تفاوت‌های متابولیتی گسترده‌ای دارند. در مقایسه با آسیت، سلول‌های T نفوذکننده به تومور به طور قابل توجهی در 1-متیل نیکوتین آمید (MNA) غنی هستند. اگرچه سطح MNA در سلول‌های T بالا است، بیان نیکوتین آمید N-متیل ترانسفراز (آنزیمی که انتقال گروه‌های متیل از S-آدنوزیل متیونین به نیکوتین آمید را کاتالیز می‌کند) به فیبروبلاست‌ها و سلول‌های توموری محدود می‌شود. از نظر عملکردی، MNA سلول‌های T را وادار به ترشح فاکتور نکروز تومور آلفا، سیتوکین تقویت‌کننده تومور، می‌کند. بنابراین، MNA مشتق‌شده از ریزمحیط تومور (TME) در تنظیم ایمنی سلول‌های T نقش دارد و یک هدف ایمونوتراپی بالقوه برای درمان سرطان انسان است.
متابولیت‌های مشتق‌شده از تومور می‌توانند اثر مهاری عمیقی بر ایمنی ضد تومور داشته باشند و شواهد روزافزونی نشان می‌دهد که می‌توانند به عنوان نیروی محرکه کلیدی برای پیشرفت بیماری نیز عمل کنند (1). علاوه بر اثر واربورگ، کارهای اخیر برای توصیف وضعیت متابولیک سلول‌های تومور و ارتباط آن با وضعیت ایمنی ریزمحیط تومور (TME) آغاز شده است. مطالعات روی مدل‌های موشی و سلول‌های T انسانی نشان داده است که متابولیسم گلوتامین (2)، متابولیسم اکسیداتیو (3) و متابولیسم گلوکز (4) می‌توانند به طور مستقل بر روی زیرگروه‌های مختلف سلول‌های ایمنی عمل کنند. چندین متابولیت در این مسیرها عملکرد ضد توموری سلول‌های T را مهار می‌کنند. ثابت شده است که انسداد کوآنزیم تتراهیدروبیوپترین (BH4) می‌تواند به تکثیر سلول‌های T آسیب برساند و افزایش BH4 در بدن می‌تواند پاسخ ایمنی ضد توموری را که توسط CD4 و CD8 واسطه‌گری می‌شود، افزایش دهد. علاوه بر این، اثر سرکوب‌کننده سیستم ایمنی کینورنین را می‌توان با تجویز BH4 (5) جبران کرد. در گلیوبلاستومای جهش‌یافته ایزوسیترات دهیدروژناز (IDH)، ترشح انانتیومتابولیک (R)-2-هیدروکسی گلوتارات (R-2-HG) فعالیت فعال‌سازی، تکثیر و سیتولیز سلول T را مهار می‌کند (6). اخیراً نشان داده شده است که متیل گلیوکسال، یک محصول جانبی گلیکولیز، توسط سلول‌های سرکوبگر با منشأ میلوئیدی تولید می‌شود و انتقال متیل گلیوکسال توسط سلول‌های T می‌تواند عملکرد سلول‌های T مؤثر را مهار کند. در درمان، خنثی‌سازی متیل گلیوکسال می‌تواند بر فعالیت سلول‌های سرکوبگر مشتق از میلوئید (MDSC) غلبه کند و به طور هم افزایی درمان انسداد نقاط بازرسی را در مدل‌های موشی افزایش دهد (7). این مطالعات به طور کلی بر نقش کلیدی متابولیت‌های مشتق از TME در تنظیم عملکرد و فعالیت سلول T تأکید دارند.
اختلال عملکرد سلول T به طور گسترده در سرطان تخمدان گزارش شده است (8). این امر تا حدودی به دلیل ویژگی‌های متابولیک ذاتی هیپوکسی و عروق غیرطبیعی تومور است (9)، که منجر به تبدیل گلوکز و تریپتوفان به محصولات جانبی مانند اسید لاکتیک و کینورنین می‌شود. لاکتات خارج سلولی بیش از حد، تولید اینترفرون-γ (IFN-γ) را کاهش می‌دهد و تمایز زیرگروه‌های سرکوب‌کننده میلوئید را تحریک می‌کند (10، 11). مصرف تریپتوفان به طور مستقیم تکثیر سلول T را مهار می‌کند و سیگنالینگ گیرنده سلول T را مهار می‌کند (12-14). با وجود این مشاهدات، کارهای زیادی در مورد متابولیسم ایمنی در کشت آزمایشگاهی سلول T با استفاده از محیط‌های بهینه شده یا محدود به مدل‌های موشی همولوگ در داخل بدن انجام شده است، که هیچ یک از آنها به طور کامل ناهمگونی سرطان‌های انسانی و محیط‌های کلان و خرد فیزیولوژیکی را منعکس نمی‌کند.
یکی از ویژگی‌های رایج سرطان تخمدان، گسترش صفاقی و بروز آسیت است. تجمع مایع سلولی در آسیت با بیماری پیشرفته و پیش‌آگهی ضعیف مرتبط است (15). طبق گزارش‌ها، این بخش منحصر به فرد هیپوکسیک است، سطوح بالایی از فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) و ایندول‌آمین 2،3-دی‌اکسیژناز (IDO) دارد و توسط سلول‌های تنظیمی T و سلول‌های مهارکننده میلوئیدی نفوذ می‌کند (15-18). محیط متابولیک آسیت ممکن است با محیط خود تومور متفاوت باشد، بنابراین برنامه‌ریزی مجدد سلول‌های T در فضای صفاقی مشخص نیست. علاوه بر این، تفاوت‌های کلیدی و ناهمگونی بین آسیت و متابولیت‌های موجود در محیط تومور ممکن است مانع نفوذ سلول‌های ایمنی و عملکرد آنها بر تومورها شود و تحقیقات بیشتری مورد نیاز است.
برای حل این مشکلات، ما یک روش حساس جداسازی سلولی و طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم کروماتوگرافی مایع (LC-MS/MS) را برای مطالعه انواع مختلف سلول‌ها (از جمله سلول‌های T CD4+ و CD8+) و همچنین درون و بین تومورها طراحی کردیم. متابولیت‌های آن، سلول‌ها را در همان آسیت و محیط تومور بیمار در بر می‌گیرند. ما از این روش همراه با فلوسیتومتری با ابعاد بالا و توالی‌یابی RNA تک سلولی (scRNA-seq) استفاده می‌کنیم تا تصویری بسیار دقیق از وضعیت متابولیک این جمعیت‌های کلیدی ارائه دهیم. این روش افزایش قابل توجهی در سطح 1-متیل نیکوتین آمید (MNA) در سلول‌های T تومور نشان داد و آزمایش‌های آزمایشگاهی نشان داد که اثر تعدیل‌کننده سیستم ایمنی MNA بر عملکرد سلول T قبلاً ناشناخته بود. به طور کلی، این روش تعاملات متابولیکی متقابل بین تومورها و سلول‌های ایمنی را آشکار می‌کند و بینش‌های منحصر به فردی در مورد متابولیت‌های تنظیم ایمنی ارائه می‌دهد که ممکن است برای درمان فرصت‌های درمانی ایمونوتراپی سرطان تخمدان مبتنی بر سلول T مفید باشد.
ما از فلوسیتومتری با ابعاد بالا برای تعیین همزمان جذب گلوکز [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)] و فعالیت میتوکندریایی [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7، 19، 20) استفاده کردیم که نشانگرهای معمولی هستند که سلول‌های ایمنی و جمعیت‌های سلول‌های توموری را از هم متمایز می‌کنند (جدول S2 و شکل S1A). این تجزیه و تحلیل نشان داد که در مقایسه با سلول‌های T، آسیت و سلول‌های توموری سطح جذب گلوکز بالاتری دارند، اما تفاوت‌های کمتری در فعالیت میتوکندریایی دارند. میانگین جذب گلوکز سلول‌های توموری [CD45-EpCAM (EpCAM)+] سه تا چهار برابر سلول‌های T است و میانگین جذب گلوکز سلول‌های T CD4+ 1.2 برابر سلول‌های T CD8+ است، که نشان می‌دهد لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور (TIL) حتی در همان TME نیازهای متابولیکی متفاوتی دارند (شکل 1A). در مقابل، فعالیت میتوکندری در سلول‌های تومور مشابه سلول‌های T CD4+ است و فعالیت میتوکندری هر دو نوع سلول بیشتر از سلول‌های T CD8+ است (شکل 1B). به طور کلی، این نتایج سطح متابولیک را نشان می‌دهند. فعالیت متابولیک سلول‌های تومور بیشتر از سلول‌های T CD4+ است و فعالیت متابولیک سلول‌های T CD4+ بیشتر از سلول‌های T CD8+ است. با وجود این اثرات در انواع سلول‌ها، هیچ تفاوت ثابتی در وضعیت متابولیک سلول‌های T CD4+ و CD8+ یا نسبت‌های نسبی آنها در آسیت در مقایسه با تومورها وجود ندارد (شکل 1C). در مقابل، در بخش سلول‌های CD45، نسبت سلول‌های EpCAM+ در تومور در مقایسه با آسیت افزایش یافت (شکل 1D). ما همچنین تفاوت متابولیکی واضحی بین اجزای سلول‌های EpCAM+ و EpCAM- مشاهده کردیم. سلول‌های EpCAM+ (تومور) جذب گلوکز و فعالیت میتوکندری بیشتری نسبت به سلول‌های EpCAM- دارند که بسیار بیشتر از فعالیت متابولیک فیبروبلاست‌ها در سلول‌های تومور در TME است (شکل 1، E و F).
(الف و ب) شدت فلورسانس متوسط ​​(MFI) جذب گلوکز (2-NBDG) (الف) و فعالیت میتوکندریایی سلول‌های T CD4+ (MitoTracker قرمز تیره) (ب) نمودارهای نماینده (چپ) و داده‌های جدول‌بندی شده (راست)، سلول‌های T CD8+ و سلول‌های توموری EpCAM+ CD45 از آسیت و تومور. (ج) نسبت سلول‌های CD4+ و CD8+ (از سلول‌های T CD3+) در آسیت و تومور. (د) نسبت سلول‌های توموری EpCAM+ در آسیت و تومور (CD45−). (ه و ف) جذب گلوکز EpCAM+ CD45- تومور و EpCAM-CD45- ماتریس (2-NBDG) (ه) و فعالیت میتوکندریایی (MitoTracker قرمز تیره) (و) نمودارهای نماینده (چپ) و داده‌های جدول‌بندی شده (راست) آسیت و سلول‌های تومور. (ز) نمودارهای نماینده بیان CD25، CD137 و PD1 با استفاده از فلوسایتومتری. (H و I) بیان CD25، CD137 و PD1 بر روی سلول‌های CD4+ T (H) و سلول‌های CD8+ T (I). (J و K) فنوتیپ‌های ساده، حافظه مرکزی (Tcm)، مؤثر (Teff) و حافظه مؤثر (Tem) بر اساس بیان CCR7 و CD45RO. تصاویر نماینده (چپ) و داده‌های جدولی (راست) سلول‌های CD4+ T (J) و سلول‌های CD8+ T (K) در آسیت و تومورها. مقادیر P با استفاده از آزمون t زوجی تعیین شده‌اند (*P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001). خط نشان دهنده بیماران منطبق (n = 6) است. FMO، فلورسانس منهای یک؛ MFI، شدت فلورسانس متوسط.
تجزیه و تحلیل بیشتر، تفاوت‌های قابل توجه دیگری را بین وضعیت فنوتیپی سلول T با وضوح بالا نشان داد. حافظه فعال (شکل 1، G تا I) و حافظه مؤثر (شکل 1، J و K) در تومورها بسیار بیشتر از آسیت (نسبت سلول‌های T CD3+) است. به طور مشابه، تجزیه و تحلیل فنوتیپ با بیان نشانگرهای فعال‌سازی (CD25 و CD137) و نشانگرهای تخلیه [پروتئین مرگ سلولی برنامه‌ریزی‌شده 1 (PD1)] نشان داد که اگرچه ویژگی‌های متابولیکی این جمعیت‌ها متفاوت است (شکل S1، B تا E)، اما هیچ تفاوت متابولیکی قابل توجهی به طور مداوم بین زیرمجموعه‌های ساده، مؤثر یا حافظه مشاهده نشد (شکل S1، F تا I). این نتایج با استفاده از روش‌های یادگیری ماشین برای تعیین خودکار فنوتیپ‌های سلولی (21) تأیید شد، که بیشتر وجود تعداد زیادی از سلول‌های مغز استخوان (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) را در آسیت بیمار نشان داد (شکل S2A). در میان تمام انواع سلول‌های شناسایی‌شده، این جمعیت سلولی میلوئیدی بالاترین جذب گلوکز و فعالیت میتوکندریایی را نشان داد (شکل S2، B تا G). این نتایج، تفاوت‌های متابولیکی قوی بین انواع سلول‌های متعدد یافت‌شده در آسیت و تومورها در بیماران HGSC را برجسته می‌کند.
چالش اصلی در درک ویژگی‌های متابونومیک TIL، نیاز به جداسازی نمونه‌های سلول T با خلوص، کیفیت و کمیت کافی از تومورها است. مطالعات اخیر نشان داده‌اند که روش‌های مرتب‌سازی و غنی‌سازی دانه‌ای مبتنی بر فلوسیتومتری ممکن است منجر به تغییراتی در پروفایل‌های متابولیت سلولی شوند (22-24). برای غلبه بر این مشکل، ما روش غنی‌سازی دانه‌ای را برای جداسازی و ایزوله کردن TIL از سرطان تخمدان انسانی که با جراحی برداشته شده است، قبل از تجزیه و تحلیل توسط LC-MS/MS بهینه کردیم (به مواد و روش‌ها مراجعه کنید؛ شکل 2A). به منظور ارزیابی تأثیر کلی این پروتکل بر تغییرات متابولیت، پروفایل‌های متابولیت سلول‌های T فعال شده توسط اهداکنندگان سالم پس از مرحله جداسازی دانه‌ای فوق را با سلول‌هایی که جدا نشده بودند اما روی یخ باقی مانده بودند، مقایسه کردیم. این تجزیه و تحلیل کنترل کیفیت نشان داد که همبستگی بالایی بین این دو حالت وجود دارد (r = 0.77) و تکرارپذیری فنی گروه 86 متابولیت تکرارپذیری بالایی دارد (شکل 2B). بنابراین، این روش‌ها می‌توانند تجزیه و تحلیل متابولیت دقیقی را در سلول‌هایی که تحت غنی‌سازی نوع سلول قرار می‌گیرند، انجام دهند و بدین ترتیب اولین پلتفرم با وضوح بالا را برای شناسایی متابولیت‌های خاص در HGSC فراهم کنند و از این طریق افراد را قادر سازند تا درک عمیق‌تری از برنامه متابولیسم جنسی اختصاصی سلول به دست آورند.
(الف) نمودار شماتیک غنی‌سازی با مهره مغناطیسی. قبل از تجزیه و تحلیل توسط LC-MS/MS، سلول‌ها تحت سه دور متوالی غنی‌سازی با مهره مغناطیسی قرار می‌گیرند یا روی یخ باقی می‌مانند. (ب) تأثیر نوع غنی‌سازی بر فراوانی متابولیت‌ها. میانگین سه اندازه‌گیری برای هر نوع غنی‌سازی ± SE. خط خاکستری نشان دهنده رابطه 1:1 است. همبستگی درون کلاسی (ICC) اندازه‌گیری‌های مکرر در برچسب محور نشان داده شده است. NAD، نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید. (ج) نمودار شماتیک گردش کار تجزیه و تحلیل متابولیت‌های بیمار. آسیت یا تومورها از بیماران جمع‌آوری و منجمد می‌شوند. بخش کوچکی از هر نمونه با استفاده از فلوسیتومتری تجزیه و تحلیل شد، در حالی که نمونه‌های باقی مانده تحت سه دور غنی‌سازی برای سلول‌های CD4+، CD8+ و CD45- قرار گرفتند. این بخش‌های سلولی با استفاده از LC-MS/MS تجزیه و تحلیل شدند. (د) نقشه حرارتی فراوانی متابولیت‌های استاندارد شده. دندروگرام نشان دهنده خوشه‌بندی Ward از فواصل اقلیدسی بین نمونه‌ها است. (ه) تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) نقشه متابولیت نمونه، که سه تکرار از هر نمونه را نشان می‌دهد، نمونه‌هایی از یک بیمار با یک خط به هم متصل شده‌اند. (و) PCA از مشخصات متابولیت نمونه مشروط به بیمار (یعنی با استفاده از افزونگی جزئی)؛ نوع نمونه توسط پوسته محدب محدود شده است. PC1، مؤلفه اصلی 1؛ PC2، مؤلفه اصلی 2.
در مرحله بعد، ما این روش غنی‌سازی را برای تجزیه و تحلیل 99 متابولیت در بخش‌های سلول‌های CD4+، CD8+ و CD45 در آسیت اولیه و تومورهای شش بیمار مبتلا به HGSC اعمال کردیم (شکل 2C، شکل S3A و جداول S3 و S4). جمعیت مورد نظر 2 تا 70 درصد از نمونه بزرگ اولیه سلول‌های زنده را تشکیل می‌دهد و نسبت سلول‌ها بین بیماران بسیار متفاوت است. پس از جداسازی دانه‌ها، بخش غنی‌شده مورد نظر (CD4+، CD8+ یا CD45-) به طور متوسط ​​بیش از 85 درصد از کل سلول‌های زنده در نمونه را تشکیل می‌دهد. این روش غنی‌سازی به ما امکان می‌دهد جمعیت‌های سلولی را از متابولیسم بافت تومور انسان تجزیه و تحلیل کنیم، که انجام آن از نمونه‌های بزرگ غیرممکن است. با استفاده از این پروتکل، مشخص کردیم که l-kynurenine و آدنوزین، این دو متابولیت سرکوب‌کننده سیستم ایمنی که به خوبی شناخته شده‌اند، در سلول‌های T تومور یا سلول‌های تومور افزایش یافته‌اند (شکل S3، B و C). بنابراین، این نتایج، دقت و توانایی فناوری جداسازی سلولی و طیف‌سنجی جرمی ما را در یافتن متابولیت‌های مهم بیولوژیکی در بافت‌های بیمار نشان می‌دهد.
تجزیه و تحلیل ما همچنین جدایی متابولیکی قوی انواع سلول‌ها را در داخل و بین بیماران نشان داد (شکل 2D و شکل S4A). به طور خاص، در مقایسه با سایر بیماران، بیمار 70 ویژگی‌های متابولیکی متفاوتی را نشان داد (شکل 2E و شکل S4B)، که نشان می‌دهد ممکن است ناهمگونی متابولیکی قابل توجهی بین بیماران وجود داشته باشد. شایان ذکر است که در مقایسه با سایر بیماران (1.2 تا 2 لیتر؛ جدول S1)، مقدار کل آسیت جمع‌آوری‌شده در بیمار 70 (80 میلی‌لیتر) کمتر بود. کنترل ناهمگونی بین بیماران در طول تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی (به عنوان مثال، با استفاده از تجزیه و تحلیل افزونگی جزئی) تغییرات مداومی را بین انواع سلول‌ها نشان می‌دهد و انواع سلول‌ها و/یا ریزمحیط به وضوح طبق مشخصات متابولیت‌ها تجمیع می‌شوند (شکل 2F). تجزیه و تحلیل متابولیت‌های منفرد بر این اثرات تأکید کرد و تفاوت‌های قابل توجهی را بین انواع سلول‌ها و ریزمحیط نشان داد. شایان ذکر است که شدیدترین تفاوت مشاهده شده MNA است که معمولاً در سلول‌های CD45- و در سلول‌های CD4+ و CD8+ که به تومور نفوذ می‌کنند، غنی شده است (شکل 3A). برای سلول‌های CD4+، این اثر بسیار واضح است و به نظر می‌رسد MNA در سلول‌های CD8+ نیز به شدت تحت تأثیر محیط قرار می‌گیرد. با این حال، این مهم نیست، زیرا تنها سه نفر از شش بیمار می‌توانند از نظر نمرات CD8+ تومور ارزیابی شوند. علاوه بر MNA، در انواع مختلف سلول‌ها در آسیت و تومورها، متابولیت‌های دیگری که در TIL به خوبی مشخص نشده‌اند نیز به طور متفاوتی غنی هستند (شکل‌های S3 و S4). بنابراین، این داده‌ها مجموعه‌ای امیدوارکننده از متابولیت‌های تعدیل‌کننده سیستم ایمنی را برای تحقیقات بیشتر نشان می‌دهند.
(الف) محتوای نرمال‌شده MNA در سلول‌های CD4+، CD8+ و CD45- از آسیت و تومور. نمودار جعبه‌ای، میانه (خط)، دامنه بین چارکی (لولا قاب) و دامنه داده‌ها را تا 1.5 برابر دامنه بین چارکی (شاخک قاب) نشان می‌دهد. همانطور که در مواد و روش‌های بیمار توضیح داده شده است، از مقدار لیما بیمار برای تعیین مقدار P استفاده کنید (*P<0.05 و **P<0.01). (ب) نمودار شماتیک متابولیسم MNA (60). متابولیت‌ها: S-آدنوزیل-1-متیونین؛ SAH، S-آدنوزین-1-هموسیستئین؛ NA، نیکوتین‌آمید؛ MNA، 1-متیل‌نیکوتین‌آمید؛ 2-PY، 1-متیل-2-پیریدون-5-کربوکسامید؛ 4-PY، 1-متیل-4-پیریدون-5-کربوکسامید؛ NR، نیکوتین‌آمید ریبوز؛ NMN، نیکوتین‌آمید مونونوکلئوتید. آنزیم‌ها (سبز): NNMT، نیکوتین‌آمید N-متیل‌ترانسفراز؛ SIRT، سیرتوئین‌ها؛ NAMPT، نیکوتین‌آمید فسفوریبوزیل ترانسفراز؛ AOX1، آلدهید اکسیداز 1؛ NRK، نیکوتین‌آمید ریبوزید کیناز؛ NMNAT، نیکوتین‌آمید مونو نوکلئوتید آدنیلات ترانسفراز؛ Pnp1، پورین نوکلئوزید فسفوریلاز. (C) t-SNE مربوط به scRNA-seq آسیت (خاکستری) و تومور (قرمز؛ n = 3 بیمار). (D) بیان NNMT در جمعیت‌های سلولی مختلف شناسایی شده با استفاده از scRNA-seq. (E) بیان NNMT و AOX1 در SK-OV-3، کلیه جنینی انسان (HEK) 293T، سلول‌های T و سلول‌های T تیمار شده با MNA. بیان تاخورده نسبت به SK-OV-3 نشان داده شده است. الگوی بیان با SEM نشان داده شده است (n = 6 اهداکننده سالم). مقادیر Ct بیشتر از 35 غیرقابل تشخیص در نظر گرفته می‌شوند (UD). (F) بیان SLC22A1 و SLC22A2 در سلول‌های SK-OV-3، HEK293T، T و سلول‌های T تیمار شده با 8 میلی‌مولار MNA. بیان تاخورده نسبت به SK-OV-3 نشان داده شده است. الگوی بیان با SEM نشان داده شده است (n = 6 اهداکننده سالم). مقادیر Ct بیشتر از 35 غیرقابل تشخیص در نظر گرفته می‌شوند (UD). (G) محتوای MNA سلولی در سلول‌های T اهداکننده سالم فعال شده پس از 72 ساعت انکوباسیون با MNA. الگوی بیان با SEM نشان داده شده است (n = 4 اهداکننده سالم).
MNA با انتقال گروه متیل از S-آدنوزیل-1-متیونین (SAM) به نیکوتین‌آمید (NA) توسط نیکوتین‌آمید N-متیل‌ترانسفراز (NNMT؛ شکل 3B) تولید می‌شود. NNMT در انواع سرطان‌های انسانی بیش از حد بیان می‌شود و با تکثیر، تهاجم و متاستاز مرتبط است (25-27). برای درک بهتر منبع MNA در سلول‌های T در تومور خوش‌خیم توموری (TME)، ما از scRNA-seq برای توصیف بیان NNMT در انواع سلول‌ها در آسیت و تومورهای سه بیمار HGSC استفاده کردیم (جدول S5). تجزیه و تحلیل تقریباً 6500 سلول نشان داد که در محیط‌های آسیت و تومور، بیان NNMT به جمعیت‌های فیبروبلاست و سلول‌های توموری فرضی محدود شده است (شکل 3، C و D). شایان ذکر است که هیچ بیان واضحی از NNMT در هیچ جمعیتی که PTPRC (CD45+) را بیان می‌کند، وجود ندارد (شکل 3D و شکل S5A)، که نشان می‌دهد MNA شناسایی شده در طیف متابولیت به سلول‌های T وارد شده است. بیان آلدهید اکسیداز 1 (AOX1) MNA را به 1-متیل-2-پیریدون-5-کربوکسامید (2-PYR) یا 1-متیل-4-پیریدون-5-کربوکسامید (4-PYR) تبدیل می‌کند؛ شکل 3B) همچنین به جمعیت فیبروبلاست‌های بیان‌کننده COL1A1 محدود می‌شود (شکل S5A)، که در مجموع نشان می‌دهد سلول‌های T فاقد توانایی متابولیسم MNA معمولی هستند. الگوی بیان این ژن‌های مرتبط با MNA با استفاده از یک مجموعه داده سلولی مستقل دوم از آسیت بیماران HGSC تأیید شد (شکل S5B؛ n = 6) (16). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی (qPCR) سلول‌های T اهداکننده سالم تحت درمان با MNA نشان داد که در مقایسه با سلول‌های تومور تخمدان SK-OV-3 کنترل، NNMT یا AOX1 تقریباً بیان نشده بودند (شکل 3E). این نتایج غیرمنتظره نشان می‌دهد که MNA ممکن است از فیبروبلاست‌ها یا تومورها به سلول‌های T مجاور در TME ترشح شود.
اگرچه کاندیداها شامل خانواده ناقل‌های کاتیون آلی 1 تا 3 (OCT1، OCT2 و OCT3) هستند که توسط خانواده ناقل محلول 22 (SLC22) (SLC22A1، SLC22A2 و SLC22A3) کدگذاری می‌شوند، ناقل‌های بالقوه MNA هنوز مشخص نشده‌اند (28). QPCR از mRNA از سلول‌های T اهداکننده سالم، سطوح بیان پایین SLC22A1 اما سطوح غیرقابل تشخیص SLC22A2 را نشان داد، که تأیید کرد که قبلاً در مقالات گزارش شده است (شکل 3F) (29). در مقابل، رده سلولی تومور تخمدان SK-OV-3 سطوح بالایی از هر دو ناقل را بیان کرد (شکل 3F).
به منظور بررسی احتمال توانایی سلول‌های T در جذب MNA خارجی، سلول‌های T اهداکننده سالم به مدت ۷۲ ساعت در حضور غلظت‌های مختلف MNA کشت داده شدند. در غیاب MNA خارجی، محتوای سلولی MNA قابل تشخیص نیست (شکل ۳G). با این حال، سلول‌های T فعال شده تحت درمان با MNA خارجی، افزایش وابسته به دوز در محتوای MNA در سلول‌ها، تا ۶ میلی‌مولار MNA، را نشان دادند (شکل ۳G). این نتیجه نشان می‌دهد که علیرغم سطح پایین بیان ناقل و عدم وجود آنزیم اصلی مسئول متابولیسم MNA درون سلولی، TIL هنوز هم می‌تواند MNA را جذب کند.
طیف متابولیت‌ها در سلول‌های T بیماران و آزمایش‌های جذب MNA در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، احتمال ترشح MNA توسط فیبروبلاست‌های مرتبط با سرطان (CAF) و تنظیم فنوتیپ و عملکرد TIL توسط سلول‌های توموری را افزایش می‌دهد. برای تعیین اثر MNA بر سلول‌های T، سلول‌های T اهداکننده سالم در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) در حضور یا عدم حضور MNA فعال شدند و تکثیر و تولید سیتوکین آنها ارزیابی شد. پس از 7 روز اضافه کردن MNA در بالاترین دوز، تعداد دو برابر شدن جمعیت به طور متوسط ​​کاهش یافت، در حالی که قدرت رشد در همه دوزها حفظ شد (شکل 4A). علاوه بر این، درمان MNA اگزوژن منجر به افزایش نسبت سلول‌های T CD4+ و CD8+ بیان‌کننده فاکتور نکروز تومور-α (TNFα؛ شکل 4B) شد. در مقابل، تولید درون سلولی IFN-γ به طور قابل توجهی در سلول‌های T CD4+ کاهش یافت، اما در سلول‌های T CD8+ کاهش نیافت و تغییر قابل توجهی در اینترلوکین 2 (IL-2؛ شکل 4، C و D) مشاهده نشد. بنابراین، سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) از مایع رویی این کشت‌های سلول T تیمار شده با MNA، افزایش قابل توجهی در TNFα، کاهش در IFN-γ و عدم تغییر در IL-2 را نشان داد (شکل 4، E تا G). کاهش IFN-γ نشان می‌دهد که MNA ممکن است در مهار فعالیت ضد توموری سلول‌های T نقش داشته باشد. به منظور شبیه‌سازی اثر MNA بر سمیت سلولی ناشی از سلول T، سلول‌های گیرنده آنتی‌ژن کایمریک T (FRα-CAR-T) که گیرنده فولات α را هدف قرار می‌دهند و سلول‌های CAR-T (GFP) که توسط پروتئین فلورسنت سبز (GFP)-CAR-T) تنظیم می‌شوند، توسط سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMC) اهداکننده سالم تولید می‌شوند. سلول‌های CAR-T به مدت 24 ساعت در حضور MNA کشت داده شدند و سپس با سلول‌های تومور تخمدان SK-OV-3 انسانی که گیرنده فولات α را بیان می‌کنند، با نسبت مؤثر به هدف 10:1 هم‌کشت داده شدند. درمان با MNA منجر به کاهش قابل توجهی در فعالیت کشندگی سلول‌های FRα-CAR-T شد، که مشابه سلول‌های FRα-CAR-T درمان شده با آدنوزین بود (شکل 4H).
(الف) تعداد کل سلول‌های زنده و دو برابر شدن جمعیت (PD) مستقیماً از کشت در روز 7. نمودار میله‌ای نشان دهنده میانگین + SEM شش اهداکننده سالم است. نشان دهنده داده‌های حداقل n = 3 آزمایش مستقل است. (ب تا د) CD3/CD28 و IL-2 برای فعال کردن سلول‌های T در غلظت‌های MNA مربوطه به مدت 7 روز استفاده شدند. قبل از تجزیه و تحلیل، سلول‌ها به مدت 4 ساعت با PMA/یونومایسین با GolgiStop تحریک شدند. بیان TNFα (B) در سلول‌های T. تصویر نمونه (چپ) و داده‌های جدولی (راست) از بیان TNFα در سلول‌های زنده. بیان IFN-γ (C) و IL-2 (D) در سلول‌های T. بیان سیتوکین‌ها با فلوسیتومتری اندازه‌گیری شد. نمودار میله‌ای نشان دهنده میانگین (n = 6 اهداکننده سالم) + SEM است. از آنالیز واریانس یک طرفه و اندازه‌گیری‌های مکرر (*P<0.05 و **P<0.01) برای تعیین مقدار P استفاده کنید. نشان دهنده داده‌های حداقل n = 3 آزمایش مستقل است. (E تا G) CD3/CD28 و IL-2 برای فعال کردن سلول‌های T در غلظت‌های MNA مربوطه به مدت 7 روز استفاده شدند. محیط کشت قبل و بعد از 4 ساعت تحریک PMA/یونومایسین جمع‌آوری شد. غلظت TNFα (E)، IFN-γ (F) و IL-2 (G) با روش ELISA اندازه‌گیری شدند. نمودار میله‌ای نشان دهنده میانگین (n = 5 اهداکننده سالم) + SEM است. مقدار P با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و اندازه‌گیری‌های مکرر تعیین شد (*P<0.05). خط نقطه‌چین نشان دهنده حد تشخیص تشخیص است. (H) سنجش لیز سلولی. سلول‌های FRα-CAR-T یا GFP-CAR-T با آدنوزین (250 میکرومولار) یا MNA (10 میلی‌مولار) به مدت 24 ساعت تنظیم شدند، یا بدون درمان رها شدند (Ctrl). درصد کشته شدن سلول‌های SK-OV-3 اندازه‌گیری شد. مقدار P با استفاده از آزمون Welch t تعیین شد (*P<0.5 و **P<0.01).
به منظور دستیابی به درک مکانیسمی از تنظیم بیان TNFα وابسته به MNA، تغییرات در mRNAی TNFα سلول‌های T تیمار شده با MNA ارزیابی شد (شکل 5A). سلول‌های T اهداکننده سالم تیمار شده با MNA افزایش دو برابری در سطح رونویسی TNFα نشان دادند که نشان می‌دهد MNA به تنظیم رونویسی TNFα وابسته است. برای بررسی این مکانیسم تنظیمی احتمالی، دو فاکتور رونویسی شناخته شده که TNFα را تنظیم می‌کنند، یعنی فاکتور هسته‌ای سلول T فعال شده (NFAT) و پروتئین خاص 1 (Sp1)، در پاسخ به اتصال MNA به پروموتر پروگزیمال TNFα ارزیابی شدند (30). پروموتر TNFα شامل 6 جایگاه اتصال NFAT شناسایی شده و 2 جایگاه اتصال Sp1 است که در یک جایگاه [-55 جفت باز (bp) از 5'cap] همپوشانی دارند (30). ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین (ChIP) نشان داد که هنگام تیمار با MNA، اتصال Sp1 به پروموتر TNFα سه برابر افزایش می‌یابد. همچنین ترکیب NFAT افزایش یافته و به اهمیت آن نزدیک شده است (شکل 5B). این داده‌ها نشان می‌دهد که MNA بیان TNFα را از طریق رونویسی Sp1 و تا حد کمتری بیان NFAT تنظیم می‌کند.
(الف) در مقایسه با سلول‌های T کشت‌شده بدون MNA، تغییر چند برابری بیان TNFα در سلول‌های T تیمار شده با MNA. الگوی بیان با SEM نشان داده شده است (n = 5 اهداکننده سالم). داده‌های حداقل n = 3 آزمایش مستقل را نشان می‌دهد. (ب) پروموتر TNFα سلول‌های T تیمار شده با یا بدون 8 میلی‌مولار MNA پس از NFAT و Sp1 با (Ctrl) و تحریک PMA/یونومایسین به مدت 4 ساعت ترکیب شدند. ایمونوگلوبولین G (IgG) و H3 به ترتیب به عنوان کنترل منفی و مثبت برای ایمونوپرسیپیتاسیون استفاده شدند. کمی‌سازی ChIP نشان داد که اتصال Sp1 و NFAT به پروموتر TNFα در سلول‌های تیمار شده با MNA در مقایسه با کنترل چندین برابر افزایش یافته است. داده‌های حداقل n = 3 آزمایش مستقل را نشان می‌دهد. مقدار P با آزمون‌های t چندگانه تعیین شد (*** P <0.01). (ج) در مقایسه با آسیت HGSC، سلول‌های T (غیر سیتوتوکسیک) افزایش بیان TNF را در تومور نشان دادند. رنگ‌ها نشان‌دهنده بیماران مختلف هستند. سلول‌های نمایش داده شده به صورت تصادفی به تعداد ۳۰۰ نمونه‌برداری شده و برای محدود کردن برداشت بیش از حد، تنظیم شده‌اند (** Padj = 0.0076). (D) مدل پیشنهادی MNA برای سرطان تخمدان. MNA در سلول‌های تومور و فیبروبلاست‌ها در TME تولید می‌شود و توسط سلول‌های T جذب می‌شود. MNA اتصال Sp1 به پروموتر TNFα را افزایش می‌دهد و منجر به افزایش رونویسی TNFα و تولید سیتوکین TNFα می‌شود. MNA همچنین باعث کاهش IFN-γ می‌شود. مهار عملکرد سلول T منجر به کاهش توانایی کشتن و تسریع رشد تومور می‌شود.
طبق گزارش‌ها، TNFα اثرات ضد توموری و ضد توموری وابسته به جلو و عقب دارد، اما نقش شناخته‌شده‌ای در پیشبرد رشد و متاستاز سرطان تخمدان دارد (31-33). طبق گزارش‌ها، غلظت TNFα در آسیت و بافت‌های توموری در بیماران مبتلا به سرطان تخمدان بیشتر از بافت‌های خوش‌خیم است (34-36). از نظر مکانیسم، TNFα می‌تواند فعال‌سازی، عملکرد و تکثیر گلبول‌های سفید خون را تنظیم کند و فنوتیپ سلول‌های سرطانی را تغییر دهد (37، 38). مطابق با این یافته‌ها، تجزیه و تحلیل بیان ژن افتراقی نشان داد که TNF در سلول‌های T در بافت‌های توموری در مقایسه با آسیت به طور قابل توجهی افزایش یافته است (شکل 5C). افزایش بیان TNF فقط در جمعیت‌های سلول T با فنوتیپ غیر سیتوتوکسیک مشهود بود (شکل S5A). به طور خلاصه، این داده‌ها از این دیدگاه پشتیبانی می‌کنند که MNA دارای اثرات دوگانه سرکوب‌کننده سیستم ایمنی و تقویت‌کننده تومور در HGSC است.
برچسب‌گذاری فلورسنت بر اساس فلوسیتومتری به روش اصلی برای مطالعه متابولیسم TIL تبدیل شده است. این مطالعات نشان داده‌اند که در مقایسه با لنفوسیت‌های خون محیطی یا سلول‌های T از اندام‌های لنفاوی ثانویه، TIL موشی و انسانی تمایل بیشتری به جذب گلوکز (4، 39) و از دست دادن تدریجی عملکرد میتوکندری دارند (19، 40). اگرچه ما در این مطالعه نتایج مشابهی را مشاهده کرده‌ایم، اما پیشرفت کلیدی، مقایسه متابولیسم سلول‌های توموری و TIL از همان بافت توموری برداشته شده است. مطابق با برخی از این گزارش‌های قبلی، سلول‌های توموری (CD45-EpCAM +) از آسیت و تومورها جذب گلوکز بالاتری نسبت به سلول‌های T CD8 + و CD4 + دارند، که نشان می‌دهد جذب بالای گلوکز سلول‌های توموری را می‌توان با سلول‌های T مقایسه کرد. مفهوم رقابت سلول‌های T. TME. با این حال، فعالیت میتوکندری سلول‌های توموری بیشتر از سلول‌های T CD8 + است، اما فعالیت میتوکندری مشابه سلول‌های T CD4 + است. این نتایج، موضوع نوظهور را تقویت می‌کند که متابولیسم اکسیداتیو برای سلول‌های توموری مهم است (41، 42). آنها همچنین نشان می‌دهند که سلول‌های T CD8+ ممکن است نسبت به سلول‌های T CD4+ بیشتر مستعد اختلال عملکرد اکسیداتیو باشند، یا اینکه سلول‌های T CD4+ ممکن است از منابع کربنی غیر از گلوکز برای حفظ فعالیت میتوکندری استفاده کنند (43، 44). لازم به ذکر است که ما هیچ تفاوتی در جذب گلوکز یا فعالیت میتوکندری بین سلول‌های مؤثر CD4+ T، سلول‌های حافظه مؤثر T و سلول‌های حافظه مرکزی T در آسیت مشاهده نکردیم. به طور مشابه، وضعیت تمایز سلول‌های T CD8+ در تومورها هیچ ارتباطی با تغییرات در جذب گلوکز ندارد و تفاوت معنی‌دار بین سلول‌های T کشت شده در شرایط آزمایشگاهی و سلول‌های TIL انسانی در داخل بدن را برجسته می‌کند (22). این مشاهدات همچنین با استفاده از تخصیص خودکار جمعیت سلولی بی‌طرفانه تأیید شد، که بیشتر نشان داد سلول‌های CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ با جذب گلوکز و فعالیت میتوکندریایی بالاتر نسبت به سلول‌های تومور شایع هستند اما جمعیت سلولی فعال متابولیکی دارند. این جمعیت ممکن است نشان دهنده زیرجمعیت احتمالی سلول‌های سرکوبگر میلوئیدی یا سلول‌های دندریتیک پلاسماسیتوئیدی باشد که در تجزیه و تحلیل scRNA-seq شناسایی شده‌اند. اگرچه هر دوی این موارد در تومورهای تخمدان انسان گزارش شده‌اند [45]، اما هنوز به کار بیشتری برای توصیف این زیرجمعیت میلوئیدی نیاز دارند.
اگرچه روش‌های مبتنی بر فلوسیتومتری می‌توانند تفاوت‌های کلی در متابولیسم گلوکز و اکسیداتیو بین انواع سلول‌ها را روشن کنند، متابولیت‌های دقیق تولید شده توسط گلوکز یا سایر منابع کربن برای متابولیسم میتوکندری در TME هنوز مشخص نشده‌اند. اختصاص دادن وجود یا عدم وجود متابولیت‌ها به یک زیرمجموعه TIL مشخص، نیاز به خالص‌سازی جمعیت سلولی از بافت برداشته شده دارد. بنابراین، روش غنی‌سازی سلولی ما همراه با طیف‌سنجی جرمی می‌تواند بینش‌هایی را در مورد متابولیت‌هایی که به طور متفاوتی در سلول‌های T و جمعیت‌های سلول‌های توموری در نمونه‌های بیمار تطبیق یافته غنی شده‌اند، ارائه دهد. اگرچه این روش نسبت به مرتب‌سازی سلول‌های فعال‌شده با فلورسانس مزایایی دارد، اما کتابخانه‌های متابولیتی خاصی ممکن است به دلیل پایداری ذاتی و/یا سرعت گردش سریع تحت تأثیر قرار گیرند (22). با این وجود، روش ما توانست دو متابولیت سرکوب‌کننده سیستم ایمنی شناخته شده، آدنوزین و کینورنین، را شناسایی کند، زیرا آنها بین انواع نمونه‌ها بسیار متفاوت هستند.
تجزیه و تحلیل متابونومیک ما از تومورها و زیرگروه‌های TIL، بینش بیشتری در مورد نقش متابولیت‌ها در TME تخمدان ارائه می‌دهد. اولاً، با استفاده از فلوسیتومتری، مشخص کردیم که هیچ تفاوتی در فعالیت میتوکندری بین تومورها و سلول‌های T CD4 + وجود ندارد. با این حال، تجزیه و تحلیل LC-MS/MS تغییرات قابل توجهی را در فراوانی متابولیت‌ها در بین این جمعیت‌ها نشان داد، که نشان می‌دهد نتیجه‌گیری در مورد متابولیسم TIL و فعالیت متابولیکی کلی آن نیاز به تفسیر دقیق دارد. ثانیاً، MNA متابولیتی است که بیشترین تفاوت را بین سلول‌های CD45 و سلول‌های T در آسیت دارد، نه تومورها. بنابراین، بخش‌بندی و محل تومور ممکن است اثرات متفاوتی بر متابولیسم TIL داشته باشد، که ناهمگونی احتمالی در یک ریزمحیط مشخص را برجسته می‌کند. ثالثاً، بیان آنزیم تولیدکننده MNA، NNMT، عمدتاً به CAF محدود می‌شود، که سلول‌های توموری به میزان کمتری هستند، اما سطوح MNA قابل تشخیص در سلول‌های T مشتق از تومور مشاهده می‌شود. بیان بیش از حد NNMT در CAF تخمدانی، یک اثر شناخته شده در ایجاد سرطان دارد که تا حدودی به دلیل تقویت متابولیسم CAF، تهاجم تومور و متاستاز است (27). اگرچه سطح کلی TIL متوسط ​​است، بیان NNMT در CAF ارتباط نزدیکی با زیرگروه مزانشیمی اطلس ژنوم سرطان (TCGA) دارد که با پیش آگهی ضعیف همراه است (27، 46، 47). در نهایت، بیان آنزیم AOX1 که مسئول تخریب MNA است نیز به جمعیت CAF محدود می‌شود، که نشان می‌دهد سلول‌های T توانایی متابولیسم MNA را ندارند. این نتایج از این ایده پشتیبانی می‌کند که اگرچه برای تأیید این یافته به کار بیشتری نیاز است، اما سطح بالای MNA در سلول‌های T ممکن است نشان دهنده وجود یک ریزمحیط سرکوب کننده سیستم ایمنی CAF باشد.
با توجه به سطح بیان پایین ناقل‌های MNA و سطوح غیرقابل تشخیص پروتئین‌های کلیدی دخیل در متابولیسم MNA، وجود MNA در سلول‌های T غیرمنتظره است. نه NNMT و نه AOX1 را نمی‌توان با آنالیز scRNA-seq و qPCR هدفمند دو گروه مستقل شناسایی کرد. این نتایج نشان می‌دهد که MNA توسط سلول‌های T سنتز نمی‌شود، بلکه از TME اطراف جذب می‌شود. آزمایش‌های آزمایشگاهی نشان می‌دهد که سلول‌های T تمایل به تجمع MNA اگزوژن دارند.
مطالعات آزمایشگاهی ما نشان داده است که MNA اگزوژن بیان TNFα را در سلول‌های T القا می‌کند و اتصال Sp1 به پروموتر TNFα را افزایش می‌دهد. اگرچه TNFα هم عملکرد ضد توموری و هم ضد توموری دارد، اما در سرطان تخمدان، TNFα می‌تواند رشد سرطان تخمدان را افزایش دهد (31-33). خنثی‌سازی TNFα در کشت سلول‌های تومور تخمدان یا حذف سیگنال TNFα در مدل‌های موشی می‌تواند تولید سیتوکین التهابی با واسطه TNFα را بهبود بخشد و رشد تومور را مهار کند (32، 35). بنابراین، در این مورد، MNA مشتق شده از TME می‌تواند از طریق یک مکانیسم وابسته به TNFα از طریق حلقه اتوکرین به عنوان یک متابولیت پیش‌التهابی عمل کند و در نتیجه باعث بروز و گسترش سرطان تخمدان شود (31). بر اساس این احتمال، مسدود کردن TNFα به عنوان یک عامل درمانی بالقوه برای سرطان تخمدان در حال مطالعه است (37، 48، 49). علاوه بر این، MNA سمیت سلولی سلول‌های CAR-T را به سلول‌های تومور تخمدان مختل می‌کند و شواهد بیشتری برای سرکوب ایمنی با واسطه MNA ارائه می‌دهد. در مجموع، این نتایج مدلی را نشان می‌دهد که در آن تومورها و سلول‌های CAF، MNA را به داخل TME خارج سلولی ترشح می‌کنند. از طریق (i) تحریک رشد سرطان تخمدان ناشی از TNF و (ii) مهار فعالیت سیتوتوکسیک سلول T ناشی از MNA، این امر ممکن است اثر دوگانه توموری داشته باشد (شکل 5D).
در نتیجه، این مطالعه با استفاده از ترکیبی از غنی‌سازی سریع سلولی، توالی‌یابی تک سلولی و پروفایل متابولیک، تفاوت‌های ایمونومتابولومیک زیادی را بین تومورها و سلول‌های آسیت در بیماران HGSC نشان داد. این تجزیه و تحلیل جامع نشان داد که تفاوت‌هایی در جذب گلوکز و فعالیت میتوکندری بین سلول‌های T وجود دارد و MNA را به عنوان یک متابولیت تنظیم‌کننده ایمنی خودمختار غیر سلولی شناسایی کرد. این داده‌ها بر نحوه تأثیر TME بر متابولیسم سلول T در سرطان‌های انسانی تأثیر می‌گذارند. اگرچه رقابت مستقیم برای مواد مغذی بین سلول‌های T و سلول‌های سرطانی گزارش شده است، متابولیت‌ها همچنین می‌توانند به عنوان تنظیم‌کننده‌های غیرمستقیم برای پیشبرد پیشرفت تومور و احتمالاً سرکوب پاسخ‌های ایمنی درون‌زا عمل کنند. شرح بیشتر نقش عملکردی این متابولیت‌های تنظیم‌کننده ممکن است استراتژی‌های جایگزینی را برای تقویت پاسخ ایمنی ضد تومور ایجاد کند.
نمونه‌های بیمار و داده‌های بالینی از طریق مخزن بافت تومور سرطان بریتیش کلمبیا که توسط شبکه مخزن بافت کانادا تأیید شده است، به دست آمد. طبق پروتکل تأیید شده توسط کمیته اخلاق تحقیقات سرطان بریتیش کلمبیا و دانشگاه بریتیش کلمبیا (H07-00463)، تمام نمونه‌ها و داده‌های بالینی بیماران رضایت کتبی آگاهانه دریافت کرده یا رسماً از رضایت خود صرف نظر کرده‌اند. نمونه‌ها در BioBank تأیید شده (BRC-00290) ذخیره می‌شوند. مشخصات دقیق بیمار در جداول S1 و S5 نشان داده شده است. برای انجماد، از یک چاقوی جراحی برای تجزیه مکانیکی نمونه تومور بیمار استفاده می‌شود و سپس آن را از طریق یک فیلتر 100 میکرونی عبور می‌دهند تا یک سوسپانسیون سلولی واحد به دست آید. مایع آسیت بیمار به مدت 10 دقیقه با سرعت 1500 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا سلول‌ها رسوب کرده و مایع رویی حذف شود. سلول‌های به‌دست‌آمده از تومور و آسیت در سرم AB انسانی غیرفعال‌شده با حرارت ۵۰٪ (سیگما-آلدریچ)، ۴۰٪ RPMI-1640 (ترمو فیشر ساینتیفیک) و ۱۰٪ دی‌متیل سولفوکسید منجمد شدند. این سوسپانسیون‌های تک‌سلولی حفظ‌شده، ذوب شده و برای متابولومیکس و تعیین متابولیت که در زیر توضیح داده شده است، استفاده شدند.
محیط کشت کامل شامل RPMI 1640 فیلتر شده با نسبت ۵۰:۵۰ به همراه ۰.۲۲ میکرومتر AimV. RPMI 1640 + ۲.۰۵ میلی‌مولار ال-گلوتامین (Thermo Fisher Scientific) به همراه ۱۰٪ سرم AB انسانی غیرفعال شده با حرارت (Sigma-Aldrich)، ۱۲.۵ میلی‌مولار Hepes (Thermo Fisher Scientific)، ۲ میلی‌مولار ال-گلوتامین (Thermo Fisher Scientific)، ۱ × محلول پنی‌سیلین استرپتومایسین (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) و ۵۰ میکرومگابایت مرکاپتواتانول است. AimV (Invitrogen) به همراه ۲۰ میلی‌مولار Hepes (Thermo Fisher Scientific) و ۲ میلی‌مولار ال-گلوتامین (Thermo Fisher Scientific) ارائه می‌شود. بافر رنگ‌آمیزی فلوسایتومتر شامل 0.22 میکرومولار محلول نمکی بافر فسفات فیلتر شده (PBS؛ Invitrogen) به همراه 3٪ سرم AB انسانی غیرفعال شده با حرارت (سیگما) بود. بافر غنی‌سازی سلولی شامل 0.22 میکرومولار PBS فیلتر شده و 0.5٪ سرم AB انسانی غیرفعال شده با حرارت (سیگما-آلدریچ) بود.
در محیط کشت کامل ۳۷ درجه سانتی‌گراد، سلول‌ها به مدت ۳۰ دقیقه با ۱۰ نانومولار MT DR و ۱۰۰ میکرومولار ۲-NBDG رنگ‌آمیزی شدند. سپس، سلول‌ها به مدت ۱۵ دقیقه با رنگ زنده eF506 در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد رنگ‌آمیزی شدند. سلول‌ها را در FC Block (eBioscience) و Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) دوباره به حالت تعلیق درآورید، در بافر رنگ‌آمیزی فلوسایتومتر (طبق دستورالعمل سازنده) رقیق کنید و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. سلول‌ها را با مجموعه‌ای از آنتی‌بادی‌ها (جدول S2) در بافر رنگ‌آمیزی فلوسایتومتری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ دقیقه رنگ‌آمیزی کنید. قبل از تجزیه و تحلیل، سلول‌ها را در بافر رنگ‌آمیزی فلوسایتومتری (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R) دوباره به حالت تعلیق درآورید. از SpectroFlo و FlowJo V10 برای تجزیه و تحلیل داده‌های شمارش سلولی و از GraphPad Prism 8 برای ایجاد داده‌ها استفاده کنید. شدت فلورسانس میانه (MFI) مربوط به 2-NBDG و MT DR به صورت لگاریتمی نرمال‌سازی شد و سپس از آزمون t زوجی برای تجزیه و تحلیل آماری جهت در نظر گرفتن بیماران منطبق استفاده شد. تمام جمعیت‌های دارای کمتر از 40 رویداد را از تجزیه و تحلیل حذف کنید؛ قبل از انجام تجزیه و تحلیل آماری و تجسم داده‌ها، مقدار MFI را برای هر مقدار منفی 1 وارد کنید.
به منظور تکمیل استراتژی دروازه‌بندی دستی پنل فرآیند فوق، ما از حاشیه‌نویسی کامل توسط درخت محدودیت شکل (FAUST) (21) برای اختصاص خودکار سلول‌ها به جمعیت پس از حذف سلول‌های مرده در FlowJo استفاده کردیم. ما به صورت دستی خروجی را مدیریت می‌کنیم تا جمعیت‌هایی را که به نظر می‌رسد به اشتباه تخصیص داده شده‌اند (ترکیب سلول‌های توموری PD1+ با PD1-) و جمعیت‌های باقی‌مانده ادغام کنیم. هر نمونه به طور متوسط ​​​​شامل بیش از 2٪ سلول است که در مجموع 11 جمعیت می‌شود.
برای جداسازی PBMC از محصولات جداسازی لکوسیت (STEMCELL Technologies) از سانتریفیوژ چگالی گرادیان فایکول استفاده شد. سلول‌های T CD8+ با استفاده از CD8 MicroBeads (Miltenyi) از PBMC جدا شده و طبق دستورالعمل سازنده به مدت 2 هفته با استفاده از TransAct (Miltenyi) در محیط کشت کامل تکثیر شدند. سلول‌ها به مدت 5 روز در محیط کشت کامل حاوی IL-7 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ PeproTech) قرار گرفتند و سپس دوباره با TransAct تحریک شدند. در روز 7، طبق دستورالعمل سازنده، از CD45 MicroBeads انسانی (Miltenyi) برای غنی‌سازی سلول‌ها در سه دور متوالی استفاده شد. سلول‌ها برای آنالیز فلوسایتومتری (مطابق توضیحات بالا) جدا شدند و یک میلیون سلول سه بار برای آنالیز LC-MS/MS جدا شدند. نمونه‌ها طبق توضیحات زیر توسط LC-MS/MS پردازش شدند. ما مقدار متابولیت گمشده را با عدد یونی 1000 تخمین زدیم. هر نمونه بر اساس عدد یونی کل (TIC) نرمال‌سازی شده، به صورت لگاریتمی تبدیل شده و قبل از تجزیه و تحلیل، به طور خودکار در MetaboAnalystR نرمال‌سازی می‌شود.
سوسپانسیون تک سلولی هر بیمار ذوب و از طریق یک فیلتر ۴۰ میکرومتری به محیط کشت کامل (مطابق توضیحات بالا) فیلتر شد. طبق پروتکل سازنده، سه دور متوالی انتخاب مثبت با جداسازی مهره مغناطیسی با استفاده از MicroBeads (Miltenyi) برای غنی‌سازی نمونه‌ها برای سلول‌های CD8+، CD4+ و CD45- (روی یخ) استفاده شد. به طور خلاصه، سلول‌ها در بافر غنی‌سازی سلولی (مطابق توضیحات بالا) دوباره به حالت تعلیق درآمده و شمارش می‌شوند. سلول‌ها به مدت ۱۵ دقیقه با مهره‌های CD8 انسانی، مهره‌های CD4 انسانی یا مهره‌های CD45 انسانی (Miltenyi) در دمای ۴ درجه سانتیگراد انکوبه شدند و سپس با بافر غنی‌سازی سلولی شسته شدند. نمونه از ستون LS (Miltenyi) عبور داده می‌شود و بخش‌های مثبت و منفی جمع‌آوری می‌شوند. به منظور کاهش مدت زمان و به حداکثر رساندن مرحله بازیابی سلول، بخش CD8 سپس برای دور دوم غنی‌سازی CD4+ و بخش CD4 برای غنی‌سازی بعدی CD45 استفاده می‌شود. محلول را در طول فرآیند جداسازی روی یخ نگه دارید.
برای آماده‌سازی نمونه‌ها برای آنالیز متابولیت‌ها، سلول‌ها یک بار با محلول نمک سرد یخ شسته شدند و 1 میلی‌لیتر متانول 80٪ به هر نمونه اضافه شد، سپس ورتکس شده و در نیتروژن مایع منجمد شدند. نمونه‌ها تحت سه چرخه انجماد-ذوب قرار گرفتند و به مدت 15 دقیقه با سرعت 14000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. محلول رویی حاوی متابولیت‌ها تا زمان خشک شدن تبخیر می‌شود. متابولیت‌ها دوباره در 50 میکرولیتر اسید فرمیک 0.03٪ حل شدند، ورتکس شدند تا مخلوط شوند و سپس برای حذف بقایای سلولی سانتریفیوژ شدند.
متابولیت‌ها را همانطور که در بالا توضیح داده شد، استخراج کنید. مایع رویی را برای تحقیقات متابولومیکس به یک بطری کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا منتقل کنید. برای جلوگیری از اثرات دسته‌ای، از یک پروتکل درمانی تصادفی برای تیمار هر نمونه با تعداد مشابهی از سلول‌ها استفاده کنید. ما یک ارزیابی کیفی از متابولیت‌های جهانی که قبلاً در طیف‌سنج جرمی چهارقطبی سه‌گانه AB SCIEX QTRAP 5500 (50) منتشر شده بود، انجام دادیم. تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی و ادغام ناحیه پیک با استفاده از نرم‌افزار MultiQuant نسخه 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) انجام شد.
برای تخمین مقدار متابولیت از دست رفته، از تعداد یون ۱۰۰۰ استفاده شد و از TIC هر نمونه برای محاسبه مساحت پیک نرمال شده هر متابولیت شناسایی شده جهت اصلاح تغییرات ایجاد شده توسط آنالیز ابزاری از پردازش نمونه استفاده شد. پس از نرمال شدن TIC، از MetaboAnalystR(51) (پارامتر پیش‌فرض) برای تبدیل لگاریتمی و مقیاس‌بندی خودکار خط هنجار استفاده می‌شود. ما از PCA با بسته vegan R برای انجام آنالیز اکتشافی تفاوت‌های متابولوم بین انواع نمونه‌ها استفاده کردیم و از آنالیز افزونگی جزئی برای تجزیه و تحلیل بیماران استفاده کردیم. از روش Ward برای ساخت دندروگرام نقشه حرارتی برای خوشه‌بندی فاصله اقلیدسی بین نمونه‌ها استفاده کردیم. ما از limma (52) روی فراوانی متابولیت استاندارد شده برای شناسایی متابولیت‌های با فراوانی متفاوت در کل نوع سلول و ریزمحیط استفاده کردیم. به منظور ساده‌سازی توضیح، از پارامتر میانگین گروه برای مشخص کردن مدل استفاده می‌کنیم و انواع سلول‌ها را در ریزمحیط به عنوان هر گروه (n = 6 گروه) در نظر می‌گیریم. برای آزمون معناداری، ما سه اندازه‌گیری مکرر برای هر متابولیت انجام دادیم. به منظور جلوگیری از تکرار کاذب، بیمار به عنوان یک مانع در طراحی لیما گنجانده شد. به منظور بررسی تفاوت در متابولیت‌ها بین بیماران مختلف، مدل لیما شامل بیماران را به صورت ثابت تنظیم کردیم. ما معناداری کنتراست از پیش تعیین‌شده بین نوع سلول و ریزمحیط Padj <0.05 (تصحیح بنجامینی-هاچبرگ) را گزارش می‌کنیم.
پس از غنی‌سازی قدرت با استفاده از کیت حذف سلول‌های مرده Miltenyi (با قابلیت حیات بیش از 80٪)، تعیین توالی ترانسکریپتوم تک سلولی بر روی کل نمونه‌های آسیت و تومور منجمد زنده با استفاده از پروتکل بیان ژن 10x 5' انجام شد. پنج مورد با تومورها و آسیت‌های منطبق مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند، اگرچه قابلیت حیات پایین از یک نمونه تومور مانع از ورود آن شد. به منظور دستیابی به انتخاب‌های متعدد از بیماران، نمونه‌های هر بیمار را در خطوط کنترل‌کننده کروم 10x ترکیب کردیم و محل‌های آسیت و تومور را جداگانه تجزیه و تحلیل کردیم. پس از تعیین توالی [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE)، Quebec genome;] با میانگین 73488 و 41378 خوانش در هر سلول به ترتیب برای تومور و آسیت، ما از CellSNP و Vireo (53) (بر اساس CellSNP به عنوان SNP مشترک انسانی (VCF) ارائه شده توسط GRCh38 که به عنوان یک هویت اهداکننده تعیین می‌شود) استفاده کردیم. ما از SNPRelate برای استنباط نزدیکترین هویت (IBS) وضعیت ژنوتیپ بیمار (IBS) استفاده می‌کنیم، سلول‌های اختصاص داده نشده و سلول‌های شناسایی شده به عنوان دوبلکس و اهداکنندگان تطبیق یافته بین نمونه‌های آسیت و تومور (54) را حذف می‌کنیم. بر اساس این کار، ما سه مورد با نمایش سلولی فراوان در تومور و آسیت را برای تجزیه و تحلیل پایین‌دست حفظ کردیم. پس از انجام یک مرحله فیلتراسیون انبوه در بسته‌بندی Scatter (55) و Scran (56) BioConductor، این امر منجر به 6975 سلول (به ترتیب 2792 و 4183 سلول از تومور و آسیت) برای تجزیه و تحلیل شد. ما از خوشه‌بندی Louvain igraph (57) از شبکه نزدیکترین همسایه مشترک (SNN) مبتنی بر روی فاصله جاکارد تا سلول‌های خوشه‌ای بر اساس بیان. خوشه‌ها به صورت دستی بر اساس بیان ژن نشانگر به انواع سلول‌های فرضی حاشیه‌نویسی و با t-SNE تجسم شدند. سلول‌های T سیتوتوکسیک با بیان CD8A و GZMA تعریف می‌شوند، به استثنای زیرخوشه‌هایی با بیان پروتئین ریبوزومی کم. ما به داده‌های منتشر شده ایزار و همکاران (16)، از جمله جاسازی t-SNE آنها، دسترسی پیدا کردیم که می‌تواند همپوشانی بیان بین نشانگرهای سلول‌های ایمنی و بیان NNMT را کنترل کند.
سلول‌های تک هسته ای خون محیطی (PBMC) با استفاده از سانتریفیوژ گرادیان چگالی فایکول از محصولات جداسازی لکوسیت (STEMCELL Technologies) جدا شدند. سلول‌های CD3+ با استفاده از دانه‌های CD3 (Miltenyi) از PBMC جدا شدند. در حضور یا عدم حضور MNA، سلول‌های CD3+ با CD3 متصل به صفحه (5 میکروگرم در میلی‌لیتر)، CD28 محلول (3 میکروگرم در میلی‌لیتر) و IL-2 (300 واحد در میلی‌لیتر؛ پرولوکین) فعال شدند. در آخرین روز تکثیر، زیستایی (Fixable Viability Dye eFluor450، eBioscience) و تکثیر (123count eBeads، Thermo Fisher Scientific) با استفاده از فلوسایتومتری ارزیابی شدند. عملکرد مؤثر را با تحریک سلول‌ها با PMA (20 نانوگرم در میلی‌لیتر) و یونومایسین (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) با GolgiStop به مدت 4 ساعت ارزیابی کنید و CD8-PerCP (RPA-T8، BioLegend)، CD4-AF700 (RPA-T4)، BioLegend) و TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11، BD) را پایش کنید. سلول‌های qPCR و ChIP را با PMA (20 نانوگرم در میلی‌لیتر) و یونومایسین (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 4 ساعت تحریک کنید. مایع رویی ELISA قبل و بعد از تحریک با PMA (20 نانوگرم در میلی‌لیتر) و یونومایسین (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 4 ساعت جمع‌آوری شد.
برای جداسازی RNA با استفاده از کیت RNeasy Plus Mini (QIAGEN) از پروتکل سازنده پیروی کنید. از QIAshredder (QIAGEN) برای همگن کردن نمونه استفاده کنید. از کیت تبدیل RNA به cDNA با ظرفیت بالا (Thermo Fisher Scientific) برای سنتز DNA مکمل (cDNA) استفاده کنید. از TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) برای تعیین کمیت بیان ژن (طبق پروتکل سازنده) با پروب‌های زیر استفاده کنید: Hs00196287_m1 (NNMT)، Hs00154079_m1 (AOX1)، Hs00427552_m1 (SLC22A1)، Hs02786624_g1 [گلیسرآلدئید-3-فسفات هیدروژنی (GAPDH)] و Hs01010726_m1 (SLC22A2). نمونه‌ها روی سیستم PCR زمان واقعی StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) در پلیت واکنش نوری ۹۶ چاهکی سریع MicroAmp (Applied Biosystems) با فیلم نوری MicroAmp اجرا شدند. هر مقدار Ct که از ۳۵ بیشتر باشد، بالاتر از آستانه تشخیص در نظر گرفته می‌شود و به عنوان غیرقابل تشخیص علامت‌گذاری می‌شود.
ChIP را همانطور که قبلاً توضیح داده شد (58) انجام دهید. به طور خلاصه، سلول‌ها با فرمالدئید (غلظت نهایی 1.42٪) تیمار شدند و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. از بافر تورم غنی‌شده (25 میلی‌مولار Hepes، 1.5 میلی‌مولار MgCl2، 10 میلی‌مولار KCl و 0.1٪ NP-40) به مدت 10 دقیقه روی یخ استفاده کنید، سپس همانطور که توضیح داده شد (58) دوباره در بافر ایمونوپرسیپیتاسیون به حالت تعلیق درآورید. سپس نمونه با چرخه‌های زیر سونیکیت شد: 10 چرخه (20 پالس 1 ثانیه‌ای) و زمان استاتیک 40 ثانیه. آنتی‌بادی‌های ChIP-grade Ioglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl)، Histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl)، NFAT (Invitrogen; 3μl) و SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) را با نمونه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید و یک شب تکان دهید. دانه‌های پروتئین A (Thermo Fisher Scientific) را به همراه نمونه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با تکان دادن ملایم به مدت ۱ ساعت انکوبه کنید، سپس از دانه‌های چلکس (Bio-Rad) برای غنی‌سازی DNA استفاده کنید و از پروتئیناز K (Thermo Fisher) برای هضم پروتئین استفاده کنید. پروموتر TNFα با PCR شناسایی شد: به جلو، GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ برعکس، GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (محصول ۲۰۷ جفت بازی). تصاویر توسط Image Lab (Bio-Rad) تولید و با استفاده از نرم‌افزار ImageJ تعیین مقدار شدند.
مایع رویی کشت سلولی طبق روش ذکر شده در بالا جمع‌آوری شد. تعیین مقدار طبق رویه‌های سازنده کیت الایزای TNFα انسانی (Invitrogen)، کیت الایزای IL-2 انسانی (Invitrogen) و کیت الایزای IFN-γ انسانی (Abcam) انجام شد. طبق پروتکل سازنده، مایع رویی برای تشخیص TNFα و IL-2 به نسبت ۱:۱۰۰ و برای تشخیص IFN-γ به نسبت ۱:۳ رقیق شد. برای اندازه‌گیری جذب در طول موج ۴۵۰ نانومتر از EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) استفاده کنید.
سلول‌های PBMC با استفاده از سانتریفیوژ گرادیان چگالی فایکول از محصولات جداسازی لکوسیت (STEMCELL Technologies) جدا شدند. سلول‌های CD3+ با استفاده از مهره‌های CD3 (Miltenyi) از PBMC جدا شدند. در حضور یا عدم حضور MNA، سلول‌های CD3+ با CD3 متصل به صفحه (5 میکروگرم در میلی‌لیتر)، CD28 محلول (3 میکروگرم در میلی‌لیتر) و IL-2 (300 واحد در میلی‌لیتر؛ پرولوکین) به مدت 3 روز فعال شدند. پس از 3 روز، سلول‌ها جمع‌آوری و با محلول نمکی 0.9٪ شسته شدند و رسوب منجمد شد. شمارش سلولی با استفاده از فلوسیتومتری (Cytek Aurora؛ پیکربندی 3L-16V-14B-8R) با استفاده از مهره‌های الکترونیکی 123 عددی انجام شد.
متابولیت‌ها را همانطور که در بالا توضیح داده شد، استخراج کنید. عصاره خشک شده با غلظت ۴۰۰۰ معادل سلولی در هر میکرولیتر بازسازی شد. نمونه را با کروماتوگرافی فاز معکوس (۱۲۹۰ Infinity II، Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا) و ستون CORTECS T3 (۲.۱×۱۵۰ میلی‌متر، اندازه ذرات ۱.۶ میکرومتر، اندازه منافذ ۱۲۰ آنگستروم؛ #۱۸۶۰۰۸۵۰۰، واترز) تجزیه و تحلیل کنید. طیف‌سنج جرمی قطبی (۶۴۷۰، Agilent)، که در آن یونیزاسیون الکترواسپری در حالت مثبت عمل می‌کند. فاز متحرک A، ۰.۱٪ اسید فرمیک (در H2O) است، فاز متحرک B، ۹۰٪ استونیتریل، ۰.۱٪ اسید فرمیک است. شیب LC برای A 100%، 0 تا 2 دقیقه، برای B 99%، 2 تا 7.1 دقیقه و برای B 99%، 7.1 تا 8 دقیقه است. سپس ستون را با فاز متحرک A با سرعت جریان 0.6 میلی‌لیتر در دقیقه به مدت 3 دقیقه دوباره به تعادل برسانید. سرعت جریان 0.4 میلی‌لیتر در دقیقه است و محفظه ستون تا 50 درجه سانتیگراد گرم می‌شود. از استاندارد شیمیایی خالص MNA (M320995، شرکت تحقیقات شیمیایی تورنتو، نورث یورک، انتاریو، کانادا) برای تعیین زمان بازداری (RT) و تبدیل (RT = 0.882 دقیقه، تبدیل 1 = 137→94.1، تبدیل 2 = 137→92، تبدیل 3 = 137→78) استفاده کنید. هنگامی که هر سه انتقال در زمان بازداری صحیح رخ می‌دهند، از انتقال 1 برای تعیین مقدار و اطمینان از اختصاصی بودن استفاده می‌شود. منحنی استاندارد MNA (شرکت تحقیقات شیمیایی تورنتو) با شش رقت سریالی از محلول مادر (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) برای بدست آوردن استانداردهای 0.1، 1.0، 10 و 100 نانوگرم در میلی‌لیتر و 1.0 و 10 میکروگرم در میلی‌لیتر به ترتیب مایع تولید شد. حد تشخیص 1 نانوگرم در میلی‌لیتر است و پاسخ خطی بین 10 نانوگرم در میلی‌لیتر و 10 میکروگرم در میلی‌لیتر است. هر تزریق دو میکرولیتر از نمونه و استاندارد برای آنالیز LC/MS استفاده می‌شود و هر هشت تزریق یک نمونه کنترل کیفیت مخلوط برای اطمینان از پایداری پلتفرم آنالیز انجام می‌شود. پاسخ‌های MNA تمام نمونه‌های سلولی تیمار شده با MNA در محدوده خطی سنجش بود. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار تجزیه و تحلیل کمی MassHunter (نسخه 9.0، Agilent) انجام شد.
ساختار αFR-CAR نسل دوم از Song و همکارانش (59) گرفته شده است. به طور خلاصه، این ساختار شامل محتویات زیر است: توالی رهبر CD8a، قطعه متغیر تک زنجیره‌ای اختصاصی αFR انسانی، ناحیه لولا و غشایی CD8a، دامنه درون سلولی CD27 و دامنه درون سلولی CD3z. توالی کامل CAR توسط GenScript سنتز شد و سپس در وکتور بیان لنتی‌ویروسی نسل دوم در بالادست کاست بیان GFP که برای ارزیابی کارایی انتقال استفاده می‌شود، کلون شد.
لنتی ویروس با ترانسفکشن سلول‌های HEK293T [مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC)] تولید می‌شود؛ این سلول‌ها در محیط کشت اصلاح‌شده Dulbecco's modified Eagle حاوی 10٪ سرم جنین گاوی (FBS) و 1٪ PenStrep رشد داده شده‌اند و از ناقل CAR-GFP استفاده شده است و پلاسمیدهای بسته‌بندی (psPAX2 و pMD2.G، Addgene) از لیپوفکشن آمین (سیگما-آلدریچ) استفاده می‌کنند. مایع رویی حاوی ویروس 48 و 72 ساعت پس از ترانسفکشن جمع‌آوری، فیلتر و با اولتراسانتریفیوژ تغلیظ شد. مایع رویی ویروسی تغلیظ شده تا زمان ترانسفکشن در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شود.
سلول‌های تک هسته ای خون محیطی (PBMC) با استفاده از سانتریفیوژ گرادیان چگالی فایکول از محصولات جداسازی لکوسیت اهداکننده سالم (STEMCELL Technologies) جدا می‌شوند. از ریزدانه‌های CD8 با انتخاب مثبت (Miltenyi) برای جداسازی سلول‌های CD8+ از PBMC استفاده کنید. سلول‌های T را با TransAct (Miltenyi) و در محیط TexMACS [Miltenyi؛ غنی شده با 3٪ سرم انسانی غیرفعال شده با حرارت، 1٪ PenStrep و IL-2 (300 واحد در میلی‌لیتر)] تحریک کنید. بیست و چهار ساعت پس از تحریک، سلول‌های T با لنتی ویروس (10 میکرولیتر مایع رویی ویروس غلیظ به ازای هر 106 سلول) ترانسداکت شدند. 1 تا 3 روز پس از ترانسداکشن روی Cytek Aurora (روی FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter)، Singlet، GFP+)، بیان GFP سلول‌ها را ارزیابی کنید تا راندمان ترانسداکشن حداقل 30٪ را نشان دهید.
سلول‌های CAR-T به مدت 24 ساعت در Immunocult (STEMCELL Technologies؛ غنی‌شده با 1٪ PenStrep) تحت شرایط زیر کشت داده شدند: تیمار نشده، تیمار شده با 250 میکرومولار آدنوزین یا 10 میلی‌مولار MNA. پس از پیش‌تیمار، سلول‌های CAR-T با PBS شسته شده و با 20000 سلول SK-OV-3 [ATCC؛ در محیط کشت McCoy 5A (سیگما-آلدریچ) غنی‌شده با 10٪ FBS و 1٪ PenStrep در 10 ترکیب شدند: نسبت مؤثر به هدف 1 در محیط کشت Immunocult غنی‌شده به صورت سه‌تایی تکثیر شد. سلول‌های SK-OV-3 و سلول‌های SK-OV-3 لیز شده با ساپونین دیژیتال (0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر؛ سیگما-آلدریچ) به ترتیب به عنوان کنترل منفی و مثبت استفاده شدند. پس از 24 ساعت کشت همزمان، مایع رویی جمع‌آوری و لاکتات دهیدروژناز (LDH) طبق دستورالعمل سازنده (کیت سنجش سمیت سلولی LDH Glo، Promega) اندازه‌گیری شد. مایع رویی LDH به نسبت 1:50 در بافر LDH رقیق شد. درصد کشتن با استفاده از فرمول زیر اندازه‌گیری شد: درصد کشتن = درصد اصلاح / حداکثر میزان کشتن × 100٪، که در آن درصد اصلاح = کشت همزمان - فقط سلول‌های T، و حداکثر میزان کشتن = کنترل مثبت - کنترل منفی.
همانطور که در متن یا مواد و روش‌ها توضیح داده شده است، برای تجزیه و تحلیل آماری از GraphPad Prism 8، Microsoft Excel یا R نسخه 3.6.0 استفاده کنید. اگر چندین نمونه از یک بیمار جمع‌آوری شود (مانند آسیت و تومور)، از آزمون t زوجی استفاده می‌کنیم یا بیمار را به عنوان یک اثر تصادفی در یک مدل خطی یا تعمیم‌یافته در صورت لزوم لحاظ می‌کنیم. برای تجزیه و تحلیل متابولومیکس، آزمون اهمیت به صورت سه‌گانه انجام می‌شود.
برای مطالب تکمیلی این مقاله، لطفاً به http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 مراجعه کنید.
این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution-Non-Commercial توزیع شده است، که استفاده، توزیع و تکثیر در هر رسانه‌ای را مجاز می‌داند، مادامی که استفاده نهایی برای سود تجاری نباشد و فرض بر این باشد که اثر اصلی صحیح است. مرجع.
توجه: ما فقط از شما می‌خواهیم آدرس ایمیل خود را ارائه دهید تا شخصی که به صفحه توصیه می‌کنید بداند که می‌خواهید ایمیل را ببیند و اینکه هرزنامه نیست. ما هیچ آدرس ایمیلی را ثبت نخواهیم کرد.
این سوال برای بررسی اینکه آیا شما بازدیدکننده هستید یا خیر و جلوگیری از ارسال خودکار هرزنامه استفاده می‌شود.
ماریسا کی. کیلگور (ماریسا کی. کیلگور)، سارا مک فرسون (سارا مک فرسون)، لورن جی. زاخاریاس (لورن جی. زاخاریاس)، ابیگیل الی آریس جی. دی براردینیس)، راسل جی. جونز (راسل جی. جونز)، فینیاس تی. همیلتون (فیناس تی.
MNA در سرکوب ایمنی سلول‌های T نقش دارد و یک هدف بالقوه برای ایمونوتراپی در درمان سرطان انسان است.
ماریسا کی. کیلگور (ماریسا کی. کیلگور)، سارا مک فرسون (سارا مک فرسون)، لورن جی. زاخاریاس (لورن جی. زاخاریاس)، ابیگیل الی آریس جی. دی براردینیس)، راسل جی. جونز (راسل جی. جونز)، فینیاس تی. همیلتون (فیناس تی.
MNA در سرکوب ایمنی سلول‌های T نقش دارد و یک هدف بالقوه برای ایمونوتراپی در درمان سرطان انسان است.
©2021 انجمن آمریکایی برای پیشرفت علم. تمامی حقوق محفوظ است AAAS شریک HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER است. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.